SHV-12型超广谱β-内酰胺酶特性的研究

目的研究SHV-12型超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的特性。方法将blaSHV-12基因连接至pET28a载体上，并用重组质粒转化大肠埃希菌BL21进行克隆表达，挑选blaSHV-12阳性表达的菌落，提取其酶蛋白进行等电点测定和酶动力学分析。结果SHV-12型ESBL等电点为8．2。同时，在所测的几种抗生素中，该酶时头孢他啶和头孢噻肟的Km相同且最小；对头孢噻吩，有着最大的Vmax／Km；而对阿莫西林，表现出最大的Km和最低的Vmax。结论SHV-12型ESBL对头孢他啶和头孢噻肟具有高的亲和力，而对头孢噻吩有最大的催化效能。     

SHV-28型β内酰胺酶的原核表达及其性质鉴定

目的：获得SHV-28型β内酰胺酶蛋白，并研究其特性。方法：将SHV-28型β内酰胺酶基因连接到pET-28b载体上，重组质粒pET-28b／SHV-28转化大肠埃希菌BL21(DE3)。用酶抑制剂增强的纸片扩散法检测重组菌的表型，等电聚焦电泳测定其表达蛋白的等电点。结果：SHV-28型β内酰胺酶的等电点为7．6，为非超广谱β内酰胺酶。结论：SHV-28型β内酰胺酶蛋白表达正确，为进一步研究新基因型β内酰胺酶奠定了基础。     

SHV-71型β-内酰胺酶的酶动力学研究

目的对临床分离的鲍曼不动杆菌所产SHV-71型β-内酰胺酶的编码基因进行序列分析,研究其对多种β-内酰胺类抗生素的酶动力学参数,并观察pH、温度、底物浓度及酶抑制剂对酶活性的影响。方法PCR扩增SHV型酶的编码基因。将SHV的PCR产物与pMD18-T载体连接,测定它们的核苷酸序列,并将SHV-71型酶基因克隆至表达载体pET-41b(+),转化至宿主菌大肠埃希菌BL21(DE3)中。以IPTG诱导其表达并纯化,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达情况。用分光光度计测定SHV-71型酶对多种β-内酰胺类抗生素的动力学参数,以及pH、温度、底物浓度及酶抑制剂对酶活性的影响。结果SHV-71型酶对第一、二、三代头孢菌素类抗生素的相对最大水解速度及相对水解效率均较高,而对青霉素类和碳青霉烯类抗生素的相对最大水解速度及相对水解效率均较低。该酶在pH7.4、37℃的活性最高;底物浓度低于120μmol/L时,反应初速度随底物浓度增加而呈线性增加,底物浓度大于120μmol/L时,酶活性反而受抑;克拉维酸和三唑巴坦对SHV-71型酶有抑制作用。结论根据SHV-71型酶的酶学特点,我们推测SHV-71型酶为超广谱β-内酰胺酶。     

超广谱β—内酰胺酶及其实验室筛检

超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是指由质粒介导的能赋予细菌对头孢菌素类( 如头孢噻肟、头孢三嗪和头孢他啶等)和单酰胺类抗生素氨曲南以及青霉素类耐药的一类酶 [1,2].自1983年在联邦德国首次从臭鼻克雷伯菌分离出产SHV-2 ESBL以来,全世界许多地区不断有新的ESBLs检出报道,由产ESBLs菌株引起的感染发病率在逐渐提高,在某些医院甚至出现爆发流行[1～4].     

成人肝细胞微粒体乙基吗啡N-脱甲基酶活性及酶动力学研究

目的观察成人肝细胞微粒体乙基吗啡N-脱甲基酶(EDM)的活性水平、酶动力学特征及乙醇和头孢噻肟对酶动力学的影响。方法肝组织除去筋膜和血红蛋白,加磷酸盐缓冲液4℃下匀浆,12 000×g离心15 min,取上清100 000×g超速离心60 min,沉淀加PBS/甘油缓冲液制成微粒体悬液,终点法测EDM酶活性。观察不同浓度乙醇和头孢噻肟对EDM酶活性及酶动力学参数最大反应速度Vm和米氏常数Km的影响。结果48例成人肝细胞微粒体EDM活性为(0．89±0．18) U,女性组(0．96±0．22)U明显高于男性组(0．81±0．16)U(P＜0．05)。乙醇和头孢噻肟对EDM酶活性均有抑制作用,底物浓度为1．0 mmol/L时,抑制常数Ki分别为474 mg/L(1．04 mmol/L)和3．6%(0．62 mmol/L);头孢噻肟终浓度分别为0、200、400 mg/L时,米氏常数Km分别为0．80、0．86和0．96 mmol/L,Vm分别为1．46、1．39和1．35 mmol甲醛/g微粒体蛋白/min;乙醇终浓度分别为0%、2．0%、4．0%时,Km分别为0．80、0．94、和1．1 mmol/L,Vm分别为1．46、1．36和1．22 mmol甲醛/g微粒体蛋白/min。结论成人肝细胞微粒体EDM酶活性水平女性组高于男性组;乙醇和头孢噻肟对EDM酶活性的抑制作用是竞争性抑制为主的混合性抑制。     

大庆地区革兰阴性杆菌SHV型ESBLs基因型调查

目的了解大庆地区革兰阴性杆菌中SHV型ESBLs基因型的分布状况。方法采用双纸片协同法(DDS)、PCR法,检测ESBL阳性革兰阴性杆菌中的SHV基因。结果254株临床分离的多重耐药革兰阴性杆菌中共检出26株携带SHV基因,分别为SHV-28、SHV-12、SHV-5、SHV-1以及SHV-11五种基因型。携带blaSHV基因的细菌主要为肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和阴沟肠杆菌。结论在大庆地区首次检出SHV-28,SHV-12,SHV-5型ESBLs基因,首次检出SHV-1,SHV-11型β-内酰胺酶基因;大庆地区革兰阴性杆菌携带多种类型SHV型ESBLs基因。     

抗菌药物对产超广谱β内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌接种效应的研究

目的研究美罗培南、头孢米诺、哌拉西林-他唑巴坦、头孢吡肟、头孢他啶、头孢噻肟和头孢曲松7种常见抗生素对产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的接种效应。方法用微量肉汤稀释法测定7种抗生素对22株产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌在标准细菌接种量(5×10~5CFU/mL)和高接种菌量(5×10~7CFU/mL)时的MIC。结果随着接种菌量增加,美罗培南和头孢米诺对所有受试菌株的MIC无接种效应;哌拉西林-他唑巴坦对SHV-12型和1株CTX-M-14菌的MIC表现出接种效应;头孢吡肟、头孢他啶、头孢噻肟和头孢曲松存在接种效应的菌种分别占所有受试菌株的86.4%(19/22)、40.9%(9/22)、10%(22/22)和100%(22/22)。结论对22株产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌,美罗培南和头孢米诺不存在接种效应,哌拉西林-他唑巴坦对部分基因型ESBLs菌株(SHV-12型和1株CTX-M-14菌株)存在接种效应,头孢吡肟、头孢他啶、头孢噻肟和头孢曲松存在接种效应。     

19家医院大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中TEM型β-内酰胺酶的研究

目的 检测全国19家医院大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的TEM型ESBLs.方法 收集2004～2005年全国19家医院对头孢他啶耐药的大肠埃希菌98株和肺炎克雷伯菌109株,琼脂稀释法测定菌株MICs,PCR扩增blaTEM基因.扩增阳性菌株进行接合实验,测定接合子MICs并PCR扩增blaTEM基因.扩增阳性的菌株和接合子以等电聚焦电泳(IEF)检测其β-内酰胺酶等电点.对具有典型TEM型ESBLs表型的菌株进行测序和变性高效液相色谱(DHPLC)分析.进一步收集检出突变菌株的宿主患者及其所在病房分离的对头孢他啶不敏感的菌株,进行测序、DHPLC分析,以及ERIC-PCR和RAPD分型.结果 实验菌株中大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌ESBL阳性率分别为84.7%和68.8%,blaTEM基因阳性率分别为67.3%和69.7%.仅1株大肠埃希菌P34表达TEM-12型ESBL,其他均为TEM-1(广谱β-内酰胺酶).P34宿主患者分离的21株大肠埃希菌中有18株表达TEM-12,且所有菌株均为同一克隆.该患者住院期间所在病房分离的11株对头孢他啶不敏感大肠埃希菌均表达TEM-1,与P34均不是同一克隆,但不同患者间存在菌株的水平传播.结论 TEM型ESBLs已在中国出现,但仍罕见,不是导致菌株对头孢他啶耐药的主要原因.本研究在国内首次报道了TEM-12型ESBL,该菌株虽未引起流行,但仍应引起重视.必须加强感染控制,防止TEM型ESBLs在中国的传播.     

大肠埃菌和肺炎克雷伯菌超广谱β内酰胺酶的基因分型

目的：分析我院大肠埃希菌，肺炎克雷伯菌临床分离株中超广谱β内酰胺酶（ESBLs)的主要基因型。方法：用表型确证试验确定临床标本中产ESBLs的大肠埃希菌和克雷伯菌，用Etest检测其最低抑菌浓度（MIC），分别用TEM，SHV和CTX-M通用引物进行聚合酶链反应（PCR）扩增并对PCR产物进行序列分析。结果：大部分产ESBLs菌株体外对头孢噻肟耐药而对头孢他啶敏感，PCR扩增结果显示TEM，SHV和CTX-M的阳性率分别为68%，39%和83%，序列分析证实TEM扩增产物均属于TEM-1基因，CTX-M扩增产物均属于CTX-M-3基因，而SHV扩增产物则分别属于SHV-12，SHV-11或SHV-1基因，结论：CTX-M-3和SHV-12是我院产ESBLs菌株的主要基因型；尚未发现TEM起源ESBLs。     

产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌表型及基因型研究

目的了解我院临床分离的大肠埃希菌超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)表型和基因型分布情况。方法对88株大肠埃希菌进行耐药分析,并用筛选试验和确证试验确认产ESBLs菌株,对耐药基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增分析,选部分产物测序。结果88株大肠埃希菌中共检出31株产ESBLs(35.2%)菌株。产ESBLs菌株对头孢他啶的敏感率为58.1%,对头孢噻肟和头孢曲松的敏感率均为3.2%。PCR结果显示,产ESBLs大肠埃希菌基因主要是CTX-M型(90.3%),其中以CTX-M-14、CTX-M-3型为主;TEM基因均为TEM-1型,SHV基因均为SHV-1型。结论我院产ESBLs大肠埃希菌检出率为35.2%,其耐药性明显高于非产ESBLs菌株;其基因均为CTX-M型,其中以CTX-M-14和CTX-M-3型为主;TEM-1型广谱酶广泛存在于产ESBLs的大肠埃希菌中,则SHV-1型少见。     

济南地区产ESBL福氏志贺菌耐药性及耐药基因型分析

摘要：目的：了解产ESBL福氏志贺菌的耐药特征及传播方式,确定产ESBL菌株流行基因型。 方法：用纸片扩散法对产ESBL菌株初步筛选,PCR检测编码ESBL的基因,用接合试验确认产ESBL菌株耐药性的传递方式。 结果：53株福氏志贺菌中16株（30.2%）产ESBL。药敏结果显示,16株产ESBL福氏志贺菌对氨苄西林、头孢噻肟、四环素、氯霉素、磺胺甲噁唑和甲氧苄啶完全耐药,对头孢西丁、亚胺培南和庆大霉素完全敏感,其中75.0%（12/16）的菌株对头孢他啶、头孢吡肟和氨曲南耐药,37.5%（6/16）对环丙沙星耐药;所有产ESBL株接合试验阳性;16株产ESBL志贺菌扩增出CTX-M、TEM和OXA基因,测序结果分别为bla_CTX-M-15(12/16)和bla_CTX-M-14(4/16)、bla_TEM-1（11/16）、bla_OXA-30(16/16)。 结论: 济南地区福氏志贺菌存在严重多重耐药现象,流行的ESBL基因型为CTX-M-14和CTX-M-15。     

产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌表型及基因型研究

目的 了解我院临床分离的大肠埃希菌超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）表型和基因型分布情况.方法 对88株大肠埃希菌进行耐药分析,并用筛选试验和确证试验确认产ESBLs菌株,对耐药基因进行聚合酶链反应（PCR）扩增分析,选部分产物测序.结果 88株大肠埃希菌中共检出31株产ESBLs（35.2%）菌株.产ESBLs菌株对头孢他啶的敏感率为58.1%,对头孢噻肟和头孢曲松的敏感率均为3.2%.PCR结果显示,产ESBLs大肠埃希菌基因主要是CTX-M型（90.3%）,其中以CTX-M-14、CTX-M-3型为主;TEM基因均为TEM-1型,SHV基因均为SHV-1型.结论 我院产ESBLs大肠埃希菌检出率为35.2%,其耐药性明显高于非产ESBLs菌株;其基因均为CTX-M型,其中以CTX-M-14和CTX-M-3型为主;TEM-1型广谱酶广泛存在于产ESBLs的大肠埃希菌中,则SHV-1型少见.     

全自动细菌分析系统在监测细菌耐药性中的应用

目的 :对本所分离的 12 0株革兰阴性杆菌进行耐药性监测 ,了解超广谱 β 内酰胺酶 (ESBLs)的发生率及其与细菌耐药性的关系。方法 :用VITEK32型全自动细菌分析系统药敏检测卡GNS -5 0 6进行细菌耐药性的监测和ESBLs的检测。结果 :15种抗菌药物中总耐药率最低的是亚胺培南 ( 6 2 5 %～ 2 5 0 %)和头孢他啶 ( 12 5 %～33 3%)。大肠埃希菌中产ESBLs菌占 6 0 0 %,肺炎克雷伯菌为 40 6 %,肠杆菌属为 2 7 8%,铜绿假单胞菌为 0 %,总检出率为 30 %。产ESBLs菌株对氨苄西林、头孢噻吩、头孢噻肟和头孢他啶的耐药率明显高于非产ESBLs株 ,对其他抗菌药物的耐药率与非产酶株组无明显差异。结论 :亚胺培南和头孢他啶对革兰阴性菌的耐药率最低。VITEK32型全自动细菌分析系统进行细菌耐药性监测快速、准确、方便。     

肠杆菌科细菌超广谱β-内酰胺酶的检测

为了解临床分离菌株超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的产生情况及不同方法、不同指示剂的敏感性,我们对收集的肠杆菌科细菌195株进行研究.用双纸片协同试验检测耐氨苄西林的肠杆菌科细菌195株,产ESBL 55株,阳性率为28.2%.大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和肠杆菌属细菌是主要的产酶菌.选其中40株用三相试验检测,仅检出33株,三相试验对ESBL的检出率低于双纸片协同试验.在头孢曲松、氨曲南、头孢他啶和头孢噻肟四种抗生素中,头孢曲松筛选ESBL的检出率最高,头孢他啶的检出率最低.常规药物敏感试验的耐药标准和NCCLS关于ESBL的筛选标准(1999)在判断ESBL上存在很大差别,提示临床微生物工作者,为避免可疑ESBL的漏检,应使用NCCLS的新标准对ESBL进行初筛.在常用抗生素20种中,亚胺培南对产ESBL细菌的抗菌效果最好(敏感率为100%),其次为头孢西丁.β-内酰胺抗生素+酶抑制剂(复方氨苄西林、复方阿莫西林和复方替卡西林)的作用效果不好.     

杭州地区1998-2008年产ESBL的志贺菌基因型及分子流行病学研究

1999年Ahamed和Kundu~([1])在印度首次发现了志贺菌中存在SHV-11型ESBL.ESBL通常由质粒介导,对三代头孢和单环类抗生素有很高的活性,此后,世界各地均有志贺菌中ESBL的报道.     

检测大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶的探讨

近年来，由于第三代头孢菌素的广泛应用，结果对头孢他啶，头孢噻肟等三代头孢菌素耐药的菌株不断增多，这些菌株多数产生超广谱β－内酰胺酶（ESBL），如肺炎克雷伯菌，大肠埃希菌1、2，及时检测出ESBL，可指导医生合理使用抗生素，防止医院感染及ESBL的区域性暴发流行。 1 材料与方法： 1．1 标本来源：122株大肠埃希菌为1997年8月～1998年12月临床分离有选择的大肠埃希菌，应用Vitek－32自动微生物分析仪进行鉴定。 1．2 抗生素纸片：头孢他啶、头孢噻肟、氨曲南、阿莫西林／棒酸，购自BBL公司。 1．3 试剂：培养基采用bioMer…     

VITEK—AMS仪检测超广谱—β内酰胺酶的结果评价

目的：评价VITEK全自动微生物分析仪(VITEK—AMS)检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的可靠性及选择最佳筛选底物。方法：同时使用纸片筛选和确证实验与VITEK32型—AMS仪对临床分离的195株大肠埃希菌和52株肺炎克雷伯菌进行ESBL检测。结果：确证实验中，大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产ESBL阳性率分别为23，6％，19．8％，VITEK—AMS仪和纸片确证实验同时检测为阳性的为51株，同时检测为阴性的为192株，有四株确证实验阳性而VITEK—AMS仪漏检，VITEK—AMS仪检测ESBL的特异性为100％，灵敏度为92．7％。初筛实验中，头孢噻肟筛选的灵敏度为100％，是我院的最佳筛选底物，其次为头孢曲松、头孢泊肟、氨曲南，单用头孢他啶漏检率最高。结论：VITEK—AMS是检测ESBL的较好方法。头孢噻肟是我院的最佳筛选底物。     

大肠埃希菌耐药特征及质粒介导喹诺酮耐药基因分布北大核心CSCD

目的调查大肠埃希菌分离株的耐药特征及质粒介导喹诺酮耐药基因流行状况。方法纸片扩散（K-B）法进行药物敏感试验,采用双纸片法检测产超广谱β内酰胺酶（ESBL）,聚合酶链反应（PCR）检测qnr A、qnr B、qnr C、qnr D、qnr S、aac（6＇）-Ib、qep A基因,限制性酶切反应确定aac（6＇）-Ib-cr基因型。结果 179株大肠埃希菌中95株ESBL表型确证试验阳性,检出率为53.1%;产ESBL菌株未见对美罗培南耐药,对亚胺培南耐药率极低（1.1%）,对阿米卡星、哌拉西林-他唑巴坦、头孢哌酮-舒巴坦耐药率皆低于30%,对哌拉西林、头孢噻肟、头孢曲松、氨曲南、甲氧苄啶-磺胺甲唑耐药率皆高于70%,对庆大霉素、头孢他啶、环丙沙星、左氧氟沙星耐药率在60%~70%;PCR扩增结果显示产ESBL菌株,具有qnr基因9株（9.5%）,其中qnr A 2株、qnr B 5株、qnr S 2株。非产ESBL菌株,具有qnr B基因3株（3.6%）;酶切反应显示产和非产ESBL菌株具有aac（6＇）-Ib-cr基因分别为21株（22.1%）和5株（6.0%）。所有菌株皆未检测到qep A基因。结论产ESBL大肠埃希菌呈现多重耐药趋势,质粒介导喹诺酮耐药基因以aac（6＇）-Ib-cr基因型为主。     

从因数看固定时间法检测的化学本质

固定时间法是临床生化酶学分析的常用方法。本文通过对其因数(下简称“F”)的推导,阐明该法的化学本质,透彻其原理,从而更好地完成日常工作。1　因数推导1.1　米—孟氏酶动力学公式的运用　对于酶促反应,米—孟氏酶动力学公式〔1〕为:V=Vm[S]Km [S]。其中,V为酶促反应速度;Vm为反应速度最大值;Km为米—孟氏常数;[S]为底物浓度,通常是被测物质的浓度。酶促反应中,当[S]Km,米—孟氏公式变为V=VmKm·[S],因Km是酶的特征性常数,且在酶浓度不变时,对于特定的底物Vm亦常数〔1〕,故设K=VmKm,则有V=K[S],反应呈一级反应。V与[S]基本是正…     

上海发现同时产CYM-2型质粒AmpC酶及CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌

目的研究大肠埃希菌同时产质粒型头孢菌素酶（AmpC酶）及超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的耐药表型及基因型特点。方法在242株大肠埃希菌中用多重聚合酶链反应（PCR）检测质粒AmpC酶;对确认为产CIT群质粒AmpC酶的菌株进行PCR、克隆、测序;接合试验证实耐药基因的可传递性;PCR及测序确定ESBL的基因;等电聚焦电泳检测细菌β-内酰胺酶等电点（PI）;微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）。结果12株产CIT群酶细菌所携带AmpC酶基因均为blaCMY-2（PI 9.0）,且均携带blaTEM-1（PI 5.4）,9株同时携带blaCTX-M-14（PI8.0）,无菌株携带blaSHV-like;12株产CMY-质粒AmpC酶细菌有4株接合实验阳性,经PCR证实接合子均传递了blaCMY-2,并有1株同时传递了blaCTX-M-14;多数产CMY-2型酶的细菌呈多重耐药,并有1株菌对碳青霉烯类药物耐药。结论在上海地区首次发现同时产CMY-2型质粒AmpC酶及CTX-M-14型ESBL的大肠埃希菌。