厚壳贻贝一种新型贝壳胶原蛋白的重组表达与功能分析

贝壳是一种具有优异力学性能的生物硬组织,贝壳基质蛋白质对贝壳的形成具有重要意义。厚壳贻贝(Mytilus coruscus)贝壳中发现一种类似胶原蛋白质的新型贝壳基质蛋白质,命名为collagen-like protein 2（CLP-2）。然而,该蛋白质的结构与功能以及对贝壳形成的影响机制尚不清楚。为此,本研究对CLP 2开展了序列分析;进一步采取密码子优化结合原核重组表达策略,开展了CLP-2的重组表达;在此基础上分析了重组CLP-2对酸钙结晶的诱导、结晶速率抑制以及碳酸钙结合能力。对CLP-2的序列分析结果表明,该蛋白质序列中含有信号肽及两个Von Willebrand factor A（VWA）结构域。CLP-2在数据库中尚无高同源性蛋白质存在,表明这是一种较为新颖的贝壳基质蛋白。所获得的重组CLP-2对碳酸钙体外结晶表现出明显的诱导作用,扫描电镜以及傅里叶红外光谱结果表明,重组CLP-2可诱导碳酸钙晶体的形貌由立方体形转化为球形,并在高浓度下进一步转化为哑铃形;同时,重组CLP-2可促使碳酸钙晶体的晶型由方解石型向文石型转化;重组CLP-2在体外具有碳酸钙晶体结合作用;此外,重组CLP-2能显著抑制碳酸钙晶体的结晶速度（P<0.01）,并具有浓度依赖性。上述结果表明,厚壳贻贝贝壳CLP-2蛋白质在贝壳,特别是文石型肌棱柱层的生物矿化过程中具有重要作用。上述研究为深入了解贻贝贝壳的形成机制,以及胶原类蛋白质对生物矿化过程的影响奠定了基础。     

翡翠贻贝外套膜转录组及贝壳珍珠质层和肌棱柱层蛋白质组分析

贝类贝壳在生物材料学及仿生学研究中占据着重要地位。贝壳基质蛋白质是贝壳中的主要有机质成分,对贝壳的形成以及贝壳的力学性能至关重要。翡翠贻贝(Perna viridis)贝壳主要由肌棱柱层和珍珠质层两种微观结构组成,其结构层次较简单,是研究贝壳基质蛋白质及其与贝壳形成关系的极好材料。为深入研究翡翠贻贝贝壳基质蛋白质的分子组成以及分布特点,首先采用扫描电子显微镜,观察翡翠贻贝贝壳内表面珍珠质层和肌棱柱层的微观结构;采用刮取法获得贝壳内表面珍珠质层和肌棱柱层的粉末;对不同层次的贝壳粉末,利用酸溶法去除碳酸钙成分,所获得的有机质组分通过离心将其分为酸可溶性组分和酸不溶性组分。采用Illumina深度测序技术对翡翠贻贝外套膜组织进行大规模测序和序列组装,在此基础上,采用LC-MS/MS质谱技术结合外套膜转录组数据库搜索,对翡翠贻贝肌棱柱层和珍珠质层贝壳基质蛋白质开展组学分析。扫描电镜观察结果表明,翡翠贻贝贝壳有两种不同形貌结构的层次,其中珍珠质层为片状堆叠结构,而肌棱柱层为柱状结构。翡翠贻贝外套膜转录组测序共计获得 69 859 条Unigene。蛋白质组学鉴定结果表明,翡翠贻贝贝壳中总计鉴定到蛋白质54种,其中38种为肌棱柱层所特有蛋白质,3种珍珠质层特有蛋白质,另有13种在珍珠质层和肌棱柱层均被鉴定到。肌棱柱层特有蛋白质的分子多样性明显强于珍珠质层。上述研究为进一步探讨贝壳不同微观层次的形成机制,以及贝壳基质蛋白质对贝壳不同结构层次的调控作用机制奠定了基础。     

壳损伤及海水酸化对厚壳贻贝脲酶和碳酸酐酶的影响

海洋酸化是当前全球面临的最为紧迫的环境问题之一,已显现出对具生物矿化现象物种的严重影响。以往研究发现,贻贝表现出对海洋酸化较强的耐受性。为探究贻贝对海洋酸化耐受性的可能机制,选择两种对生物矿化具有重要影响的酶(碳酸酐酶和脲酶)为研究对象,分析其在壳损伤以及酸化海水条件下基因表达量和酶活力的变化;进一步对上述条件下的贻贝贝壳内表面开展了显微观察。研究结果表明,相比对照组,壳损伤或酸化海水处理诱导碳酸酐酶和脲酶的基因表达量产生不同程度的上调(P<0.05),酶活力测试与基因表达量分析结果具有类似特征,但存在时序性差异。而壳损伤叠加海水酸化处理则诱导碳酸酐酶和脲酶的基因表达量及酶活性在外套膜中均明显下调(P<0.05),但碳酸酐酶在血细胞中明显上调(P<0.05);在酸化海水中添加尿素则明显上调血细胞和外套膜中碳酸酐酶和脲酶的基因表达量以及酶活性(P<0.05)。贝壳内表面显微观察结果进一步表明,海水酸化及壳损伤导致损伤部位附近的贝壳内表面产生明显纹理质地改变,尿素可诱导海水酸化条件下壳损伤部位修复层的重新出现。上述结果表明,碳酸酐酶和脲酶可能参与了对壳损伤修复及海洋...     

厚壳贻贝足丝黏附蛋白mfp-3的重组表达及黏附功能分析

厚壳贻贝（Mytilus coruscus）中富含各种黏附蛋白分子,其中贻贝足丝蛋白3（mussel foot protein-3, mfp-3）是贻贝用以与外界基质进行黏附的主要蛋白分子.贻贝足丝中天然的mfp-3的含量低,水溶性差,因此纯化困难.本文以厚壳贻贝足丝蛋白mfp-3的cDNA序列为目的基因,用PCR法扩增Mfp-3基因,并成功构建含有多聚组氨酸标签的重组mfp-3原核表达载体pET-21a/ Mfp-3.经IPTG（isopropylthio-β-D-galactoside）诱导表达出重组蛋白,利用亲和层析和反相高效液相色谱分离纯化,获得分子量为9.18 kD的重组蛋白.经酪氨酸酶催化、玻璃包被和石英晶体微天平（quartz crystal microbalance,QCM）分析.结果表明,重组厚壳贻贝mfp-3蛋白经酪氨酸酶催化后,L-3,4-二羟基苯丙氨酸(即多巴,L-3,4- dihydroxyphenylalanine, DOPA) 含量较高并且具有较好的黏附性能.上述研究为开发以mfp-3黏附蛋白为来源的生物粘合剂奠定了良好的基础.     

贝壳的有机质及生物矿化机制分析

以腹足纲贝壳香螺壳为研究对象,用弱酸去钙法进行蛋白提取,采用280纳米(A280)光吸收法测定蛋白含量,并通过聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳法对蛋白按照分子量大小的区别进行分离.实验结果表明香螺壳中蛋白含量和种类较少,其文石层比方解石层蛋白含量高的多,总量分别为0.89%和0.0533%;文石层分离出五种分子量的可溶性蛋白和四种分子量的不可溶性蛋白;而方解石层中分离出三种分子量的可溶性蛋白和三种分子量的不可溶性蛋白,且分子量不相同.正是这少量的蛋白质对贝壳的生物矿化过程和不同晶型的形成起着决定性作用.     

厚壳贻贝粘附蛋白十肽重复序列的表达及功能分析

利用PCR扩增Mcfp-1(M.coruscus foot protein-1)基因的12个十肽重复序列粘附功能片段(Mcfp-11～12)并连接到pGEX-4T1表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达.纯化的多肽产物经凝血酶处理切除GST标签,获得Mcfp-11～12功能肽段,最后用酪氨酸酶对该产物进行修饰.通过材料表面包被、石英晶体微天平(QCM,quartz crystalmicro balance)分析、细胞粘附和细胞毒性等实验,研究了该表达产物作为生物粘合剂的粘附特性.结果显示,重组表达产物Mcfp-11～12在多种材料表面的包被能力与Cell-TakTM(天然提取的贻贝粘附蛋白混合物)相当,甚至更佳;对细胞的粘附能力与Cell-TakTM相当;用HeLa细胞和293T细胞进行的MTT实验未发现细胞毒性.上述结果表明,Mcfp-11～12作为生物医用粘合剂具有潜在应用价值;同时,基因重组技术可以为制备新型海洋贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂提供有效的手段.本研究为临床使用更优质的生物医用粘合剂提供了理论依据.     

厚壳贻贝鸟氨酸-尿素循环中的关键代谢物及基因分析

鸟氨酸-尿素循环(OUC)是生物新陈代谢过程中的重要循环过程,但在贝类中尚缺乏相关研究。为此,以厚壳贻贝为研究对象,分别采用氨基酸分析仪和荧光定量PCR研究了其外套膜和后闭壳肌组织中的鸟氨酸-尿素循环途径的主要代谢物和关键基因的含量及其表达量;进一步测试了在精氨酸注射条件下,各主要代谢物和关键基因的含量及表达量变化,以及¹³C标记尿素注射贻贝后,其贝壳中δ¹³C比值(¹³C/¹²C)变化。结果表明,厚壳贻贝外套膜和后闭壳肌均含有较高浓度的尿素;精氨酸注射导致其两种组织中尿素浓度显著上升(P<0.01),以及瓜氨酸浓度显著下降(P<0.01),但鸟氨酸浓度维持相对稳定的水平。精氨酸注射显著上调了两种组织中的脲酶基因的表达量(P<0.01),但其他基因表达量的变化在两种组织中存在差异,显示出鸟氨酸-尿素循环途径在其两种组织中具有复杂而不同的调控过程。¹³C标记尿素注射贻贝显著上调了贝壳中δ¹³C的比值(P <0.01),表明尿素分子可能参与了贻贝贝壳的生物矿化过程。上述研究为深入了解贻贝鸟氨酸-尿素途径与生物矿化之间的关联,以及探讨贻贝对海水酸化耐受性的内在分子机制奠定了基础。     

厚壳贻贝足丝盘黏附蛋白mcofp-3的重组真核表达

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)黏附蛋白分子mcofp-3(M.coruscusfoot protein-3)主要分布于贻贝足丝盘,贻贝在水环境下的黏附过程中起到关键作用,但因其难溶于水且在贻贝足丝盘中含量极低,故妨碍了对其进行深入研究。为建立厚壳贻贝足丝蛋白mcofp-3的真核表达体系,并获得足够的mcofp-3黏附蛋白进行后续研究,采用酵母表达体系对mcofp-3进行了重组表达。通过PCR方法克隆厚壳贻贝的mcofp-3基因,构建mcofp-3的酵母真核表达载体pVT102U/α/mcofp-3,鉴定结果表明,重组表达质粒pVT102U/α/mcofp-3由真核载体pVT102U/α和mcofp-3的成熟肽DNA片段组成,插入的mcofp-3成熟肽DNA片段与预期序列完全一致;采用LiAC转化法将重组表达质粒转化到S78酿酒酵母中,经过RT-PCR分析以及1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,结果表明,重组的mcofp-3得到了成功的转录;发酵菌液经阳离子交换柱及高效液相色谱分离,以及Tris-Tricine-SDS-PAGE检测,结果表明,重组的厚壳贻贝黏附蛋白分子mcofp-3得到了成功表达,表达...     

人源CBX7功能结构域的重组表达与纯化

CBX7(chromobox 7)在细胞寿命延长和癌症发生中起着重要的调控作用。然而,获取足量的全长CBX7蛋白并用于结构研究极为艰难。实验阐述了CBX7功能结构域CBX7(aa 145～227)重组表达载体构建的详细过程。同时,通过Ni-NTA亲和层析对融合目的蛋白进行了纯化,并利用SDS-PAGE及Western-blot进行了鉴定分析。纯化后的融合蛋白样品通过离子交换和分子筛层析进一步分离剩余杂质。本实验得到的高浓度CBX7蛋白可用于结晶,为后续CBX7的结构和功能研究奠定了基础。     

翡翠贻贝壳长与体重关系的研究

本实验研究了翡翠贻贝（Ｐｅｒｎａｖｉｒｉｄｉｓ）的壳长Ｌ（ｃｍ）与整体湿重Ｗ（ｇ）、贝壳干重Ｓ（ｇ）、软体组织干重Ｔ（ｇ）三者之间的关系。结果表明,采自中科院南海海洋研究所海洋生物综合实验站（ＭＢＲＳ）（东山）的贻贝符合关系式：Ｗ＝０．１１２４８８×Ｌ２．７００３８,Ｓ＝０．０４４１６０６×Ｌ２．７１５８３,Ｔ＝０．００３７２４４３×Ｌ２．５２８６;采自惠阳县大亚湾水产资源增殖站（澳头）的贻贝则符合：Ｗ＝０．１６１７９４×Ｌ２．５１５８,Ｓ＝０．０６２２１６３×Ｌ２．５４６３４,Ｔ＝０．０１０４６１×Ｌ２．１３９９４。从两个地点采集的贻贝之间的差别,可解释为营养条件的差异     

多功能的胞内衔接蛋白syntenin

Syntenin蛋白是在原核生物及真核生物中广泛存在的一类胞内衔接蛋白（adaptor proteins）. Syntenin由N端结构域（N-terminal domain,NTD）、两个串联的PDZ结构域(postsynaptic density protein, disc large and zonula occludens, PDZ)和C端结构域（C-terminal domain,CTD）组成,在生物进化过程中相对保守. Syntenin蛋白的PDZ结构域可与不同膜受体C端的PDZ结合基序（PDZ-binding motif,PBM）特异性结合, PDZ结构域结合受体的多样性导致了syntenin功能的多样性. 本文综述了syntenin蛋白的发现与分布及其结构特征,对syntenin在肿瘤转移、细胞质膜蛋白组装、参与动物免疫等领域的研究成果进行了较为详细的综述,同时介绍了syntenin在参与动物胚胎发育调控、血管生成和轴突生长等方面的研究进展.     

Characterization of a novel shell matrix protein with vWA domain from Mytilus coruscus

ABSTRACT

Mollusk shell is a product of biomineralization with excellent mechanical properties, and the shell matrix proteins (SMPs) have important functions in shell formation. A vWA domain-containing protein (VDCP) was identified from the shell of Mytilus coruscus as a novel shell matrix protein. The VDCP gene is expressed at a high level in specific locations in the mantle and adductor muscle. Recombinant VDCP (rVDCP) showed abilities to alter the morphology of both calcite and aragonite, induce the polymorph change of calcite, bind calcite, and decrease the crystallization rate of calcite. In addition, immunohistochemistry analyses revealed the specific location of VDCP in the mantle, the adductor muscle, and the myostracum layer of the shell. Furthermore, a pull-down analysis revealed eight protein interaction partners of VDCP in shell matrices and provided a possible protein–protein interaction network of VDCP in the shell.     

厚壳贻贝粘附蛋白十肽重复序列的表达及应用

 利用PCR扩增 Mcfp-1（M. coruscus foot protein-1）基因的12个十肽重复序列粘附功能片段（Mcfp~1 1~12）并连接到pGEX-4T1表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达.纯化的多肽产物经凝血酶处理切除GST标签,获得Mcfp-1 1~12功能肽段,最后用酪氨酸酶对该产物进行修饰.通过材料表面包被、石英晶体微天平（QCM, quartz crystal microbalance）分析、细胞粘附和细胞毒性等实验,研究了该表达产物作为生物粘合剂的粘附特性.结果显示,重组表达产物Mcfp-1 1~12在多种材料表面的包被能力与Cell-TakTM（天然提取的贻贝粘附蛋白混合物）相当,甚至更佳;对细胞的粘附能力与Cell-TakTM相当;用HeLa细胞和293T细胞进行的MTT实验未发现细胞毒性.上述结果表明,Mcfp-1 1~12作为生物医用粘合剂具有潜在应用价值;同时,基因重组技术可以为制备新型海洋贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂提供有效的手段.本研究为临床使用更优质的生物医用粘合剂提供了理论依据.     

一种新型贻贝足丝抗氧化蛋白的原核重组表达及功能

贻贝足丝及其足丝蛋白相关研究对于开发新型水下生物粘附剂具有重要的仿生学意义。足丝蛋白在其粘附过程中需要维持一定的还原态,而目前已报道的足丝抗氧化蛋白仅有MFP-6。此前在厚壳贻贝足丝中鉴定到一种新型的富含半胱氨酸和甘氨酸的足丝蛋白质,该蛋白质被命名为Cys/Gly-Rich-Protein（CGRP）,但是CGRP蛋白在足丝中的作用及机制尚不明确。为此,针对CGRP蛋白,在序列分析基础上,利用原核重组表达手段获得其重组蛋白质,采用2,2-联苯基-1-苦基肼基（2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl radical,DPPH）法检测CGRP重组蛋白经不同条件处理后的抗氧化活性。序列分析结果表明,CGRP蛋白含16.5%的半胱氨酸和10%的甘氨酸,其序列中含有两段半胱氨酸位置保守的重复序列,结构预测表明,其优势构象以无规卷曲为主。同源蛋白质搜索结果表明,CGRP蛋白在数据库中尚无高同源性蛋白质存在。通过密码子优化结合原核重组表达策略成功表达出CGRP重组蛋白,所获得的CGRP重组蛋白具有明显的抗氧化活性,且该活性在其半胱氨酸还原后显著增强(0.91±0.05 vs 0.71±0.11, P<0.01)而在半胱氨酸烷基化之后显著下降(0.08±0.03 vs 0.71±0.11, P<0.01),表明CGRP蛋白的抗氧化活性与其序列中半胱氨酸的自由巯基有关。本研究提示,CGRP蛋白是足丝中一种新的具有抗氧化功能的蛋白质,在足丝粘附过程中推测与MFP-6一起参与了富含多巴的足丝粘附蛋白的还原态维持,对贻贝足丝在固化和粘附过程中防止提前粘附具有重要意义。     

利用蛋白质组学手段鉴定新型贻贝足丝蛋白

贻贝通过足腺分泌特有的足丝并以此粘附于水下各种基质表面.贻贝足丝中富含各种粘附蛋白,其优异的水下粘附性能使其成为开发新型生物粘合剂的候选分子.厚壳贻贝足丝粘附能力强,本文采用尿素及盐酸胍抽提结合二维双向电泳技术（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）,分别对厚壳贻贝足丝纤维和足丝盘的蛋白质进行分离及染色;采用串联质谱技术结合常规搜库和表达序列标签（EST) 数据库搜索,对分离获得的蛋白质点进行鉴定,从中获得了mfp-3、mfp-6、胶原蛋白以及3种未曾报道过的新型贻贝足丝蛋白成分.上述研究为深入了解厚壳贻贝足丝蛋白的分子多样性、探讨其粘附机理以及从中筛选具有应用前景的贻贝足丝蛋白奠定了基础.     

登革病毒四型联合重组包膜蛋白III区的表达和免疫原性鉴定

登革热在全球范围内广泛流行,但是目前为止却仍然没有疫苗上市,疫苗的开发迫在眉睫。抗体依赖增强感染效应是登革病毒疫苗开发中遇到的一个瓶颈问题。研究表明登革病毒的包膜蛋白III区能够介导中和抗体产生,且诱导产生较少的交叉抗体或无交叉抗体,能够大大减弱抗体依赖增强感染效应,因而是登革热重组蛋白疫苗的首选靶标。通过酵母密码子优化后合成同时包含4种血清型登革病毒包膜蛋白III区的四价联合DV EDIII蛋白序列,随后构建酵母表达质粒,并获得酵母表达菌株,经诱导后四联DV EDIII蛋白获得高效表达。通过Western blot、ELISA检测及蛋白质免疫原性鉴定,结果表明登革病毒四联DV EDIII蛋白表达质粒构建成功,重组蛋白在毕赤酵母获得高效表达,免疫小鼠后能够介导产生较高水平的血清效价。这表明已获得了能引起有效免疫反应的四型登革病毒EDIII蛋白,为登革病毒疫苗的研究提供了良好的基础。     

Functional Similarities of Recombinant OLP and Cytokinin-Binding Protein 2

CBP1 and CBP2 are cytokinin-binding proteins isolated from tobacco callus. In particularly, CBP2 is a 26-kDa protein with high affinity (Kd=1.08×10^-6M) for cytokinin[Kobayashi et al. Plant Cell Physiol. 41(2): 148-157 (2000)] and the N-terminal amino acid analysis of CBP2 showed high sequence homology (92.9%) to tobacco osmotin-like protein (OLP). To compare the properties of OLP and CBP2, recombinant OLP was purified, and binding to benzyladenine (BA) was examined. The inclusion bodies of recombinant OLP were solubilized in 8 M urea and purified on an SP-Sepharose column. SDS-PAGE analysis of the purified recombinant OLP revealed a single band of 26 kDa. The Kd of solublized recombinant OLP to BA obtained from a Scachard plot was 1.10×10^-6M, which was similar to the Kd of CBP2 to BA (1.08×10^-6M).