补肾方对β淀粉样蛋白所致大鼠海马神经元细胞毒作用的影响

目的:建市Aβ所致的神经细胞毒模型,探讨补肾方的药效及作用机理。方法:原代培养大鼠海马神经元,用25μmol/L聚集状态的Aβ1-42建立神经细胞毒模型。采用LDH释放量来检测神经元存活率,通过透射电镜、流式细胞计判断神经元凋亡,应用免疫细胞化学法研究凋亡相关基因(Bcl-2、Bax、c-Jun)的蛋白表达。结果:神经元经Aβ1-42处理后,LDH释放增加;电镜显示细胞体积缩小、染色质固缩、或浓聚成块状位于核周边、滑面内质网扩张;流式细胞计可见亚二倍体峰;Bcl-2的蛋白表达减少,而Bax与C-Jun表达增加。补肾方使LDH释放减少,电镜下具有凋亡形态特征的细胞减少,流式细胞计显示凋亡率下降,Bcl-2蛋白表达增加,c-Jun表达减少,而Bax表达变化不明显。Tacrine组神经元存活率增加,但其它指标的变化不明显。结论:①补肾方对Aβ1-42神经细胞毒有保护作用,可提高细胞存活率,抑制凋亡。②其作用机制可能是通过提高bcl-2、降低c-Jun基因的蛋白表达而实现。③Tacrine对神经元存活率有提高作用,但抑制神经元凋亡的作用似不明显。补肾方对抑制Aβ所致神经元凋亡明显优于Tacrine。     

调心方对β淀粉样蛋白所致原代培养海马神经元细胞毒模型的影响

目的：建立β淀粉样蛋白（Aβ）所致的神经细胞毒模型，探讨调心方的药敏及作用机理。方法：原代培养大鼠海马神经元，用25μmol/L 集状态的Aβ1－42建立神经细胞毒模型。采用乳酸脱氢酶（LDH）释放量来检测神经元存活率，通过透射电镜、流式细胞仪检测判断神经元凋亡，应用免疫细胞化学法研究凋亡相关基因的表达蛋白（Bcl-2、Bax、 c-Jun）。结果：神经元经Aβ1－42处理后，LDH释放增加；电镜显示细胞体积缩小、染色质固缩、或浓聚成块状位于核周边、滑面内质网扩张；流式细胞仪检测可见亚二倍体峰；Bcl-2减少，而Bax与c－Jun增加。调心方使LDH释放减少，电镜下具有凋亡形态特征的细胞减少，流式细胞仪检测显示凋亡率下降，Bcl-2增加，Bax减少，而c-Jun变化不明显。四氢氨基吖啶（THA）组神经元存活率增加，但其他指标的变化不明显。结论：调心方对Aβ1－42神经细胞毒有保护作用，可提高细胞存活率，抑制凋亡，其抑制凋亡作用的机制可能是通过提高bcl-2、降低bax基因的蛋白表达而实现。THA对神经元存活率有提高作用，但抑制神经元凋亡的作用似不明显。调心方对抑制Aβ所致神经元凋亡明显优于THA。     

调心方对β淀粉样蛋白所致原代培养海马神经元细胞毒模型的影响

目的建立β淀粉样蛋白(Aβ)所致的神经细胞毒模型,探讨调心方的药效及作用机理。方法原代培养大鼠海马神经元,用25μmol/L聚集状态的Aβ1-42建立神经细胞毒模型。采用乳酸脱氢酶(LDH)释放量来检测神经元存活率,通过透射电镜、流式细胞仪检测判断神经元凋亡,应用免疫细胞化学法研究凋亡相关基因的表达蛋白(Bcl-2、Bax、c-Jun)。结果神经元经Aβ1-42处理后,LDH释放增加;电镜显示细胞体积缩小、染色质固缩、或浓聚成块状位于核周边、滑面内质网扩张;流式细胞仪检测可见亚二倍体峰;Bcl-2减少,而Bax与c-Jun增加。调心方使LDH释放减少,电镜下具有凋亡形态特征的细胞减少,流式细胞仪检测显示凋亡率下降,Bcl-2增加,Bax减少,而c-Jun变化不明显。四氢氨基吖啶(THA)组神经元存活率增加,但其他指标的变化不明显。结论调心方对Aβ1-42神经细胞毒有保护作用,可提高细胞存活率,抑制凋亡,其抑制凋亡作用的机制可能是通过提高bcl-2、降低bax基因的蛋白表达而实现。THA对神经元存活率有提高作用,但抑制神经元凋亡的作用似不明显。调心方对抑制Aβ所致神经元凋亡明显优于THA。     

调心方对β淀粉样蛋白所致大鼠海马神经元凋亡的调控作用

目的 探讨调心方的药效及作用机制。方法 原代培养大鼠海马神经元,Aβ 1-42诱导神经细胞毒模型。采用FDA与PI双染检测神经元存活率,Hoechst 33258染色、TUNEL判断神经元凋亡,免疫细胞化学研究Caspase-3表达,Northern Blot、RT-PCR研究凋亡相关基因(bcl-2、bax、c-jun、c-fos)表达。结果 神经元经Aβ 1-42处理后,活细胞数减少,染色质浓缩、核碎裂,TUNEL染色阳性神经元增多,Caspase3表达增加,bcl-2 mRNA表达减少,而bax与c-jun表达增加、c-fos的表达变化不明显。调心方可显著改善上述变化。结论 调心方对Aβ 1-42神经细胞毒有保护作用,可提高细胞存活率,抑制凋亡。其机制可能通过提高bcl-2 mRAN水平,降低bax和c-jun mRAN水平,减少Caspase-3表达而实现。     

阿魏酸钠通过抑制β淀粉样蛋白1-42所致的星形胶质细胞炎症因子释放

目的:研究阿魏酸钠对Aβ1-42激活的培养星形胶质细胞引起的海马神经细胞损伤的保护作用。方法:原代培养海马神经细胞与星形胶质细胞,星形胶质细胞用阿魏酸钠(50,100,200 mol/L)预处理6 h后,加入50 nmol/L的Aβ1-42作用24 h,将作用后的星形胶质细胞条件培养液(astrocytic conditioned medium,ACM)加入到培养海马神经细胞中作用48 h,以加入Aβ1-42的无细胞培养液为对照。ELISA法测定星形胶质细胞培养液中IL-1β、TNF-α表达,Griess法测定培养液中NO的含量;测定各组海马神经元乳酸脱氢酶(LDH)释放、采用突触素荧光免疫组织化学染色观察神经元损伤、Western蛋白印迹法检测神经元caspase-3蛋白表达。结果:与正常对照组相比,星形胶质细胞培养液加入Aβ1-42处理后IL-1β、TNF-α、NO生成量明显增加,海马神经元细胞加入ACM后突触素减少,LDH漏出量增加,磷酸化的caspase-3蛋白表达明显增加;应用阿魏酸钠(50,100,200 mol/L)预处理6 h可明显对抗Aβ1-42引起的星形胶质细胞及海马神经元细胞的这些改变。结论:阿魏酸钠通过抑制星形胶质细胞炎症因子释放对抗Aβ1-42引起的海马神经元损伤。     

补肾益智方对由A_β片段神经毒性诱导NG108-15细胞老年性痴呆模型神经递质释放影响的研究

目的：观察补肾益智方对由Aβ片段神经毒性诱导的NG108－15细胞老年性痴呆（AD）模型神经递质释放的影响。方法：利用免疫印迹检查、免疫放射活性测定及电生理学测定方法，观察补肾益智方含药血清处理Aβ片段神经毒性诱导的NG108－15细胞后的胆碱乙酰基转移酶（ChAT)活性、突触素蛋白（synapsin)水平及功能性突触形成率。结果：补肾益智方含药血清组ChAT活性和突触素蛋白水平高于正常对照血清组；含药血清能调节递质释放能力和提高功能性突触形成。结论：补肾益智方具有减轻细胞对Aβ的神经毒性反应，表明该方能拮抗AD的病理发展，并通过提高神经递质释放能力发挥对AD的治疗作用。     

知母皂苷对Aβ_(1-42)诱导的皮层神经元突触损伤的保护作用

目的:探讨知母皂苷(SAa B)对Aβ_(1-42)诱导的皮层神经元损伤是否有保护作用。方法:MTT法测皮层神经元细胞存活率;免疫荧光染色法检测神经元突触素(SYP)、突触后致密蛋白95(PSD-95)表达的改变。Western印迹法检测神经元SYP、PSD-95、p-Akt473、p-m TOR蛋白表达水平表达的改变。结果:Aβ_(1-42)作用48 h可使大鼠大脑皮层神经元细胞存活率明显降低,使神经元SYP、PSD-95、p-Akt473和p-m TOR蛋白表达明显降低。SAa B(0.01,0.1,1,5,10μmol/L)可明显对抗Aβ_(1-42)引起的神经元细胞存活率下降,并呈一定浓度依赖性。SAa B也可使SYP、PSD-95、p-Akt473和p-m TOR蛋白表达明显增加。结论:知母皂苷能够抑制Aβ_(1-42)诱导的皮层神经元突触损伤,这种作用可能与PI3K/Akt/m TOR信号转导通路有关。     

补肾化痰益智法对AD细胞模型APP mRNA表达的影响

目的：本研究在成功建立AD体外模型基础上,探讨补肾化痰益智法治疗AD的作用机制。方法：运用Aβ1-42作用于PC-12细胞,制作AD神经元细胞模型,并用补肾化痰益智方含药血清进行干预,以吲哚美辛为对照。镜下观察细胞形态,MTT法检测PC-12细胞存活率,观察补肾化痰益智方对神经元细胞保护作用。RT-PCR法检测APP mRNA的表达,观察补肾化痰益智方抗Aβ神经毒性作用。结果：2.5 mmol·L-1聚集态Aβ1-42使细胞活力明显下降;RT-PCR法对APP mRNA表达进行半定量分析发现,经Aβ1-42诱导各组APP mRNA表达上调,补肾化痰益智法可明显降低其表达（P〈0.01）。结论：补肾化痰益智法对神经细胞具有较好的保护作用,能够抑制APP mRNA的表达,降低毒性作用。     

二苯乙烯苷调控CREB/BDNF信号通路对Aβ25-35损伤的小鼠神经元突触的保护作用

目的:研究中药何首乌有效成分二苯乙烯苷(TSG)对β-淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)损伤的小鼠海马神经元的保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法:小鼠海马神经元细胞分离自新生48 h内胎鼠大脑海马,培养9 d待神经元成熟后,采用免疫荧光法对其进行鉴定。将培养成熟的神经元细胞分为正常组、模型组(Aβ25-35孵育造模)和TSG组(Aβ25-35孵育造模后,分别加入TSG 6.25,12.5,25,50,100μmol·L~(-1))。细胞增殖毒性检测(CCK-8)试剂盒和乳酸脱氢酶(LDH)法检测各组细胞活性,免疫荧光法检测突触素-1(SYN-1)蛋白的表达,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测突触后膜致密蛋白-95(PSD-95)和突触体素(SYP)的含量,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)和脑源性神经营养因子(BDNF) mRNA的表达,免疫荧光法和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测CREB,磷酸化CREB(p-CREB)和BDNF蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组细胞存活率显著降低,LDH释放量显著增高(P0.01),SYN-1,PSD-95和SYP的含量明显降低(P0.05,P0.01),p-CREB和BDNF mRNA及蛋白的表达明显下调(P0.05,P0.01);与模型组比较,不同浓度TSG均可提高细胞存活率,降低LDH释放量(P0.05,P0.01),TSG对Aβ25-35造模的小鼠海马神经元细胞的最适治疗浓度为25μmol·L~(-1); 25μmol·L~(-1)TSG能够显著增强SYN-1的表达量(P0.01),明显提高PSD-95和SYP的含量(P0.05);上调p-CREB和BDNF mRNA及蛋白的表达(P0.05,P0.01),但对CREB mRNA及蛋白的表达无显著影响。结论:TSG对Aβ25-35损伤的小鼠海马神经元突触具有保护作用,其机制可能与促进CREB的磷酸化使p-CREB表达增多,并促进神经营养因子BDNF的释放有关。     

补骨脂素对淀粉样蛋白损伤体外神经元的保护作用研究

目的：探讨补骨脂素对淀粉样蛋白损伤体外神经元的雌激素样保护作用及其机制。方法：β淀粉样蛋白（Aβ）处理体外大鼠海马神经元建立体外Aβ损伤模型,考察补骨脂素对Aβ对神经元MTF、LDH漏出及选择性老年痴呆症指示因子1（seladin-1）mRNA表达的影响。结果：补骨脂素可以拮抗Aβ对神经元细胞的损伤,上调seladin-1的表达。结论：上调seladin-1的表达可能是补骨脂素拮抗Aβ神经毒性的机制之一。     

补肾益智方对由A_β片段神经毒性诱导NG108-15细胞老年性痴呆模型神经递质释放影响的研究

目的:观察补肾益智方对由Aβ片段神经毒性诱导的NG108-15细胞老年性痴呆(AD)模型神经递质释放的影响.方法:利用免疫印迹检查、免疫放射活性测定及电生理学测定方法,观察补肾益智方含药血清处理Aβ片段神经毒性诱导的NG108-15细胞后的胆碱乙酰基转移酶(ChAT)活性、突触素蛋白(synapsin)水平及功能性突触形成率.结果:补肾益智方含药血清组ChAT活性和突触素蛋白水平高于正常对照血清组;含药血清能调节递质释放能力和提高功能性突触形成.结论:补肾益智方具有减轻细胞对Aβ的神经毒性反应,表明该方能拮抗AD的病理发展,并通过提高神经递质释放能力发挥对AD的治疗作用.     

补肾化痰益智法对AD细胞模型APPmRNA表达的影响

目的:本研究在成功建立AD体外模型基础上,探讨补肾化痰益智法治疗AD的作用机制。方法:运用Aβ1-42作用于PC-12细胞,制作AD神经元细胞模型,并用补肾化痰益智方含药血清进行干预,以吲哚美辛为对照。镜下观察细胞形态,MTT法检测PC-12细胞存活率,观察补肾化痰益智方对神经元细胞保护作用。RT-PCR法检测APP mRNA的表达,观察补肾化痰益智方抗Aβ神经毒性作用。结果:2.5 mmol·L-1聚集态Aβ1-42使细胞活力明显下降;RT-PCR法对APP mRNA表达进行半定量分析发现,经Aβ1-42诱导各组APP mRNA表达上调,补肾化痰益智法可明显降低其表达(P<0.01)。结论:补肾化痰益智法对神经细胞具有较好的保护作用,能够抑制APP mRNA的表达,降低毒性作用。     

独活香豆素对Aβ所致神经元损伤的神经保护作用研究

目的:探究独活香豆素(TCA)对Aβ所致的小鼠海马神经元损伤的神经保护作用及其作用机理。方法:从胎鼠大脑海马中分离出神经元细胞,培养9 d待神经元成熟后将细胞分为正常组(control)、模型组(30 mmol/L Aβ孵育24 h)和给药组(经Aβ处理后给予不同浓度TCA处理的细胞)。MTT法和LDH法检测各组海马神经元的活性,RTPCR法检测环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)和脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA表达的变化,免疫组织化学染色法检测突触素-1(synapsin~(-1))、磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(p-CREB)和BDNF蛋白表达的变化。结果:孵育Aβ的海马神经元显现较强神经毒性。与模型组比较,TCA组明显增强神经细胞的存活能力,增加synapsin~(-1)的表达量,提高BDNF mRNA的表达,增强p-CREB和BDNF蛋白的表达。结论:TCA对Aβ所致的海马神经元损伤具有保护作用,此神经保护作用可能是与促进CREB的磷酸化使p-CREB表达增多,并刺激神经营养因子BDNF的生成增多有关。     

调心方对Aβ杏仁核注射类AD大鼠tau蛋白异常磷酸化的影响

目的：研究调心方时Aβ杏仁核注射类AD大鼠tau蛋白异常磷酸化的影响。方法：通过单侧杏仁核注射Aβ造成类AD大鼠模型；免疫组织化学法观察异常磷酸化tau蛋白AT8表达；原位杂交法观察tau蛋白异常磷酸化蛋白激酶GSK-3β、P38MAPKmRNA的表达。结果：调心方可显降低异常磷酸化tau蛋白AT8及tau蛋白异常磷酸化蛋白激酶GSK-3β、P38MAPKmRNA的表达。结论：调心方具有改善Aβ诱导的类AD大鼠tau蛋白异常磷酸化的作用。     

补肾益智方对Alzheimer病模型大鼠脑内β-淀粉样前体蛋白的影响

目的：观察补肾益智方对Alzheimer病（AD）模型大鼠脑内β－淀粉样前体蛋白（β－APP）的影响。方法：以D－半乳糖致亚急性衰老合并Meynert核损毁作为AD大鼠模型,用免疫组织化学检测及体视学分析方法观察大鼠脑内β－APP的变化。结果：补肾益智方能显著降低AD模型大鼠脑内顶叶皮质、海马CA1区、齿状回β－APP免疫阳性神经元的细胞数、积分光密度值（P＜0.05,P<0.01)。结论：补肾益智方能减少或抑制β－APP的过度产生,这可能是其减少β淀粉样蛋白（β-AP)沉积,改善AD模型大鼠学习记忆的作用机制之一。     

调心方对LPS诱导的PC12细胞株毒性和Aβ生成的作用

目的：观察调心方对由LPS诱导的PC12细胞毒性和Aβ生成的改善作用。方法：用LPS处理PC12细胞（神经源性细胞株）造成细胞损伤和Aβ生成增加的模型。以MTT测定和逆转录－聚合酶链反应、蛋白免疫印迹法及免疫细胞化学方法观察细胞的生存率和APP、CPP32的表达及细胞内Aβ生成的变化。结果：LPS处理PC12细胞,细胞生存率下降约25％,APP、CPP32的表达和细胞内Aβ生成增加,而调心方的含药血清能提高细胞模型的生存率, 降低APP、CPP32的表达和细胞内Aβ生成。结论：一定剂量的LPS能造成理想的细胞损伤和Aβ生成增加的模型,其机制可能与CPP32的双重作用有关,即参与APP的水解,造成Aβ生成增加和引起细胞的死亡或凋亡。调心方对LPS造成的细胞毒性具有一定的保护作用,并减少Aβ生成。     

调心方活性部位对大鼠海马脑片CA1区诱发LTP的影响

目的：研究调心方活性部位A对大鼠海马脑片诱发长时程增强(LTP)效应的影响。方法：采用细胞外微电极记录技术，记录大鼠海马脑片CA1区诱发群峰电位(PS)，然后施以100Hz，100串的强直刺激诱发LTP。结果：调心方活性部位A对大鼠海马脑片正常PS的形状、幅度无影响，提示并不影响海马的基础突触传递。给予强直刺激后，高浓度活性部位A可以明显增大LTP幅度，提示具有促进和维持LTP的作用。结论：调心方活性部位A可能是调心方促进和维持大鼠海马脑片诱发LTP的有效成分之一，对LTP的促进作用也是调心方活性部位A益智作用的机制之一。     

调心方有效部位对类老年痴呆大鼠的影响

目的研究调心方有效部位(TX0201)对β-淀粉样蛋白(Aβ)25-35所致类老年性痴呆(AD)模型大鼠神经免疫调节的作用机制。方法采用双侧杏仁核注射Aβ25-35造成类AD大鼠模型,观察大鼠Morris水迷宫空间记忆能力,并分别通过免疫组化和RT-PCR方法研究类AD大鼠大脑组织中的原纤维酸性蛋白(GFAP)、APPmRNA表达和炎性细胞因子白细胞介素-1β、白细胞介素-6的变化以及TX0201的影响。结果类AD模型大鼠Morris水迷宫测试出现空间记忆能力下降,皮层、海马APPmRNA的表达上调;海马、皮层GFAP阳性胶质细胞和白细胞介素-6mRNA以及海马白细胞介素-1βmRNA表达增高。TX0201能有效控制以上病理变化。结论TX0201能显著改善Aβ诱导的痴呆模型大鼠学习记忆障碍,降低海马APPmRNA表达,减轻神经细胞的炎症和免疫联级反应。提示有效控制AD患者脑内Aβ免疫联级反应是TX0201的重要作用机制之一。     

补肾益智方对AD动物模型大脑神经元Tau蛋白及其相关酶类的影响

目的 :观察补肾益智方对AD动物模型大脑神经元磷酸化Tau蛋白及其相关酶类蛋白磷酸酶 1(PP 1)、蛋白磷酸酶 2A(PP 2A)的影响。方法 :用Wistar大鼠 80只以D 半乳糖腹腔注射 4周加上鹅膏覃酸 (ibotenicacid ,IBO)脑内Meynert核注射制造AD模型 ,随机分成AD模型组、双益平对照组、补肾益智方高、低剂量治疗组加上正常老年组和正常青年组总共设立六个组别。动物经治疗处理 6周后 ,应用免疫组织化学方法检测大鼠海马CA1和齿状回磷酸化Tau蛋白、PP 1、PP 2A神经元数目和光密度。结果 :AD模型组海马内神经元的Tau蛋白过度磷酸化而相互集结 ,形成成对螺旋细丝 ,表达脱Tau蛋白磷酸化的磷酸酯酶PP 1、PP 2A均明显减少 ;而补肾益智方治疗组可以使这种现象得到明显改善。结论 :补肾益智方能较有效地改善AD大鼠脑内神经元的Tau蛋白过度磷酸化 ,促进PP 1、PP 2A的表达。     

调心方对Aβ25-35杏仁核注射大鼠脑内细胞周期相关蛋白表达的影响

目的 :探讨调心方对 β淀粉样蛋白 (β amyloid ,Aβ)片段Aβ2 5 3 5杏仁核注射大鼠脑内细胞周期相关蛋白表达的影响。方法 :用Aβ2 5 3 5多肽片段进行大鼠单侧杏仁核注射 ,以模拟阿尔茨海默病 (Alzheimer’sdisease ,AD)脑内Aβ对神经系统的损害。应用免疫组织化学染色和积分光密度分析检测磷酸化tau、Aβ、cyclinA、cyclinB1等蛋白水平的变化。结果 :与生理盐水对照组比较 ,Aβ注射大鼠脑内的磷酸化tau、Aβ、cyclinA、cyclinB1等蛋白水平有不同程度的升高 (P <0 0 5 ) ,而给予调心方的动物在一定程度上能降低这些蛋白的水平 (P <0 0 5 )。结论 :调心方对Aβ引起的动物脑内神经元异常表达的细胞周期相关蛋白有一定的抑制作用。