DHAV-3 VP1蛋白优势抗原区的初步鉴定

为了研究鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)VP1蛋白的优势抗原区,试验根据DHAV-3 VP1基因序列设计4对特异性表达引物,用PCR获得VP1-a~d基因片段,并在p ET-30a(+)/Rosetta(DE3)p LysS系统中进行原核表达;经IPTG诱导重组蛋白获得表达,用Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白;同时以DHAV-3病毒为免疫原制备鼠抗DHAV-3多克隆抗体,通过I-ELISA和Westernblot初步鉴定。结果表明:p ET-30a-VP1-a、p ET-30a-VP1-b、p ET-30a-VP1-c和p ET-30a-VP1-d与鼠抗DHAV-3多克隆抗体都发生反应,抗原量相同的情况下VP1-c和VP1-d段显色较VP1-a和VP1-b深,说明这两段反应性相对较强;4种截短蛋白与鸭抗DHAV-3阳性血清进行反应,只有p ET-30a-VP1-c显色。说明VP1-c免疫原性较强,DHAV-3 VP1蛋白的90~175 aa为其优势抗原区。     

重组猪细小病毒VP2基因的猪伪狂犬病毒rPRV-VP2株的构建及纯化

参考GenBank中登录的猪细小病毒(PPV)(M38367.1)基因序列,设计1对可以扩增出约1.6kb PPV VP2基因片段的特异性引物,上、下游引物的5′端均引入BamHⅠ酶切位点,PCR扩增得到VP2目的片段后,连接到pMD18-T载体中得到重组质粒pMD-VP2。取本实验室构建的含绿色荧光蛋白标记基因的伪狂犬病毒(PRV)通用转移质粒pG和构建好的pMD-VP2质粒,用BamHⅠ对质粒pG和pMD-VP2进行酶切,然后用CIAP对酶切产物进行去磷酸化处理,纯化回收后将VP2基因插入pG质粒中获得重组伪狂犬病毒转移质粒pGVP2。用脂质体转染法将PRV HB-98株全基因组与质粒pGVP2共转染ST细胞,得到携带有PPV VP2外源抗原基因和绿色荧光蛋白标记基因的重组伪狂犬病毒rPRV-VP2株。结合VP2基因PCR扩增和绿色荧光观察,经5轮病毒空斑纯化得到了纯化的重组病毒rPRV-VP2株。     

塞尼卡病毒VP1与VP3蛋白原核表达及蛋白纯化

利用原核表达系统表达塞尼卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)VP1与VP3蛋白,优化其诱导表达条件,并进行蛋白纯化研究。扩增SVV VP1与VP3目的基因,并分别将VP1、VP3克隆至pET32a(+)载体,构建pET32a-VP1与pET32a-VP3重组质粒,将两者分别转化至BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导表达。优化蛋白表达条件,利用His标签镍离子蛋白纯化柱纯化蛋白。RT-PCR结果显示可扩增出792 bp SVV VP1与717 bp VP3目的片段,将VP1与VP3目的基因成功克隆至pET32a(+)载体,分别转化至BL21(DE3),成功地表达50 000 pET32a-VP1重组蛋白以及48 000 pET32a-VP3重组蛋白;pET32a-VP1及pET32a-VP3重组蛋白均在条件为37℃、0.6 mmol/L诱导剂诱导5 h表达量最高,重组蛋白均以包涵体的形式进行表达并且可纯化出目的蛋白。结果表明,本试验成功地利用原核表达系统表达并纯化SVV VP1与VP3重组蛋白,为制备单克隆与多克隆抗体、检测试剂盒研发以及新型疫苗的研发奠定了基础。     

犬贾第鞭毛虫α-12贾第素基因的原核表达及纯化

为了原核表达、纯化犬贾第鞭毛虫α-12贾第素蛋白,试验经RT-PCR获得α-12贾第素基因片段,克隆至原核表达载体p ET-28a(+),构建重组原核表达质粒p ET-28a-α-12,再转化入E.coli Rosetta(DE3)后,用IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经SDS-PAGE和Western-blot分析验证,并用Ni琼脂糖凝胶纯化融合的α-12贾第素蛋白。结果表明:重组原核表达质粒p ET-28a-α-12经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为40 ku,且主要以包涵体形式存在;表达量约占菌体总蛋白的15.7%;纯化的重组蛋白纯度达90%以上。     

表达猪细小病毒VP2蛋白和猪IL-18重组伪狂犬病毒的构建

为了获得表达猪细小病毒(PPV)VP2蛋白和细胞因子猪白细胞介素-18(IL-18)的重组猪伪狂犬病毒(PRV)。将PPV VP2基因和猪IL-18基因分别插入到PRV转移质粒PG中,得到重组质粒PG18-VP2。利用脂质体转染法将重组转移质粒PG18-VP2与猪PRV弱毒株DNA共转染猪睾丸(ST)细胞,以EGFP荧光标记,通过5轮蚀斑筛选纯化,成功获得表达PPV VP2蛋白和猪IL-18且带EGFP标记的重组伪狂犬病毒IL18-VP2-rPRV。用重组病毒感染ST细胞,12h后在荧光显微镜下可见明亮的绿色荧光;通过RT-PCR证实感染细胞中含有PPV VP2和猪IL-18mRNA;Western-blot试验结果显示,重组病毒能表达具有生物活性的PPV VP2蛋白和猪IL-18。重组病毒经连续20次传代后感染细胞仍能发出绿色荧光,PCR检测表明VP2及IL-18基因在重组病毒中能稳定遗传。为进一步研究表达PPV VP2蛋白和猪IL-18的重组猪伪狂犬病毒的免疫效力奠定了基础。     

伪狂犬病病毒Bartha株gC膜外区部分基因的原核表达及纯化

构建伪狂犬病病毒(PRV)gC膜外区部分基因的重组质粒,原核表达并纯化目的蛋白.根据GenBank已发表的伪狂犬病病毒Bartha(PRV Ba)株gC基因的序列(NC EU719641),设计并合成了1对引物,以PRV Ba株为模板,PCR扩增出PRV gC膜外区部分基因片段;将该基因片段克隆到原核表达载体pET-28a上,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导,获得大小为35 ku的重组蛋白,命名为pET-gCN813.按照His-Bind纯化试剂盒说明书纯化表达产物,获得融合蛋白的纯化产物.     

O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与原核表达

根据已经公布的O型口蹄疫病毒VP1基因序列,设计合成了1对VP1基因特异性引物,应用RT-PCR技术从O型口蹄疫病毒标准毒株扩增得到VP1基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a中,构建了重组原核表达质粒pET-28a-VP1,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,O型口蹄疫病毒VP1基因在大肠埃希菌BL21中得到了正常表达,所表达的融和蛋白与标准O型口蹄疫病毒阳性血清具有特异性抗原/抗体反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性.     

轮状病毒VP4基因和VP7基因原核表达载体的构建及表达

经PCR从含有VP4基因、VP7基因片段的重组质粒pT-VP4和pT-VP7中护增VP4、VP7基因，连接至pGEM-5zf( )。经筛选和鉴定正确后同时酶切目的基因和表达质粒pET-28a( )，连接、转化受体菌，经PCR、酶切和序列分析证明，连接向位和阅读框架是正确的，从而构建了轮状病毒保护性抗原VP4基因、VP7基因片段的原核表达载体pET28a-VP4、pET28a-VP7。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下，用SDS-PAGE、薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明，表达的目的蛋白以包涵体的形式存在，蛋白的分子量分别为37.69和36.20ku，表达量占菌体总蛋白的比例分别为17.1%和14.4%。     

牛分枝杆菌FixB、HspX和MPB83基因的原核表达及鉴定

为了给原核表达牛分枝杆菌Fix B、Hsp X和MPB83基因并纯化Fix B、Hsp X和MPB83蛋白,进一步研究它们在牛结核病诊断中作为特异性抗原的诊断价值及应用奠定基础,试验用PCR方法从牛结核分枝杆菌AF2122/97基因组中扩增出Fix B、Hsp X和MPB83基因片段,构建p ET-28a-Fix B、p ET-28a-Hsp X和p ET-28a-MPB83重组质粒,克隆到DH5ɑ感受态细胞,提取测序正确的阳性重组质粒,转化BL21(DE3)感受态细胞,用1 mmol/L IPTG于37℃诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式,Western-blot分析鉴定并用Ni-NTA层析柱纯化蛋白。结果表明:成功扩增了大小依次约为957 bp、435 bp和663 bp的Fix B、Hsp X和MPB83基因,将其连接p ET-28a原核表达载体,原核表达的Fix B、Hsp X和MPB83重组蛋白均以包涵体形式存在,分子质量依次约为37 ku、21 ku和28 ku。经Western-blot鉴定表达产物为Fix B、Hsp X和MPB83重组蛋白,Ni-NTA成功洗脱出目的蛋白。说明试验成功构建了牛分枝杆菌Fix B、Hsp X和MPB83基因的原核表达载体,并纯化了Fix B、Hsp X和MPB83重组蛋白,可用于进一步的应用研究。     

猪细小病毒6型ORF2基因的截短表达及多克隆抗体制备

【目的】原核截短表达猪细小病毒6型(Porcine parvovirus type 6,PPV6)ORF2基因,并制备PPV6 VP1₍(348 aa-675 aa))蛋白多克隆抗体,为后续研究该蛋白的生物学功能提供材料。【方法】以PPV6分离毒株基因组为模板,PCR扩增获得ORF2截短基因片段,将其克隆至原核表达载体pET30a(+)中构建重组质粒pET30a-PPV6-ORF2。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化后重组蛋白。将纯化后的重组蛋白与弗氏佐剂混匀乳化,免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,采用Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)和间接ELISA鉴定免疫兔血清特异性。【结果】成功构建了pET30a-PPV6-ORF2重组表达载体,原核截短表达了PPV6 VP1₍(348 aa-675 aa))蛋白;SDS-PAGE结果显示,重组PPV6 VP1₍     

伪狂犬病毒SL株gL基因的克隆、原核表达、抗体制备及亚细胞定位

通过PCR从伪狂犬病毒(PRV)SL株基因组中扩增出gL基因,将产物亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,测序验证后将重组质粒转化至E.coli Rosseta,进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测显示诱导表达蛋白约33 000,同预期大小相符,通过Western blot检测可知重组蛋白具有较好的抗原性。使用Ni 2+-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白,纯化后的重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,经琼脂扩散试验测定,效价达1∶8。通过免疫荧光技术进行PRV gL亚细胞定位检测,结果显示最早可在感染后4h的细胞质中检测到特异性荧光,并随着PRV的复制gL表达增加。试验结果为进一步研究gL基因的功能和PRV的致病机理提供了重要依据。     

抗伪狂犬病病毒gC抗体制备及其gC蛋白表达

用纯化的重组蛋白His-gCN813制备抗PRV-gC抗体,并分析伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）gC蛋白在真核细胞的表达情况。本研究以提取的病毒基因组为模板,PCR克隆PRV gC全长基因,构建gC真核表达质粒p3xFLAG-gC,在真核细胞中表达gC基因;纯化蛋白His-gCN813制备的抗体,Western blotting和间接免疫荧光（IFA）检测到p3xFLAG-gC转染真核细胞和PRV感染细胞中的gC蛋白。结果表明本试验成功构建了PRV gC基因真核表达系统,获得了特异性抗PRV gC抗体,重组gC真核表达质粒p3xFLAG-gC转染Vero细胞,表达的重组蛋白gC为72 ku,PRV感染Vero细胞,表达的gC蛋白为55、72和94 ku,主要定位在细胞浆,gC蛋白可以作为PRV感染的指示分子,为下一步研究PRV和宿主相互作用及PRV的复制奠定了基础。     

猪伪狂犬病病毒EP0蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

为了对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)EP0蛋白进行原核表达并制备其多克隆抗体,试验以PRV HeN1毒株为模板,构建了EP0基因原核重组质粒pET28a-EP0,经测序鉴定后,将pET28a-EP0重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中以表达重组蛋白His-EP0;确认重组蛋白His-EP0表达后,用Ni-NTA柱纯化重组蛋白,并用纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,进行Western-blot测定,用间接ELISA法测定多克隆抗体效价,用间接免疫荧光法测定多克隆抗体的特异性。结果表明：EP0蛋白原核表达成功,His-EP0蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中以可溶性蛋白形式表达,大小在55～70 ku之间;EP0蛋白多克隆抗体制备成功,抗体效价在1∶160 000以上,且能与表达的重组蛋白His-EP0及PRV感染的细胞发生特异性反应。说明试验成功表达了EP0蛋白,并成功制备了EP0蛋白多克隆抗体,抗体效价可达到1∶160 000以上,且特异性较好。     

鸡源性HMGB1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

从鸡胚原代细胞CEF中扩增出鸡HMGB1基因,构建重组原核表达质粒p ET-28a-ch HMGB1,并将p ET-28a-ch HMGB1转入大肠杆菌BL21(DE3)中,于37℃进行诱导表达,经SDS-PAGE分析表明该重组蛋白可以在大肠杆菌中高效表达且以可溶性蛋白的形式存在。蛋白通过Ni-NAT纯化树脂亲和纯化,并作为免疫原制备鼠抗ch HMGB1多克隆抗体血清。该多克隆抗体同时具有ELISA、Western blot和IFA效价,且特异性识别禽源细胞内HMGB1蛋白。     

25型蓝舌病病毒VP2蛋白的原核表达及鉴定

为获得体外表达的25型蓝舌病病毒(BTV)VP2蛋白,本研究以NCBI上发表的25型BTV L2基因序列为模版,设计3对引物,PCR扩增3段部分重叠基因。将3段基因克隆到原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组质粒。以1.0 mmol/L的IPTG诱导含有阳性质粒的重组菌p ET-28a(+)-VP2-A/BL21、p ET-28a(+)-VP2-B/BL21、p ET-28a(+)-VP2-C/BL21进行表达,获得3段VP2蛋白,分别命名为VP2-A、VP2-B、VP2-C。经SDS-PAGE鉴定结果表明,重组蛋白以包涵体形式表达,大小依次为50 ku、48 ku、48 ku,与预期蛋白大小一致。经Western blot分析,VP2-A、VP2-B、VP2-C与His-Tag单抗发生特异性结合,证明其具有较好的反应原性。25型蓝舌病病毒VP2蛋白的分段表达为VP2蛋白的功能研究和制备蓝舌病的诊断试剂奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒VP1嵌合基因的构建及原核表达

首先合成我国O型口蹄疫病毒2个疫苗毒株VP1基因的3个抗原袁位，与另外扩增的流行毒株VP1基因末端273bp片段相连,构建出O型VP1嵌合基因片段（VP1O）。然后，将VPIO基因连接到原核表达载体pET28a上，构建了重组表达质粒pET28a-VP1O，转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达。SDS-PAGE电泳表明。VP1O基因在大肠杆菌中获得表达。Western blotting检测证实表达的VP1O蛋白具有良好的生物学活性。对表达蛋白通过包涵体洗涤的方法进行初步纯化，获得了较高纯度的VP1O蛋白。     

犬瘟热病毒N基因原核表达及多克隆抗体的制备

采用PCR方法扩增犬瘟热病毒N基因,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建犬瘟热N基因原核表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达重组N蛋白。从包涵体中纯化重组蛋白,制备多克隆抗体,采用Western blot检测其特异性。结果显示PCR扩增得到犬瘟热N基因,重组N蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到表达,制备的多克隆抗体能与N蛋白特异性反应。     

猪伪狂犬病毒野毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为建立一种敏感、特异、高通量的猪伪狂犬病毒(PRV)野毒抗体血清学检测方法,本研究利用原核表达技术表达了猪伪狂犬病毒gE蛋白,以纯化的重组gE蛋白为包被抗原建立了检测猪伪狂犬病毒野毒抗体的间接ELISA方法。参照已发表的PRV基因组gE基因序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增了长约606 bp的gE基因片段,将目的片段亚克隆至pET30a原核表达载体中,经IPTG诱导重组gE蛋白的表达,重组蛋白纯化后,免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测伪狂犬病毒野毒抗体的间接ELISA方法,该方法检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、PRV疫苗毒的阳性血清均为阴性;该方法批内与批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%;该方法与IDEXX gE-ELISA抗体检测试剂盒的符合率为96.2%。本研究建立的gE-ELISA检测方法为PRV野毒抗体检测以及野毒感染的快速诊断与流行病学调查等提供了一种简便、快速、高通量的血清学检测方法。     

A群猪轮状病毒G5型OSU株VP7基因的克隆及其重组杆状病毒的鉴定

利用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增出A群猪轮状病毒（PRV）G5型OSU株长度约为1．0kb的基因片段，将其克隆到pMD18-T载体上进行测序鉴定，证明为该PRV的VP7蛋白基因，与已发表的该PRV，VP7基因序列的同源性为99．8％，将该基因黏端克隆至表达载体PblusBAChis C质粒中，酶切及PCR鉴定表明获得了PRV－VP7蛋白基因与PblueBAChisC质粒的阳性重组子，纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA分子Bac-N-Blue共转染昆虫细胞sf9,5d后收获重组病毒，通过对重组杆状病毒DNA分子的酶切及PCR鉴定，确定PRV－VP7基因已正确投入，将经3次蚀斑筛选纯化后的该重组杆状病毒接种于sf9细胞大量增殖后，获得了重组杆状病毒PRV－VP7蛋白的真核表达。