Cx43基因剔除小鼠心脏锥干部的异常发育

目的探讨Cx43基因缺陷小鼠心脏锥干部发育异常。方法选用胚胎（embryonic day,E）11．5d至出生后1dC57／BL6小鼠作为研究对象,根据基因型分为Cx43基因剔除纯合子（Cx43-／-）、杂合子（Cx43＋／-）及野生型（Cx43＋／＋）,采用聚合酶链反应方法鉴定基因型。免疫组化法测定横纹肌肌动蛋白α-SCA、平滑肌肌动蛋白α-SMA、神经嵴细胞的标志物AP-2α的表达;原位杂交方法检测AP-2α mRNA的表达。结果Cx43-/-出生后24h内即死亡。大体解剖见明显的右室流出道圆锥部异常膨隆。HE染色示右心室流出道壁大量异常小梁状组织增生突起,右室流出道腔明显狭窄。Cx43＋／-无明显异常。Cx43-／-近端流出道隔中央区域α-SCA的表达明显滞后。Cx43＋／-与Cx43-／-小鼠右室流出道与Cx43＋／＋比较可见比较强的α-SMA的表达,主要位于右侧锥干部的异常增生部位。Cx43-/-小鼠在E13．5流出道隔AP-2α蛋白及其mRNA水平表达均增多,且表达位置异常。结论Cx43 KO小鼠以右室流出道异常增生引起的梗阻性畸形为主要特征。Cx43 KO小鼠胚胎期近端流出道隔心肌化迟滞。Cx43 KO小鼠锥干部α-SMA的表达不能正常消退,心肌细胞发育不成熟。神经嵴细胞的发育异常可能参与了Cx43基因缺陷小鼠锥干部畸形的发病机制。     

连接蛋白43基因敲除小鼠胚胎心脏流出道组织中转录因子的表达及意义

目的 研究连接蛋白43（Cx43）基因敲除小鼠胚胎心脏近端流出道组织中转录因子的改变,从分子水平探讨Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏近端流出道发育异常的原因。方法 以胎龄13．5d和14．5d的Cx43基因敲除、Cx43杂合子和Cx43野生型鼠胚心脏近端流出道部分为研究对象。分别提取总RNA,反转录成cDNA;并在体外转录为cRNA,同时进行生物素标记及片段化;再与Affymetrix 4302．0小鼠全基因组芯片进行杂交。杂交信号经扫描后,应用相关生物信息软件分析基因表达情况。用实时定量逆转录（RT）PCR的方法对基因芯片筛选出的与心脏发育相关的部分转录因子进行验证。结果 与Cx43野生型组相比,Cx43基因敲除组表达差异的基因中,有6个是与心脏发育相关的转录因子。实时定量RT—PCR验证了其中3个基因：Soxll、Foxpl和Tbx20。在胎龄13．5d,Cx43基因敲除鼠胚Sox11、Foxp1的表达量均明显低于Cx43野生型组（4．76±0．19 vs 5．34±0．25,5．08±0．28 vs 5．64±0．15,均P〈0．01）;Tbx20在各组间差异不明显。胎龄14．5d,各基因Sox11、Foxp1以及Tbx20的表达量在基因敲除组均明显低于Cx43野生型组（4．71±0．27 vs 5．00±0．19,5．25±0．31 vs 5．77±0．16,7．05±0．17 vs 7．43±0．25,均P〈0．05）。其变化趋势与基因芯片结果基本一致。结论 心脏特异性的转录因子Foxp1、Sox11和Tbx20等的表达异常可能与Cx43基因敲除小鼠流出道的异常发育有关。     

圆锥动脉干畸形患者TBX1基因单倍型分析

目的检测分析单核苷酸多态（SNP）位点在圆锥动脉干畸形患者和正常人群中的分布情况,以及与所构成单倍型与圆锥动脉干畸形的相关性.方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法分析130例圆锥动脉干畸形患者及200名正常人3个SNP位点基因型;应用列联表法统计分析患者组和对照组各SNP位点基因型及等位基因频率;应用PHASE软件构建单倍型并统计分析患者组及对照组单倍型频率是否存在差异.结果 G2963A位点等位基因频率及基因型频率在患者组和对照组中的分布差异显著,患者组G等位基因频率明显高于对照组（χ^2=8.14, P〈0.005）;单倍型分析可见4种单倍型在患者组和对照组中的分布频率差异有统计学意义 （χ^2=22.39 P〈0.005）：G2857/G2963/A6571和G2857/G2963/T6571为人群中常见单倍型.患者组中G2857/G2963/A6571、C2857/A2963/T6571两种单倍型频率较对照组高.结论 TBX1基因编码区的SNP位点G2963A与圆锥动脉干畸形有明显的相关性,具有G等位基因的人发生圆锥动脉干畸形的危险性相对增高;3个SNP位点所构成的单倍型有一定意义,可能与圆锥动脉干畸形易感基因相连锁.     

不同先天性心脏病类型的环境危险因素分析

目的：探索不同类型先天性心脏病（congenital heart defects, CHD）的环境危险因素,为深入研究CHD表型的危险因素提供方向,为预防CHD积累证据。方法：使用广东省CHD监测网2004年至2012年登记的来自于17个地市、34家医疗机构的3 038例CHD活产儿及其1∶1对照儿数据,先后采用单因素分析、多因素条件Logistic回归,分析6类CHD的环境危险因素。结果：左向右分流类CHD的危险因素包括低出生体重（OR=2.63,95%CI：2.04~3.39）或巨大儿（OR=2.21,95%CI：1.47~3.32）,早产（OR=1.95,95%CI:1.53~2.49）,多胎（OR=1.99,95%CI： 1.22~3.26）,产母教育程度低、产母为工厂工人（OR=1.62,95%CI:1.32~1.98）,产次≥2（OR=1.38,95%CI:1.13~1.69）,有异常生育史（OR=2.29,95%CI： 1.75~3.01）,孕早期3个月曾有发烧（OR=2.38,95%CI： 1.26~4.48）,病毒感染（OR=1.80,95%CI： 1.29~2.51）,使用药物（OR=1.73,95%CI： 1.11~2.69）,被动吸烟（OR=1.69,95%CI： 1.26~2.29）,接触化学制剂（OR=8.71,95%CI： 2.33~32.58）,居住装修6个月内的居室（OR=2.56,95%CI： 1.60~4.09）或居室距主要马路<50 m（OR=1.40,95%CI： 1.14~1.72）,父亲为工厂工人（OR=1.46,95%CI： 1.23~1.73）。肺动脉流出道梗阻类CHD的危险因素包括活产儿低出生体重（OR=5.98,95%CI： 2.88~12.44）或巨大儿（OR=6.56,95%CI： 1.19~36.26）,产母教育程度低、产次≥2（OR=2.08,95%CI： 1.03~4.22）,孕早期病毒感染（OR=4.30,95%CI： 1.27~13.45）。左心室流出道梗阻类CHD危险因素为父亲为工厂工人（OR=6.01,95%CI： 1.05~34.59）。大动脉转位（transposition of the great arteries, TGA）的危险因素包括活产儿低出生体重（OR=12.93,95%CI： 1.14~146.26）,产母教育程度低、职业为工厂工人（OR=3.69,95%CI： 1.53~8.91）。合并心内分流型CHD的危险因素包括产次=2（OR=3.45,95%CI： 1.42~8.38）。其他类CHD的危险因素包括巨大儿（OR=4.87,95%CI： 1.19~19.94）、产母既往有异常生育史（OR=2.96,95%CI： 1.14~7.68）、孕早期3个月有病毒感染（OR=4.92,95%CI： 1.56~15.47）、用药（OR=4.90,95%CI： 1.22~19.77）、被动吸烟（OR=10.31,95%CI: 1.25~85.05）。结论：不同CHD类的危险因素存在差异,深入研究CHD的相关环境危险因素及其影响机制需有针对性,预防CHD需特别注意避免影响多类CHD或临床治疗效果较差CHD类的环境危险因素暴露,并加强已暴露人群的产前检查。     

复合姑息手术治疗肺动脉发育不良型先天性心脏病

目的 探讨复合姑息手术治疗合并难治性肺动脉发育不良的肺血减少型复杂先天性心脏病(先心病)临床经验.方法 对自2001年8月至2009年9月我院外科治疗的31例合并难治性肺动脉发育不良的肺血减少型复杂先心病患儿进行回顾性分析,其中合并室间隔缺损的肺动脉闭锁26例,其他合并肺动脉狭窄的复杂先心病5例.根据两侧肺动脉发育情况选择2种或2种以上的姑息手术:一侧肺动脉发育良好者行格林(Glenn)术;肺动脉发育较差者常规行改良Blalock-Taussig分流或改良Waterston分流术;肺动脉极度发育不良者采用改良Melbourne分流.对合并的粗大体肺侧支血管者行肺动脉融合或侧支血管结扎及封堵术.两侧均行体肺分流23例;一侧行体肺分流,另一侧行Glenn者8例.结果 术后早期1例死于心跳骤停,早期死亡率为3.2%,术后并发症包括低心排综合征5例,灌注肺3例,肺部感染3例.3例因分流管道堵塞而再次行分流手术.平均随访(25±16)(6～72)个月,与术前比较,左肺动脉指数(14.9±6.2比8.1±3.7)、右肺动脉指数(17.7±7.8比12.7±8.1)和肺动脉指数(32.6±11.7比20.9±9.4)均显著提高,差异均有统计学意义(均P＜0.001),与术前比较,Blalock-Taussig分流术(7.0±2.0比5.5±1.0)、改良Waterston分流术(9.2±3.6比5.7±4.0)和Melbourne分流术(7.4±2.5比2.2±0.4)术后肺动脉直径均增加,差异均有统计学意义(均P＜0.05),两侧肺动脉均明显发育,血红蛋白浓度和末梢血氧饱和度分布由术前的(194±27)g/L和(65±11)%改善至(174±24)g/L(P＜0.05)和(84±6)%(P＜0.001).4例肺动脉发育良好,已行二期矫治手术,另1例术后2年完成了二期Glenn手术.结论 对合并难治性肺动脉发育不良的肺血减少型复杂先心病,外科治疗应遵循个性化原则,不管是作为根治手术前的过渡治疗,还是最终治疗,复合姑息手术都是值得推荐的一种术式选择.     

Mutations of connexin43 in fetuses with congenital heart malformations

Background Gap junction channels formed by connexin43 (Cx43) protein are important in cardiac morphogenesis, and Cx43 gene is thought to be associated with congenital heart malformation (CHM). This study was undertaken to detect the mutations of Cx43 in fetuses with CHM.Methods Cx43 extron DNA was amplified by PCR from 16 fetuses with a variety of CHM. The PCR products were analyzed by SSCP and DNA sequencing. Thirty children who had no CHM were selected as controls.Results Eight homozygous mutations of Cx43 were observed in a fetus with double outlet right ventricule (DORV) , fiveof the 8 mutations were missense mutations including Arg239Trp, Ser251Thr, Ala253Pro,Pro283Leu and Thr290Asn, and the remaining 3 were silent polymorphisms including Gly252Gly,Pro256Pro and Thr275Thr.No mutations were found in other fetuses and the control group.Conclusions Mutations of Cx43 may be associated with congenital conotruncal anomalies. PCR-SSCP is an effective method for screening the mutations of Cx43.     

大鼠胚胎心脏的发育过程及基因HCY-2在大鼠胚胎心脏内的表达

目的 研究大鼠胚胎心脏的发育过程和同型半胱氨酸诱导基因(HCY-2)在大鼠胚胎心脏上的表达，为进一步探讨该基因与心血管疾病之间的关系奠定形态学基础。方法 分别于大鼠妊娠11～19d取胚胎，用组织学和免疫组织化学方法，观察大鼠胚胎心脏的发育过程和Hcy-2基因的表达并进行图像分析。结果 大鼠胚胎心脏11d出现第一房间隔，13d出现第二房间隔，14d心房不完全分隔完成；12d出现室间隔肌部，16d心室巳分隔完成。Hcy-2在大鼠胚胎心脏不同发育时期表达不同，11、12d表达强，13d表达减弱，14、15、16d表达又逐渐增强，17、18、19d表达强。结论 大鼠胚胎心脏内部分隔晚于小鼠；基因Hcy-2与心脏发育密切相关。     

自体心包同时扩大肺动脉瓣环与瓣膜技术重建右室流出道的临床研究

目的探讨自体心包同时扩大肺动脉瓣环与瓣膜的跨环补片技术在右心室流出道（RVOT）重建术中的应用价值。方法采用心包片扩大原有的瓣叶、瓣环或重建新的瓣叶2种技术,对32例先天性心脏病病人行RVOT重建手术。包括法洛四联症24例,右心室双出口法四型5例,重度肺动脉狭窄3例。结果本组手术死亡1例,术后其他并发症6例治愈。31例随访4～40个月,心功能Ⅰ～Ⅱ级,肺动脉瓣功能良好;无或微量肺动脉瓣返流17例、轻度12例、中度2例。无需再次手术病人。结论自体心包同时扩大肺动脉瓣环与瓣膜技术重建RVOT的近、中期效果良好,远期效果有待于观察。     

连接蛋白40、45在连接蛋白43基因敲除小鼠胚胎心脏的时空表达

目的 检测连接蛋白(Cx)40、45在Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏的时空表达.方法 选取Cx43基因敲除胎鼠,通过PCR方法鉴定其基因型,以Cx43基因敲除胎鼠纯合子作为研究对象,野生型为对照组,获取胎龄10.5、11.5、12.5、13.5、14.5、15.5 d纯合子及野生型各2只胎鼠,免疫组化检测Cx40、Cx45在心脏各部位的表达,SCIM显微图像分析系统对染色强度进行定量分析.结果 (1)野生型小鼠心室原始小梁网在胎龄10.5 d就已经有Cx40表达(A值为8.6),随后在心房、心室、小梁网、房室间隔和主、肺动脉壁表达逐日增加,胎龄14.5 d在心室部位达到高峰(A值为94.8),然后逐渐减少;Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏发育中Cx40在各部位的时空表达趋势与野生型相似,胎龄10.5 d在肌小梁A值为7.9,胎龄14.5 d心室部位为75.8.纯合基因敲除型胎鼠Cx40的表达量明显弱于野生型.(2)野生型小鼠肌小梁部在胎龄10.5 d出现Cx45的表达(A值为20.0),随后在房室各部位相继表达,胎龄12.5 d在心房部位达到高峰(A值为49.6),然后表达逐渐减少;Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏发育中Cx45在各部位的时空表达趋势与野生型相似,胎龄10.5 d在肌小梁A值为17.8,胎龄12.5 d心房部位为31.5.纯合基因敲除型胎鼠Cx45的表达量明显弱于野生型.结论 Cx40和Cx45在Cx43基因敲除小鼠纯合子胎龄10.5～15.5 d这一心脏分隔、瓣膜发育的关键时期表达异常,可能与Cx43基因敲除小鼠心脏的异常发育有关.     

Bmpr2在Cx43基因敲除胎鼠心脏近端流出道隔心肌化过程中的表达

目的 探讨心脏近端流出道隔心肌化的分子机制及其对胎鼠心脏圆锥动脉干畸形(CTD)的影响.方法 以胎龄11.5～16.5 d的连接蛋白43(Cx43)基因敲除(Cx43KO)纯合型(Cx43-/-)、杂合型(Cx43+/-)和野生型(Cx43+/+)胎鼠胚胎作为研究对象,采用PCR方法鉴定其基因型,免疫组织化学法测定骨形成蛋白Ⅱ型受体(Bmpr2)和α横纹肌肌动蛋白(α-SCA)的表达.结果 Cx43KO鼠胚心脏近端流出道隔心肌化细胞明显减少,尤其以胎龄13.5和14.5 d的Cx43-/-为著.胎龄11.5～13.5 d,Cx43+/+胎鼠心脏的心房、心外膜均有Bmpr2表达,心室肌也有微弱的表达;Cx43+/-和Cx43-/-胎鼠心脏仅心房和心外膜区有Bmpr2的微弱表达.胎龄14.5～16.5 d,Cx43+/+胎鼠心脏的心房、心外膜、心内膜、小梁、心室肌及流出道隔已心肌化区域均有Bmpr2表达,流出道隔未心肌化区域Bmpr2未见表达,与α-SCA表达一致;胎龄14.5 d的Cx43+/-和Cx43-/-胎鼠心脏的心房、心外膜、心内膜、小梁均有Bmpr2表达,而心室肌、流出道膈未见Bmpr2表达;胎龄15.5与16.5 d的Cx43+/-和Cx43-/-胎鼠心脏的心房、心外膜、心内膜、小梁、心室肌及流出道隔已心肌化区域均有Bmpr2表达,而且Bmpr2在流出道膈未心肌化区域部分表达.结论 Cx43KO胎鼠心脏近端流出道隔存在明显心肌化延迟.Bmpr2很可能涉及心外膜和心肌细胞相互作用的分子机制,参与心肌细胞的成熟过程.

Abstract：

Objective To investigate the mechanism of myocardialization of proximal outflow tract septum and its effect on the conotruncal anomaly in mice. Methods The C57/BL6 mice of embryonic day (E) 1 1. 5 - 16. 5 were selected. The phenotypes of connexin 43 ( Cx43 ) homozygotes ( Cx43 -/- ),heterozygotes (Cx43+/-) and wild-types (Cx43+/+) were genetically typed by polymerase chain reaction (PCR). Bone morphogenetic protein receptor 2 (Bmpr2) and α-sarcomeric acti (α-SCA) were detected by immunohistochemistry. Results The expression of α-SCA in the proximal outflow tract (OFT) septum was delayed obviously in Cx43 -/- predominantly at E13.5 and E14. 5. From E11. 5 to E13. 5, the expression of Bmpr2 was detected in cardiac atrium and epicardium of Cx43+/+ fetal heart. And Bmpr2 was slightly expressed in ventricular muscle of Cx43 +/+ fetal heart. And it was expressed slightly only in cardiac atrium and epicardium of Cx43 +/- and Cx43 -/- fetal heart. From E14. 5 to E16. 5, its expression was detected obviously in cardiac atrium, epicardium, endocardium, trabeculum, ventricular muscle and OFT septum of Cx43 +/+ fetal heart. At E14. 5, its expression was detected obviously in cardiac atrium, epicardium,endocardium and trabeculum of Cx43 +/- and Cx43 -/- fetal heart while none in ventricular muscle and OFT septum. At E15.5 and E16.5, its expression was detected obviously in cardiac atrium, epicardium,endocardium, trabeculum, ventricular muscle and OFT septum of Cx43 +/- and Cx43-/- fetal heart. Its expression was also detected obviously in OFT septum of Cx43 +/- and Cx43 -/- fetal heart with incompleted myocardialization. Conclusion Cx43KO embryonic mice exhibit delayed myocardialization. As compared with the Cx43 +/+, the expression of Bmpr2 in proximal OFT septum was delayed obviously in Cx43 +/- and Cx43 -/- mice. And the expression of Bmpr2 is abnormal in OFT septum of Cx43 +/- and Cx43 -/- fetal heart. Bmpr2 may be involved in the interaction between epicardium and myocardium. It may be a critical mechanism in the maturation process of cardiac muscles.