重组酶介导扩增技术快速检测食品中单核细胞增生李斯特菌

目的建立重组酶介导扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)快速检测单核细胞增生李斯特菌的方法。方法以单核细胞增生李斯特菌的hlyA基因作为靶序列,设计引物和探针,通过构建含目的基因片段的重组质粒,评价RAA方法的灵敏度,通过检测沙门氏菌核酸、金黄色葡萄球菌核酸、副溶血性弧菌核酸、溶血性链球菌核酸、志贺氏菌核酸基因组DNA,评价其特异性。结果建立的RAA方法可在39℃、20 min内,检测重组质粒中hlyA基因片段,最低可检出的质粒拷贝数为10拷贝/反应,且与沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、溶血性链球菌、志贺氏菌基因组DNA无交叉反应。结论建立的RAA方法具有灵敏度高和特异性强的特点,可用于单核细胞增生李斯特菌的快速检测。     

RPA等温扩增技术检测副溶血性弧菌

目的:建立副溶血性弧菌的RPA-exo荧光探针快速检测方法。方法:采用重组酶聚合酶扩增技术,以irgB为靶基因设计副溶血性弧菌的RPA-exo引物探针,对引物探针进行组合筛选,建立RPA-exo荧光探针快速检测方法,并对其特异性、灵敏度、模拟污染实验及实际应用效果进行测试。结果:建立的方法15 min可获得结果,具有高特异性,无交叉反应;灵敏度为1.0×103 CFU/mL,DNA检测限为0.35 pg/μL,质粒检测限为1×103 copies/μL;模拟污染实验中加入终浓度为1.36×103 CFU/mL时,无需增菌即可被检出;实际样品检测中,10份水产品,有3份样品被检出,检测结果与国标GB 4789.7-2013结果一致。结论:本研究成功建立了副溶血性弧菌的RPA-exo快速检测方法。     

实时荧光跨越式滚环等温扩增结合PMA检测虾产品中的活副溶血性弧菌

目的：为快速检测虾产品中的活副溶血性弧菌,建立一种实时荧光跨越式滚环等温扩增（real-time fluorescent saltatory rolling circle amplification,RF-SRCA）与叠氮溴化丙锭（propidium monoazide,PMA）染料相结合的检测方法。方法：依据副溶血性弧菌的特异性基因toxR设计并筛选引物,对PMA-RF-SRCA检测方法进行特异性、灵敏度及检出限分析,并与PMA-实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,real-time PCR）方法进行对比。对76 份样品进行检测,以GB 4789.7—2013方法为标准,对PMA-RF-SRCA方法的相对敏感性、相对特异性、相对符合率进行计算,以对本方法的实用性进行评估。结果：此方法的引物特异性良好,12?株副溶血性弧菌结果均呈阳性,18?株非副溶血性弧菌结果均呈阴性;PMA-RF-SRCA法灵敏度为3.2×100?CFU/mL,检出限为2.08×101?CFU/g,此方法的灵敏度是PMA-real-time PCR的100?倍。经过实际样品检测,PMA-RF-SRCA方法的敏感性、特异性、符合率分别为100.00%、96.00%和98.68%。结论：PMA-RF-SRCA方法特异性强、灵敏度高,可用于虾产品中的活副溶血性弧菌的检测与筛查。     

食品中副溶血性弧菌toxR和tdh基因双色荧光PCR检测方法的建立

目的 建立对副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）特异性检测toxR（跨膜转录激活蛋白）基因和tdh（热稳定性直接溶血素）毒力基因的Taqman探针双色荧光PCR检测方法。方法 根据副溶血性弧菌toxR基因和tdh基因,分别设计引物和探针,建立Taqman探针双色荧光PCR扩增体系,进行特异性、灵敏度试验;对副溶血性弧菌分离菌株实施检测,了解其tdh基因和tdh基因分布情况。结果 结果表明,副溶血性弧菌标准菌株和3株从食物中毒患者中分离获得的分离株均出现toxR基因和tdh扩增曲线,而溶藻弧菌、单增李斯特菌等31株弧菌属其他菌株和肠杆菌科的菌株未见扩增曲线。从食品中分离的37株副溶血性弧菌分离株均未携带tdh毒力基因。副溶血性弧菌检测灵敏度可达到3.6×102 cfu/mL。结论 该方法可用于同时检测食品中副溶血性弧菌的特异性和毒力基因。     

环介导恒温扩增技术可视化检测携带tdh基因的致病性副溶血性弧菌

建立了环介导恒温扩增技术检测携带tdh基因的致病性副溶血性弧菌。基于副溶血性弧菌高度保守的tdh基因序列,设计了6条特异性引物,两条外引物F3、B3,两条内引物FIP、BIP及两条环引物LF、LB。在Bst DNA Polymerase作用下,60℃恒温水浴进行扩增。对10种细菌共21株菌进行LAMP扩增,所试6株副溶血性弧菌均为阳性,说明引物具有高度特异性。本LAMP方法对纯培养物的灵敏度可达到9.42cfu/m L。对污染食品中副溶血性弧菌的灵敏度为25.3cfu/25g,40~60min内即可完成检测。本方法操作简便、特异性强、灵敏度高,可以为临床提供简单、快速、高灵敏度和高特异性的检测应用。     

基于荧光探针重组酶介导等温扩增技术快速检测食源性单增李斯特菌方法的建立

目的：建立一种基于荧光探针重组酶介导等温核酸扩增(Recombinant Enzyme Mediated Isothermal Nucleic Acid Amplification,RAA)技术的快速检测食源性单增李斯特菌的方法。方法：针对单增李斯特菌hlyA基因的保守序列设计特异性引物和探针,通过构建含hlyA靶基因片段的重组质粒和不同浓度单增李斯特菌核酸,评价其灵敏度;通过检测大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等菌液核酸,评价其特异性。结果：所建立的荧光RAA法可在39℃、20 min内完成样本核酸的检测。采用所建立的方法对质粒和核酸进行检测,质粒最低检出限为1 copy/μL,菌液核酸最低检测限为103 CFU·mL^-1,且与其他菌株核酸无交叉反应。结论：成功建立了一种基于荧光RAA法的单增李斯特菌核酸检测方法,该方法具有特异性强和快速的特点,可用于疑似污染单增李斯特菌食品的快速检测。     

水产品中副溶血性弧菌特异性二重PCR检测方法的研究

建立快速检测水产品中副溶血性弧菌(Vibrio parahae-molyticus)的二重PCR方法.以副溶血性弧菌特异性基因tlh和toxR为靶基因,选择2对引物,对5株副溶血性孤菌和40株非副溶血性弧菌进行特异性检测;梯度稀释副溶血性弧菌基因组DNA,以不同稀释度DNA作PCR扩增;在鱼肉样品中以不同菌量人工污染,不同增菌时间培养,提取DNA进行PCR扩增;应用该方法对实际样品进行检测.以tlh和toxR为靶基因的两对引物对副溶血性弧菌的检出有很好的特异性.PCR检测的灵敏度在DNA水平上达到28.76 pg;人工污染样品,当起始污染量为1 CFU/mL时,37℃增菌培养10 h即可检出.本试验一共检测了21份水产品样品,有14份检出了副溶血性弧菌.     

实时荧光PCR方法检测副溶血性弧菌的研究

建立了一种快速检测副溶血性弧菌（vibrio parahaemolyticus,VP）的荧光PCR（Real time polymerase chain re-action）方法。首先,从GenBank中获得副溶血性弧菌种特异性基因不耐热溶血毒素基因tl和直接耐热溶血素毒素基因tdh,用Primer Express2.0设计引物和Taqman荧光探针,在Roche荧光PCR上进行荧光PCR扩增,荧光曲线表明该荧光PCR可特异性地检测副溶血性弧菌,而大肠杆菌等其他14种细菌和空白对照都是阴性;检测方法灵敏度达10cfu/reaction。本研究建立的荧光PCR检测副溶血性弧菌的方法快速、特异性强,灵敏度高,稳定性好,可检测出总的和带tdh毒力基因的副溶血性弧菌,适合于大批量样品的检验,可广泛用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。     

重组酶介导等温扩增法检测食品中铜绿假单胞菌

目的 建立重组酶介导等温扩增（Recombinase-aided amplification,RAA）法,快速、灵敏、特异检测食品中铜绿假单胞菌的分析方法。方法 针对铜绿假单胞菌lasB基因的特异性保守区域,设计RAA特异性引物和exo探针,筛选出最优组合;对提取的目标基因组DNA进行检测,确定方法的特异性和灵敏度,并通过人工污染实验,比对不同检测方法对食品样品的检出限。结果 建立的铜绿假单胞菌lasB基因RAA检测方法特异性良好,仅对铜绿假单胞菌有扩增曲线,对其他致病菌无交叉反应;方法对纯菌液的灵敏度为1.7 pg/μL。人工污染实验表明,方法对肉类样品中铜绿假单胞菌的检出限与传统方法一致,达1.0×103 CFU/mL;RAA方法检测时间仅需20min。结论 本研究建立的铜绿假单胞菌实时荧光RAA检测方法特异性强、灵敏度高、反应时间短,可用于食品中铜绿假单胞菌的快速检测。     

多重重组酶介导等温扩增技术检测食品中3种食源性致病菌

建立快速、灵敏的多重重组酶介导等温扩增方法（recombinase aided amplification,RAA）同时检测食品中的大肠埃希氏菌O157:H7、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。方法 根据大肠埃希氏菌O157:H7的rfbE基因、沙门氏菌的invA基因以及金黄色葡萄球菌的nuc基因的序列保守区域设计RAA特异性引物,筛选出最优的引物组合并优化各项实验条件;通过标准菌株验证方法特异性和灵敏度,并通过人工污染实验,验证方法在实际食品样本中的检测能力。结果 多重RAA方法最佳扩增温度为37℃,反应时间为50 min;方法特异性良好,仅对目标菌株存在特异性扩增条带,与其他常见食源性致病菌无交叉反应;方法对基因组DNA的检测灵敏度为0.10 ng/μL;方法对经过简单增菌的人工污染牛奶样本和牛肉干样本中目标菌株的检出限为100 CFU/mL。结论 本研究建立的多重RAA扩增方法具有特异性好、灵敏度高、检测通量高等优势,适用于多种场景下食品样本中3种食源性致病菌的快速检测。     

副溶血性弧菌微滴数字PCR定量方法的建立

目的:采用微滴式数字PCR技术(Droplet digital PCR,ddPCR),建立副溶血性弧菌快速定量检测。方法:以副溶血性弧菌TLH基因为靶基因,验证确定ddPCR方法的特异性及定量检测的线性范围,以常检出副溶血性弧菌的海产品鳕鱼为样品进行阳性添加,确定方法的可行性。结果:本试验中采用ddPCR检测得到副溶血性弧菌特异性好,有效基因组DNA浓度范围为2~19440拷贝/20μL,分析得菌悬液浓度为50~4.86×105 CFU/mL,与3M测试片所得菌悬液浓度无显著性差异(p>0.05),与荧光PCR相比,可以进行更低浓度检测且能准确定量。结论:副溶血性弧菌ddPCR定量检测技术特异性良好、灵敏度高、结果准确,具有实际应用价值。     

基于近红外免疫层析技术的食源性副溶血弧菌快速检测方法研究

建立一种应用近红外荧光免疫层析技术快速检测副溶血弧菌的方法。采用近红外荧光标记副溶血弧菌单克隆抗体,将副溶血弧菌多克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体喷涂于硝酸纤维膜上分别作为检测线和质控线,研制检测副溶血弧菌的近红外免疫层析试纸条及配套标准物质。研究表明,所建立的近红外免疫法对检测副溶血弧菌具有良好的特异性和较高的灵敏度,最低检测限为1.2×10~2 CFU/mL,与沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌无交叉反应。通过效果评价试验发现,与传统检测方法相比较,所建立的近红外荧光法检测时间时间最短,检测限与RT-PCR法接近。近红外荧光法在45 min内即可完成检测,可用于食品中副溶血弧菌的高效检测,为食品安全监管提供可靠的技术支持。     

基于blaCARB-17和toxR基因的副溶血弧菌双重PCR检测方法的建立

建立一种针对副溶血弧菌bla_CARB-17和toxR基因的双重PCR检测方法。按照副溶血弧菌的bla_CARB-17和toxR基因序列设计并合成引物,于同一反应体系中进行PCR扩增,优化退火温度、退火时间和引物比例,确定双重PCR的特异性和灵敏性,最后用实验室分离鉴定的副溶血弧菌分离株验证。结果表明:建立的双重PCR最佳退火条件是52℃ 30 s,引物比例1:1,在同一体系中特异地扩增出副溶血弧菌的bla_CARB-17和toxR基因的303、350 bp片段,其它对照菌株均无扩增,表明该方法特异性良好。双重PCR的最低检测限达1×102 CFU/mL,对实验室鉴定的56个副溶血弧菌分离株验证均为阳性。建立的双重PCR方法操作简单、高效快速、特异性强,适用于副溶血弧菌的检测。     

两种致病性弧菌二重LAMP-熔解曲线检测方法的建立

应用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立了食品中产毒素性霍乱弧菌和副溶血性弧菌二重LAMP-熔解曲线快速检测方法。本方法针对产毒素性霍乱弧菌ctx A基因和副溶血性弧菌gyr B基因分别设计引物组进行二重LAMP扩增,并利用熔解曲线法分析扩增产物,从而判断DNA模板中所含目标菌。应用本方法对9株目标菌和17株非目标菌的检测结果与预期一致,并可通过熔解曲线的特征峰准确分析DNA模板中所含目标菌。对二重LAMP扩增产物的测序分析表明,扩增所得序列与目的基因序列吻合,从而进一步验证了该方法的特异性。经测试,本方法对两种目标菌的检测灵敏度均可达100 fg DNA/反应管。实验证明所建立的方法具有良好的特异性,并可为食品中两种致病性弧菌的快速检测提供一种重要技术手段。     

巢式PCR快速检测海产品中的副溶血弧菌

副溶血弧菌是一种世界范围性的食源性致病菌,食用了该菌污染的海产品可导致胃肠炎等疾病。为了建立一种可快速、特异地检测海产品中副溶血弧菌的方法,通过把副溶血弧菌基因组序列和其它不同种类弧菌的基因组序列进行比较分析,筛选出了一个副溶血弧菌特异性的标记基因-VP1331,根据该基因建立了副溶血弧菌的巢式PCR快速检测方法,并评估了其特异性、敏感性和稳定性。实验结果表明,该方法只有在以副溶血弧菌基因组DNA为模板时才能扩增出目的片段,而其它11种弧菌和非弧菌均不能扩增出目的片段。该方法的最低检测限为副溶血弧菌基因组DNA 10 fg、纯培养物6.6 CFU。人工污染实验表明,初始菌液浓度为25.7 CFU/100 mL时只需经过2 h的增菌培养即可检出。上述结果表明,VP1331基因可以作为副溶血弧菌种特异性标记,本方法可以用于污染海产品中该菌的检测与鉴定。     

高分辨率熔解曲线分析法检测食源性副溶血性弧菌

为建立一种快速鉴定副溶血性弧茵的HRM（高分辨率熔解曲线）real-timePCR法,以toxR为靶基因,结合特异性引物,通过优化反应体系及条件,进行特异性、敏感性及重复性评价,并初步应用于90份送检的鲜活海产品样本的检测。特异性试睑表明,该方法能选择性检测副溶血弧菌,Tm值为76．64±0．57℃;而与创伤弧菌、霍乱弧茵、金黄色葡萄球菌等多种海产品中常见的食源性病原菌没有交叉反应。灵敏度试验表明,该方法最少可检测toxR重组质粒的浓度为3．50×102copies／mL。重复性试验表明,同一样品于试验内及试验问的平均Tm值分别为76．53±0．35℃和76．74±0．52℃,变异系数分别为0．56±0．42％和1．11±0．73％。对90份鲜活海产品样本的检测证实该法可使阳性检出率从国标法的14．44%高至18．89％。本研究所建立的副溶血性弧菌HRMreal-ILrnePCR法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,能应用于食品样本的检测,具有很好的研究价值和应用前景。     

水产品中副溶血性弧菌实时荧光PCR检测方法

建立了一种特异、灵敏、稳定的副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus,VP)致病基因的检测方法。对已建立的副溶血性弧菌致病基因tdh、trh和tlh荧光PCR方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测,以验证该方法的有效性。该方法与副溶血性弧菌反应良好,与其他弧菌属和非弧菌属的6株常见食源性致病菌无交叉反应;检测了6株副溶血性弧菌标准菌株和分离株,3种致病基因检出限分别为tlh 6～43 CFU/mL,tdh 97～1 700 CFU/mL,trh 1 100～4 000 CFU/mL;3种致病基因20次重复组内变异系数在0.96%～1.50%,组间变异系数在2.70%～4.10%。该方法操作简便,特异性强,灵敏度高,能够准确、快速、灵敏地检测水产品中副溶血性弧菌。