一种体外扩增人γδT细胞的新方法

目的:建立一种简单快速的体外扩增人外周血γδT细胞的方法, 以便进一步对γδT细胞生物学特性和肿瘤免疫治疗的研究.方法:取健康人外周血100 mL, 分离单个核细胞, 置于含100 mL/L小牛血清, 50 mL/L人AB血清, 异戊烯焦磷酸(2 μg/L)和IL-2(100 IU/mL)RPMI1640 培养液中培养, 进行细胞毒杀伤活性测定和流式细胞术分析.结果:细胞培养10 d时γδT细胞从扩增前4.21%增加到70.35%, 增殖倍数可达80倍, 悬浮生长γδT细胞CD44表达为86.39%、贴壁生长γδT细胞为94.0%.效靶细胞比为40: 1时, 对K562细胞和SGC-7901胃腺癌细胞的杀伤活性分别为75%和61%.结论:用一种简单、快速和特异性的体外扩增人外周血中γδT细胞新方法, 培养的γδT细胞具有较强的抗肿瘤活性.     

不同磷酸化合物扩增外周血γδ T细胞的效率及条件优化

目的研究异戊烯焦磷酸(IPP)与帕米磷酸钠(PAM)体外扩增成人外周血γδT细胞的效率及条件优化。方法梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC),分别加入(1.0、5.0、10.0、15.0)μg/mL IPP或(2.0、5.0、8.0、12.0)μg/mL PAM及(100.0、200.0、500.0)IU/mL IL-2,置于100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养体系培养,观察并收集细胞,采用流式细胞仪检测刺激后CD3+TCRδ2+的γδT细胞数量以及比例,并计算其扩增效率。结果经过14 d扩增培养后,IPP组的γδT细胞数量在淋巴细胞中比例可上升为81.3%,PAM组的γδT细胞数量在淋巴细胞中比例上升为78.5%,表明IPP和PAM均能有效刺激扩增γδT细胞,2组的扩增效率无统计学差异(P0.05)。结论 PAM具有与IPP相似的体外扩增γδT细胞的能力,PAM扩增法可能成为扩增γδT细胞更为经济实用的选择。     

人外周血致敏型γδ+T细胞在体外的扩增

建立一种人外周血γδ＾＋Ｔ细胞体外选择性扩增的模式：即在ＩＬ－２的作用下,不需要γδ＾＋ＴＣＲ特异性配体的刺激,可使一类个体体外培养的外周血单个核细胞中的γδ＾＋Ｔ细胞发生优先增殖,逐渐成为培养细胞的主要群体。方法将１０个γδ＾＋ＴＣＲ的个体ＰＢＭＣ分别在含３＊１０＾５Ｕ／ＬＩＬ－２培养液中培养１－２ｗｋ后,其中的γδ＾＋Ｔ细胞的比率可达３８％－７８％。结果对３个宋的个体的坟增帮ＲＴ－ＰＣＲ分析表     

一种体外扩增γδT细胞的新方法

目的:建立一种新的γδT细胞扩增方法。方法:从健康人外周血中分离外周血单个核细胞(PBMCs),与用唑来膦酸预处理过的未成熟DCs按10:1混合,在含IL-2 400 U/ml和10%小牛血清的RPMI1640培养基中培养,用MTT法测定细胞增殖倍数。用流式细胞仪对γδT细胞进行表型分析并检测其细胞内的颗粒酶B、穿孔素和CD107a含量。用乳酸脱氢酶释放法(LDH)检测细胞杀伤活性。结果:经唑来膦酸预处理的树突状细胞与自身外周血单个核细胞共培养,到11天时γδT细胞增殖倍数达到(120±15)倍,第8天和11天γδT细胞百分率分别达到70.26%±3.56%、90.11%±4.67%。γδT细胞细胞内颗粒酶B、穿孔素及CD107a在第8天时分别为81.66%±4.32%、86.62%±5.21%和80.12%±3.78%,均高于对照组。培养的γδT细胞对SGC-7901、SW-1990、SW-480肿瘤细胞株杀伤活性至第8天时达到峰值。结论:此法能有效诱导γδT细胞体外扩增,培养的γδT细胞颗粒酶B、穿孔素及CD107a均显著高于对照组,并有较强的抗肿瘤活性。     

人外周血NK T细胞体外扩增的初步研究

自然杀伤Ｔ细胞 (ＮａｔｕｒｅＫｉｌｌｅｒＴｃｅｌｌｓ,ＮＫＴｃｅｌｌｓ)是近来被人们所认识的不同于普通Ｔ细胞及ＮＫ细胞的一类新的免疫调节细胞 ,在肿瘤治疗 ,自身免疫病 ,以及ＧＶＨＤ方面有着广泛的应用前景[1 3] 。该类细胞有着特殊的表型 ,它既可表达ＮＫ相关的表面标志物 ,又具有明显选择性倾向的αβ型ＴＣＲ受体。鼠为Ｖα1 4Ｖβ8,人则为Ｖα2 4Ｖβ1 1 ,其配体为递呈脂类抗原的ＣＤ1ｄ分子[4 ] 。由于ＮＫＴ主要存在于胸腺、骨髓和肝脏中 ,外周血含量极少[5] ,单纯依靠原位分离的方法很难获得足够的人ＮＫＴ细胞。本研究利…     

γδT细胞的体外扩增及在肿瘤治疗中的应用

γδT在肿瘤的过继性免疫治疗中发挥着重大作用,但是正常情况下,成年人体内γδT细胞只占外周血T细胞总数的0.5~5%,因此如何获得足够细胞数量且具有特异性杀伤功能的效应细胞就显得尤为重要。目前国内外γδT的扩增方法比较多,但是没有统一高效且特异性的扩增方法,来保证γδT的扩增效率和对肿瘤细胞的杀伤能力。本文对γδT细胞...     

脐血体外同时扩增造血干祖细胞、T细胞及树突状细胞

目的：探索体外同时扩增脐血中造血干祖细胞、T细胞及树突状细胞的可能性和最佳细胞因子组合方案。方法：采集健康正常足月产新生儿脐血，分离出单个核细胞，在不同的细胞因子组合作用下培养14天。培养于0、3、7和14天时收集细胞，用FCM分析扩增前后脐血CD34^＋、CD3^＋T及DCs细胞含量。结果：3组不同细胞因子组合实验组A：SCF＋IL-3，6；B：SCF＋IL-3，6，4；c：SCF＋IL-3，6，4（5X）均能显著扩增脐血中的单个核细胞和CD34’细胞，各组的CD34^＋细胞最高值出现在第7天，CD34^＋细胞平均增加倍数10—20倍不等。在扩增初期，各组CD3^＋T有所下降，7天时CD3^＋T细胞有不同程度的增加，14天时扩增最高的组别中CD3^＋T细胞是新鲜脐血的2倍。DCs标志CD1a、CDS0、CD83和CD86。在所有组别中培养3天时有所下降，第7天时在含IL4的组别中有显著上升，且CD1a和CD80表达高于CD83和CD86；14天时则有所回落。IL4对CD34^＋和CD3^＋T细胞扩增有一定促进作用。结论：脐血中T细胞、DC细胞在一定细胞因子组合下。可与CD34^＋细胞同时在体外被扩增和诱导分化。     

人CD4~+CD25~+调节性T细胞体外扩增研究

目的:建立有效的体外培养扩增人CD4+CD25+Treg细胞的体系,为临床输注供者来源的CD4+CD25+细胞抑制急性移植物抗宿主病(Auctegraft versus host disease,aGVHD)提供实验基础。方法:用免疫磁珠分选法从健康人外周血淋巴细胞中得到CD4+T细胞、CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+Treg细胞。分别进行长期培养、扩增;流式分析其表型及FOXP3表达,MTT法检测体外扩增的CD4+CD25+Treg对自体和异体的CD4+T细胞增殖的抑制作用。结果:经过3周培养,三组细胞均有明显的扩增。磁珠分选后的CD4+CD25+Treg细胞的扩增倍数为(20±8)倍,细胞纯度由89.28%±2.43%下降到76.36%±2.38%。CD4+CD25-T细胞组扩增迅速,倍数为(110±21)倍,并且CD4+CD25+Treg细胞的比例由培养前0.55%±0.27%增加到53.73%±3.81%。CD4+T细胞组扩增倍数为(89±8)倍,并且CD4+CD25+Treg细胞的比例由10.63%±3.87%增加到70.93%±1.71%。体外抑制实验显示体外扩增的CD4+CD25+T细胞对自体和异体的CD4+T细胞增殖均有明显的抑制作用,并且随着效靶比浓度的降低而降低。而且其各浓度梯度的抑制作用在自体和异体之间无明显的差异。结论:我们在体外成功扩增了CD4+CD25+Treg细胞,并且具有免疫抑制功能,其中CD4+T细胞组扩增倍数大,细胞数量多,细胞纯度有很大提高,方法简便,有望应用于临床试验。     

建立改良型人NK细胞体外扩增技术

目的建立一种改良型的NK细胞扩增技术。方法分离4名健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),采用工程细胞p APC-mb IL-21和IL-2对NK细胞进行体外扩增,应用细胞计数法和流式细胞术分别比较NK细胞的扩增倍数和NK细胞纯度,并采用CFSE/7-AAD法对肿瘤细胞K562和RPMI-8226进行细胞毒性实验检测杀伤效率。结果经过21 d的刺激培养,NK细胞平均扩增至409.4倍,细胞纯度最高可达95.86%。杀伤实验结果显示,扩增的NK细胞对K562细胞杀伤率高达85.2%。结论 p APC-mb IL-21工程细胞联合IL-2能够在体外高效的扩增出具有较高杀伤活性的NK细胞,可以为NK细胞免疫治疗奠定基础。     

添加细胞因子优化人外周血γδ T细胞的体外扩增培养体系

目的从添加细胞因子角度,优化用于肿瘤过继免疫治疗的γδ T细胞体外扩增培养方案。方法在固相化抗TCRγδ抗体加IL-2扩增人外周血γδ T细胞的体系基础上,添加其他的γ链受体家族细胞因子,包括IL-7、IL-15或IL-21,单独或联合使用、长期使用或短时添加,通过流式细胞术检测γδ T细胞纯度、细胞增殖及细胞毒活性相关分子的表达,计算γδ T细胞扩增效率;乳酸脱氢酶法检测γδ T细胞对人Burkitt's淋巴瘤细胞系Daudi的细胞毒活性。结果单独使用IL-7或IL-21不能有效扩增γδ T细胞,但单独使用IL-15可以使γδ T细胞纯度、扩增效率及细胞毒活性均达到与单独使用IL-2相当的水平;IL-2与IL-15联合使用,可促进γδ T细胞表达CD69,从而显著提高其扩增效率(P0.05);而IL-2与IL-21联合使用,可通过促进γδ T细胞颗粒酶A的表达,增强其对Daudi细胞的细胞毒活性(P0.001);IL-2、IL-15和IL-21联合使用可以显著提高γδ T细胞的细胞毒活性,但是会影响其扩增效率;而仅在效应前短时间添加IL-21,同样可以有效增强γδ T细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性(P0.05)。结论在用固相化TCRγδ抗体加IL-2体外扩增培养γδ T细胞体系中,使用IL-15,而在回输效应前短时间添加IL-21,显著提高γδ T细胞扩增效率及对肿瘤细胞的细胞毒活性,此为目前最优化的γδ T细胞体外扩增培养方案。     

雷帕霉素对人CD4~+CD25~+调节性T细胞体外扩增的影响

探讨有效的体外扩增人CD4~+CD25~+调节性T细胞(Treg)的方法以及雷帕霉素(rapamycin,RAPA)对人CD4~+CD25~+Treg细胞体外扩增的影响。采用免疫磁珠分离人外周血的CD4~+CD25~+Treg,并将实验分为3组:第1组在CD4~+CD25~+Treg培养体系中加入200 U/ml IL-2和包被CD3/CD28单克隆抗体的磁珠;第2组培养体系中除加入100 nmol/LRAPA以外,其余与第1组相同;第3组是CD4~+CD25~+Treg培养第12天后,将细胞进一步分选获取CD4~+CD25~+CD127~- Treg再继续培养,培养体系与第2组相同。实验结果显示,加RAPA培养的CD4~+CD25~+Treg细胞扩增效率比不加RAPA的低,但细胞的纯度明显提高(92%vs 65%)。而加RAPA培养的第2、3组CD4~+CD25~+Treg细胞在纯度上没有明显的差异。加RAPA培养的CD4~+CD25~+Treg细胞扩增后保持其无能状态。体外抑制实验显示体外扩增的CD4~+CD25~+Treg细胞对CD4~+效应T细胞增殖均有明显的抑制作用,而且加RAPA扩增的Treg细胞表现出更强的抑制功能。另外,与第1组体外扩增的Treg细胞相比,加RAPA扩增的Treg细胞表达低水平的IL-2和IFN-γ。实验证明雷帕霉素抑制了CD4~+ CD25~+Treg细胞中混杂的CD4~+效应T细胞的扩增,使用雷帕霉素可以提高体外扩增CD4~+CD25~+Treg细胞的纯度及其免疫抑制功能。     

抗原特异性细胞毒性T细胞体外扩增方法的研究近展

抗原特异性细胞毒性T细胞(cytoxicTlymphocytes,CTLs)在细胞免疫应答中起着重要的效应功能,从而在抗肿瘤和抗感染免疫中发挥着重要作用。由于受到各种因素的限制和影响,抗原特异性CTLs无法在体内有效地诱导和扩增,因此,通过体外诱导和扩增CTLs后再将此CTLs回输到体内是一个比较理想的方法,且具有重要的应用价值,如何高效激活和扩增抗原特异性CTLs是此法能否成功应用的关键。     

一种简单快速的γδT细胞扩增方法

建立一种特异快速地诱导扩增人外周血γδT细胞的方法。用 5～ 10ml外周血通过CD3细胞的富集、γδ单抗的诱导以及肿瘤细胞刺激的培养体系进行γδT细胞的体外扩增。结果显示 ,γδT细胞能在短时间内快速大量扩增到 10 9～ 10 10 的数量级 ;诱导 4周的CD8、γδ阳性的细胞百分率分别为 42 6 9%和 5 8 6 7% ,明显高于诱导前的 2 3 97%和 6 6 2 % ;γδT细胞对NK敏感的K5 6 2细胞和NK抵抗的Daudi细胞均有较高的杀伤活性 ;γδT细胞对经抗HSP单抗封闭后的Daudi细胞的杀伤率明显下降。该培养体系是一种用血量少、特异、经济、快速的人外周血γδT细胞体外扩增方法。     

用无血清培养基体外扩增CIK细胞的研究

ＣＩＫ (ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｄｋｉｌｌｅｒ)细胞是一类细胞因子诱导的杀伤细胞。ＣＩＫ细胞能大量扩增 ,而且具有比ＬＡＫ细胞更强的肿瘤杀伤活性。为了获得临床应用的ＣＩＫ细胞 ,必须用自身血浆或无血清培养取代传统的牛血清培养方式 ,以减少病人意外感染的机会。本实验对有血清和无血清培养条件下ＣＩＫ细胞的生物活性进行了研究。将人脐血用Ｆｉｃｏｌｌ密度梯度分离后得单个核细胞 (ＭＮＣ) ,ＭＮＣ分别用含胎牛血清或自身血浆的ＲＰＭＩ 16 40培养基、或ＡＩＭ Ⅴ无血清培养基进行培养。培养ＣＩＫ细胞时 ,先加ＩＦＮ γ …     

人类CD8+记忆T细胞体外扩增方法的研究

 目的： 研究体外扩增人类CD8+记忆T细胞的新方法,为抗病毒与抗肿瘤的过继性免疫治疗提供新的手段。方法：将anti-CD3抗体、anti-CD28抗体、CD70、白细胞介素（IL）-2、IL-7和IL-15进行排列组合,设计出63种刺激方式,对体外分离得到的正常人外周血CD8+ T细胞进行体外扩增;培养14 d后进行细胞计数,并检测CD8+ T细胞的纯度以及CD8+中枢记忆T细胞（TCM）和CD8+效应记忆T细胞（TEM）所占的比例,进而计算出CD8+ T细胞、CD8+ TCM和CD8+ TEM的体外扩增倍数,从而确定理想的刺激方法。结果：体外扩增CD8+ T细胞、CD8+ TCM和CD8+ TEM的理想刺激方式均为anti-CD3抗体、IL-2和IL-7三者的组合;该刺激方式使3种细胞在培养14 d后分别扩增了13.19、13.28和15.27倍。结论：Anti-CD3抗体、IL-2和IL-7三者的组合,是刺激人类CD8+记忆T细胞体外扩增的相对理想方法。     

早期作用造血因子对人脐血CD34^＋细胞的体外扩增作用

为了观察早期作用造血细胞因子ＳＣＦ、ＦＬ、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＴＰＯ单独及联合应用,对脐血ＣＤ３４＋细胞的体外扩增作用。我们用吸附单克隆抗体一磁珠分离系统富集人脐血ＣＤ３４＋细胞,在体外液体培养体系中加入不同的细胞因子扩增４周,每周取样计数有核细胞总数及集落形成细胞（ＣＦＣ）数。结果表明：用磁性细胞分离议富集脐血ＣＤ３４＋细胞纯度为８０％～８７％;一些细胞因子有明显的协同效应,其联合应用的扩增作用显著高于单因于作用：ＳＣＦ＋ＦＬ存在下,ＩＬ－３是有效扩增有核细胞总数及ＣＦＣ的关键因子了;细胞因子ＳＣＦ＋ＦＬ＋ＩＬ－３和ＳＣＦ＋ＦＬ＋ＩＬ－３＋ＩＬ－６组合对有核细胞总数及ＣＦＣ均有良好的扩增效应,培养２周时对ＣＦＣ的扩增倍数分别为３８．３±４．４和２９．６±２．７倍,可满足成人移植及基因治疗等的需要。     

人自然杀伤细胞体外活化扩增技术研究进展

自然杀伤细胞（NK）对不同来源的肿瘤细胞都具有很强的杀伤作用,在肿瘤的免疫治疗方面有着良好的应用和发展前景.因此在体外获得足够数量的高杀伤活性的NK细胞不但是研究NK细胞生物学特性的前提条件,同时也是将NK细胞应用到临床上的重要保证.了解人NK细胞活化扩增方法,以期达到临床治疗所需数量和杀伤活性,可为临床上应用NK细胞治疗肿瘤奠定了基础.     

γδ T细胞诱导与分化的初步研究-Ⅰ

目的:探讨在异戊烯焦磷酸(IPP)作用下,健康人外周血和新生儿脐带血中γδT细胞的增殖和亚型变化,以期获得足够的具有不同特征的γδT细胞用于后续的实验研究。方法:流式细胞术分析经IPP诱导的单个核细胞表面分子的表达状态,评估其γδT细胞的比例、亚型和表型格局。结果:健康人外周血和新生儿脐带血中γδT细胞数量虽占较低比例,但两者的γδT细胞存在显著异质性。健康人外周血γδT细胞主要以Vγ9Vδ2 TCR亚群为主;初始分选的外周血单个核细胞中Vγ9Vδ2T细胞主要为中央记忆型(CD27+CD45RA-)和效应记忆型(CD27-CD45RA-);IPP诱导后,γδT细胞显著扩增,Vγ9Vδ2 T细胞亚群转变为以效应记忆型为主,并高表达HLA-DR和B7分子。而新生儿脐带血来源的γδT细胞却呈现出较为复杂的亚群异质性,其Vγ9Vδ2 T细胞主要为CD27+CD45RA+的幼稚型细胞;经IPP诱导14天后,γδT细胞获得扩增(比例增高)且Vγ9Vδ2 T细胞趋向中央记忆型和效应记忆型分化,但仍以幼稚型为主。结论:健康人外周血和新生儿脐带血中γδT细胞在数量、亚群诸方面存在差异;IPP具有诱导和扩增外周血γδT细胞的生物学作用,而脐带血来源的γδT细胞还需相关细胞因子的协同作用,才能呈现出其分化成熟为可用于理论研究和临床实验的效应记忆型γδT细胞的潜能。关于其具有的免疫调节和效应功能将另文报道。     

人外周血自然杀伤T细胞体外扩增及其功能的初步研究

为了建立人自然杀伤T(NKT)细胞在体外扩增的方法并对其功能进行初步的研究,通过不同的方法从人外周血单个核细胞(MNC)和纯化T淋巴细胞中扩增TCRVα24+/Vβ11+NKT细胞,并采用流式细胞术测定NKT细胞中IL-4、IFN-γ、TNF-α分泌水平。采用CD4/CD8免疫磁珠去除CD4+和CD8+细胞进一步纯化NKT细胞,并用DIOC18染色及流式细胞术测定NKT细胞杀伤活性。α半乳糖神经酰胺(α-Galcer)和IL-2可以使NKT细胞在体外扩增。扩增19d后,TCRVα24+/Vβ11+细胞比率最高上升到25.5%±7.2%,NKT细胞最大扩增倍数达到(1.51±0.91)×104倍。体外扩增的NKT细胞高表达TCRVα24、Vβ11、CD3、CD161,低表达CD56。在CD3单克隆抗体和IL-2刺激下,TCRVβ11+细胞分泌IL-4和IFN-γ的细胞比例均高于TCRVβ11-细胞(P<0.05)。去除CD4+和CD8+细胞后NKT细胞含量上升到80%。NKT细胞对肿瘤细胞株U937和HL60以及树突状细胞具有较强的细胞毒效应。NKT细胞可以通过α-Galcer直接从人外周血MNC扩增获得,从而简化实验步骤。     

小鼠髓样抑制细胞体外扩增体系的建立

探讨体外诱导小鼠髓样抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)扩增的方法及影响因素。采用不同浓度的细胞因子刺激不同浓度的新鲜骨髓细胞(1×105/ml、2.5×105/ml、5×105/ml),置于37℃、5%CO2培养不同时间(0、2、4d),流式细胞术检测MDSC的比例,并计数MDSC的绝对数。结果发现,三种浓度细胞因子组合刺激组MDSC的比例均显著高于新鲜骨髓组和单独GM-CSF或IL-6刺激组(P<0.05),但三组间未见明显差异;培养4d的MDSC比例亦明显高于培养2d的比例(P<0.05);骨髓细胞浓度为2.5×105/ml组诱导的MDSC比例高于其他两个细胞浓度组(P均<0.05)。本研究成功建立体外扩增MDSC的体系,为研究MDSC在肿瘤、炎症等疾病中的免疫机制奠定了基础。