PlnF抗菌肽在乳酸乳球菌中的分泌表达及抑菌活性鉴定

采用乳酸乳球菌表达载体对PlnF抗菌肽基因进行克隆表达,旨在使重组乳酸菌可以直接应用于食品的发酵和防腐之中。在乳酸乳球菌pNZ8149/NZ3900表达载体中,构建含有胞外表达信号肽的PlnF抗菌肽重组质粒,进一步在电阻200?Ω、电容25?μF条件下电转入NZ3900感受态内。经溴甲酚紫培养基筛选、菌落聚合酶链式反应验证、测序等鉴定正确的重组菌株,以1?ng/mL?Nisin诱导6?h后离心获得的上清液对金黄色葡萄球菌具有（14.03±0.23）mm的抑菌圈,经Tricine-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测到在5.8～7.8?kDa间出现一条与预期大小相近的条带,进一步通过纳升液相色谱-电喷雾-串联质谱验证表明PlnF蛋白在pNZ8149/NZ3900乳酸乳球菌表达载体中正确地进行了胞外表达。     

乳源血管紧张素转移酶抑制肽在乳酸乳球菌中的表达

在乳酸乳球菌中表达乳源血管紧张素转移酶抑制肽。选取了4种不同的来源于牛酪蛋白的血管紧张素转移酶(ACE)抑制肽,为了确保能够在人体消化液作用下正常发挥它们的ACE抑制活性,4种短肽以串联多肽(TP)的形式进行表达,并在各短肽单体间引入了人体内主要消化酶的酶切位点。根据TP的氨基酸序列和乳酸乳球菌的偏爱密码子,人工合成TP基因。然后将TP基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因串联于载体pSEC-E7,从而构建了pSEC-TP:GFP质粒,实现了2种蛋白在乳酸乳球菌中的共表达。经电击转化,将该重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中,获得重组菌株NZ9000(pSEC-TP:GFP)。用Nisin诱导TP:GFP蛋白表达。RT-PCR、激光共聚焦扫描显微镜和SDS-PAGE鉴定表达产物。RT-PCR结果表明,TP:GFP蛋白在RNA水平表达成功;SDS-PAGE表明目标产物是35 ku的条带。在乳酸乳球菌中实现了乳源血管紧张素转移酶抑制肽的表达。     

乳酸片球菌抑菌物质细菌素的分离纯化

将乳酸片球菌接种于MRS培养基,37℃静置培养17h后产生抑菌物质细菌素.用三步法从培养液中分离纯化细菌素:首先根据细菌素在pH6.0时与菌体的吸附力最强,pH2.0时吸附力最弱,通过调节pH和离心来收集细菌素,然后经过SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱层析和Sephadex G-50凝胶层析进行纯化,最后细菌素的得率为0.19%,比活为5.17×104AU/mg,纯化了34.54倍.得到的细菌素样品通过Tricine-SDS-PAGE电泳出现清晰条带,大小约为4600D.     

重组抗冻肽在乳酸乳球菌中表达及其抗冻活性研究

为了优化抗冻蛋白SF-P的重组表达,利用乳酸链球菌素Nisin对已构建的重组乳酸乳球菌进行表达。通过对诱导时间、诱导pH、诱导温度和诱导剂Nisin浓度等诱导表达条件进行优化,利用SDS-PAGE和Western blot确定最佳的表达条件;通过比较冷冻胁迫前后菌体的生长状况、发酵活力和细胞内钠钾离子含量的变化,研究重组菌在冷冻胁迫作用下的生理功能特性。结果表明:优化后的最佳表达条件为pH 7.0,诱导剂Nisin浓度15ng/mL,温度25℃,诱导时间6h;SF-P2诱导重组菌株可以显著改善乳酸菌由于经受冷冻胁迫导致的对数生长延滞期和稳定生长延滞期的增加,表现出较强的酸化活力,并且可以有效降低冷冻胁迫过程对乳酸菌细胞膜通透性的影响,起到保护细胞生理功能的作用,表明SF-P2诱导重组菌具有显著的抗冷冻胁迫保护作用。     

乳酸乳球菌乳亚种NCU036018细菌素的分离纯化及其抗菌机制

从自然发酵泡菜中筛选到1株对金黄色葡萄球菌具有抑制作用的乳酸菌,经16S rDNA和生理生化实验鉴定其为乳酸乳球菌乳亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis）并命名为NCU036018。NCU036018发酵上清液中的抑菌物质对胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、α-糜蛋白酶敏感,而对胃蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及过氧化氢酶不敏感,在pH 2.0～10.0、温度50～100℃的范围内分别保留了70%和90%以上的抑菌活性。随后通过硫酸铵盐析、超滤、阳离子交换层析对发酵上清液抑菌成分进行分离纯化,将得到的细菌素命名为乳球菌素036018,其分子质量在14.4～20 kDa之间,最小抑菌浓度为0.50 mg/mL。乳球菌素036018能有效降低金黄色葡萄球菌生物膜的形成率,损坏细胞表面形态、破坏细胞膜的通透性,从而抑制甚至杀死细胞。将乳球菌素036018添加至牛奶中,发现其具有显著抑制金黄色葡萄球菌生长的效果,具有良好的食品防腐保鲜的应用前景。     

乳酸片球菌素的抑菌方式

以单核细胞增多症李氏杆菌CVCC1595为指示菌,通过对乳酸片球菌素吸附率的研究,发现乳酸片球菌素的吸附受盐浓度、pH和细胞膜的成分影响显著.NaCl和磷酸盐浓度越高,吸附作用越小,在400mmol/LNaCl溶液中,乳酸片球菌素对菌体的吸附率为0;在pH 6.0吸附率最高(100%),pH 2.0和8.0的吸附率为24.4%,pH 10.0时乳酸片球菌素在菌体上无吸附.温度对吸附影响很小,在100℃时吸附率比室温时下降了1.56%;时间对吸附没有影响,乳酸片球菌素对指示菌的吸附作用应是由静电引力引起,其杀菌作用是使细胞膜形成孔洞,胞内物质外泄,从而导致细胞的死亡.     

乳酸片球菌素二级结构与抑菌活性的关系

通过圆二色光谱法对乳酸片球菌素的二级结构进行研究,发现乳酸片球菌素的α-螺旋含量约为6.8%,β-折叠含量约为20%,转角所占比例为20%。当乳酸片球菌素的α-螺旋含量增加,β-折叠、转角含量降低时,细菌素活性随之降低,在pH6.0的低盐溶液中,乳酸片球菌素的结构稳定,此时抑菌活性最高;在pH12.0或者高浓度的盐溶液中,乳酸片球菌素α-螺旋含量增加至58%,β-折叠结构消失,细菌素活性丧失。      

乳酸片球菌素二级结构与抑菌活性的关系

通过圆二色光谱法对乳酸片球菌素的二级结构进行研究,发现乳酸片球菌素的α-螺旋含量约为6.8%,β-折叠含量约为20%,转角所占比例为20%。当乳酸片球菌素的α-螺旋含量增加,β-折叠、转角含量降低时,细菌素活性随之降低,在pH6.0的低盐溶液中,乳酸片球菌素的结构稳定,此时抑菌活性最高;在pH12.0或者高浓度的盐溶液中,乳酸片球菌素α-螺旋含量增加至58%,β-折叠结构消失,细菌素活性丧失。     

L-乳酸脱氢酶基因在乳酸乳球菌KLDS4.0325中的表达

本文研究了在m RNA转录水平上三种L-乳酸脱氢酶基因在乳酸乳球菌KLDS4.0325不同生长阶段的表达情况。以16s r RNA作为内参基因,应用实时荧光定量PCR技术测定不同生长阶段的菌体中L-乳酸脱氢酶基因(ldh、ldh X和ldh B)表达的动态变化规律。该菌株的生长曲线呈S型,培养2~6 h为菌体的生长对数期,随后进入稳定期。生长曲线的测定表明该菌株生长力极其旺盛;16s r RNA、ldh、ldh X和ldh B基因的扩增效率曲线显示,内参基因与目的基因的扩增效率一致且接近100%,这说明利用相对荧光定量法能够较好的反应目的基因的表达量;ldh、ldh X和ldh B基因在菌体生长的3个时间点(6 h、9 h和12 h)都有一定量的表达,随着菌体的不断生长,基因表达的变化均呈现显著性上升趋势,且上升幅度不断增加,在12 h时基因表达量达到最大值。其中ldh基因在的表达量在菌体生长的3个时间点存在显著性差异,而ldh X、ldh B基因的表达量存在极显著差异。     

乳酸片球菌细菌素的活性及特性的研究

试验采用TGE（trypticase glucose yeast extlact）肉汤培养基作为乳酸片球菌的培养基，培养条件为37℃过夜静止培养。利用改变pH的方法，即通过菌体对细菌素的吸附与解吸，对细菌素进行分离纯化，试验表明细菌素对植物乳杆菌，绿脓杆菌，单核细胞增多症李氏杆菌，沙门氏菌，枯草杆菌，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157均有抑制作用。并且还具有耐热，耐盐的特性．     

乳酸链球菌素和乳酸乳球菌在食品工业中的应用

乳酸乳链球菌和乳酸乳球菌均为革兰氏阳性细菌,乳酸链球菌产生的乳酸链球菌素由于其特殊的抗菌性能及安全无毒的特性被广泛应用于各类食品的防腐保鲜。乳酸乳球菌作为一种安全且低免疫原性的基因工程菌,可用于表达一些酶或其他生产营养物质的蛋白等以提高食品的安全性及其营养价值,还可用于表达抗原作为口服疫苗。综述乳酸链球菌素和乳酸乳球菌在食品工业中的应用。     

一株乳酸乳球菌所产细菌素的生物学特性

对乳酸乳球菌KLDS4.0326所产类细菌素进行分离纯化,并对细菌素的部分生物学特性进行研究。在排除酸性产物和过氧化氢的干扰后,菌株的无细胞发酵上清液对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性细菌以及大肠杆菌、沙门氏菌等革兰氏阴性细菌具有显著的抑制作用;经胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K处理后,抑菌活性降低,表明抑菌成分为蛋白类物质;该细菌素具有良好的热稳定性,在酸性条件下抑菌活性稳定,并且具有较广的抑菌谱,能够抑制多种革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。     

乳酸乳球菌表达系统及其启动子的研究进展

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是工业应用中一种重要的模式菌株,具有非致病性、分泌蛋白能力强、容易分离培养等特性,是异源蛋白表达和分泌的理想宿主。高效可控的启动子是实现外源蛋白高效表达的关键因素之一。根据诱导机制,启动子可分为组成型和诱导型。本文阐述了乳酸乳球菌表达系统及其启动子结构,总结了生物信息学预测启动子及筛选克隆新启动子的方法,并对乳酸乳球菌启动子未来的研究方向进行了展望,可为深入研究启动子的结构和功能并进一步在工业上生产外源蛋白提供参考。     

瑞士乳杆菌产生的细菌素的抑菌活性研究

主要通过研究对从建昌板鸭发酵过程中分离瑞士乳杆菌产生细菌素的抑菌活性,考察不同温度,不同p H,不同种类酶作用对细菌素抑菌活性的影响。结果证明:蛋白酶能一定程度抑制细菌素的抑菌活性,且胰蛋白酶的抑制程度最强;该细菌素的抑菌活性对温度的耐受力强,即使在100℃处理后仍具有抑菌活性,在-20℃条件下保存时抑菌活性最强;该细菌素p H在1.5~4.0时具有抑菌活性,在p H为1.5时抑菌活性最强。     

乳酸片球菌R-4细菌素PA-1原核表达及其理化特性

为实现原核表达产出细菌素并检测其理化特性,作者将乳酸片球菌 R-4细菌素pedA基因进行扩增回收,与pMD19-T载体连接后转入E.coli DH5α感受态细胞进行克隆。提取克隆后的pedA基因与表达载体pET-32a（+）连接,形成重组质粒pET-32a-pedA并转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代半乳糖苷诱导,乳酸片球菌R-4细菌素PA-1在大肠杆菌细胞进行表达。表达蛋白质经Ni-NTA柱纯化后,以金黄色葡萄球菌为指示菌检测其理化特性。结果表明,在E.coli BL21(DE3)细胞中成功表达相对分子质量为26 000的乳酸片球菌R-4细菌素PA-1并完成纯化。纯化后的乳酸片球菌R-4细菌素PA-1在40~121 ℃作用20 min、在pH 2~12、紫外线照射0~10 h、过氧化氢酶作用2 h后,其抑菌范围分别为14.7~15.6 mm、14.0~16.5 mm、15.1~15.8 mm和14.9 mm,而分别经胃蛋白酶和胰蛋白酶作用2 h均失去抑菌作用。这表明乳酸片球菌R-4细菌素PA-1对高温、强酸强碱、紫外线和过氧化氢酶均具有较好的稳定性,而胃蛋白酶和胰蛋白酶会使其失活。     

大豆锰超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的分泌表达

为使大豆锰超氧化物歧化酶（Mn superoxide dismutase,MnSOD）在乳酸乳球菌中高效表达,将克隆的MnSOD基因开放阅读框序列分别重组到质粒pNZ8149和经改造的质粒pNZS上,表达载体pNZ-SOD和分泌表达载体pNZS-SOD,将两者分别以电穿孔法转化乳酸乳球菌L. lactis NZ3900,经Elliker琼脂板筛选、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）、酶切鉴定正确后,获得的两重组菌株加入Nisin进行诱导表达,对L. lactisNZ3900/pNZ-SOD和L. lactis NZ3900/pNZS-SOD的表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和酶活性对比分析。结果显示：L. lactis NZ3900/pNZS-SOD菌株表达SOD总活性约是L. lactis NZ3900/pNZ-SOD菌株的1.6 倍,是L. lactis NZ3900/pNZ8149的13.5倍,且可将表达的约2/3的SOD分泌到胞外,表明经改造的乳酸菌分泌表达系统L. lactis NZ3900/pNZS能够分泌表达SOD,并增强SOD的表达。     

乳酸乳球菌KLDS4.0325产细菌素最佳培养条件的研究

以分离自新疆牧民家庭自制酸马奶中的乳酸乳球菌KLDS4.0325为研究对象,以大肠杆菌为指示菌,以抑菌圈直径为考察指标,考察了不同温度、p H、转速及培养时间等培养条件对该菌株细菌素产量的影响,经单因素实验优化得出乳酸乳球菌KLDS4.0325在培养温度33℃,培养基初始p H7.0,120 r/min摇床培养20 h的条件下,无细胞发酵上清液对大肠杆菌的抑菌圈直径最大,抑菌活性最强,细菌素产量最高。在此条件下,抑菌圈直径为25.26 mm,细菌素效价可达5383.07 IU/m L。      

植物乳杆菌细菌素基因plnEF的克隆与异源表达

目的:构建目的基因plnEF原核表达系统,诱导工程菌BL21-p ET28a-PL-plnEF表达目的融合蛋白并纯化,以期获得大量纯度较高的植物乳杆菌PlnEF细菌素,开发新的食品防腐剂。方法:构建含plnEF基因的重组质粒,将其转入大肠杆菌BL21中,经过IPTG诱导大量表达目标蛋白,融合蛋白PlnEF经纯化后进行分子量大小、抑菌活性等的检测。结果:重组质粒pET28a-PL-plnEF在大肠杆菌BL21中成功表达,合成PlnEF蛋白,其分子量为15.6 k Da,且该融合蛋白对大肠杆菌JM109具有良好的抑菌活性。结论:plnEF基因片段能够在原核细胞中正确表达且具有活性,本文为进一步研究开发该细菌素作为生物防腐剂奠定了基础。     

对大肠杆菌异源表达乳酸片球菌素包涵体复性方法的研究

本研究对E.coli BL21（DE3）基因工程菌高效表达的乳酸片球菌素融合蛋白包涵体进行了提取和变性溶解,并采用稀释复性,反稀释复性,透析复性,CTAB辅助复性和CTAB和β-CD结合辅助复性五种方法对乳酸片球菌素融合蛋白包涵体的变性溶液进行了复性的研究。结果表明CTAB和β-CD结合辅助复性的复性方法优于其它的复性方法,可以实现以较高浓度的包涵体变性蛋白溶液,较小体积的复性液来获得较高浓度的复性产物和达到相对稳定的复性率。      

乳酸乳球菌富硒及其硒多糖抗氧化活性研究

对乳酸乳球菌富硒工艺进行优化以及对其最优条件下提取的硒多糖抗氧化活性研究,结果表明:接种量、培养时间、亚硒酸钠浓度是影响乳酸乳球菌富硒量的主要因素;当接种量8%,培养时间24h,亚硒酸钠浓度14μg/mL,温度37℃,pH6.6时,乳酸乳球菌的有机硒转化率为59.87%。当最优条件下提取的硒多糖浓度达2mg/mL时,硒多糖对羟自由基和超氧阴离子的清除率为78%和59%,较同等条件下多糖的清除率分别提高了19%和18%。