登革2型病毒非结构蛋白NS4B的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的：原核表达、纯化登革2型病毒非结构蛋白NS4B,并制备其多克隆抗体,以研究其结构与功能。方法：扩增编码登革2型病毒NS4B的24-238位氨基酸残基的基因序列,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达;采用蛋白浸提方法从SDS-PAGE胶中回收融合蛋白;用纯化后的融合蛋白免疫BALB／c鼠制备多克隆抗体,采用间接免疫荧光法检测抗体效价。结果：原核表达了NS4B-GST融合蛋白,并获得了其多克隆抗体,抗体效价为1：800。结论：登革2型病毒NS4B的24-238位氨基酸残基可诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,这为研究NS4B的结构与功能奠定了基础。     

寨卡病毒囊膜E蛋白的原核表达及其抗体制备

目的:在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达寨卡病毒(ZIKV)囊膜(E)蛋白的200个氨基酸(138～338)截短片段ZIKV-E~(200),制备其多克隆抗体,为寨卡病毒亚单位疫苗后续研究提供检测抗体。方法:用全基因序列合成方法合成寨卡病毒E蛋白全长基因,以该基因为模板,用PCR方法克隆ZIKV-E~(200)基因片段,经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后连接到pET22b载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒pET22b-ZIKV-E~(200),将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞得到重组表达菌株pET22b-ZIKV-E~(200)。将37℃诱导表达后的菌液超声波破碎处理后制备ZIKV-E~(200)蛋白,将制备的抗原ZIKV-E~(200)免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后,采集血清制备其相应的多克隆抗体,采用Western印迹检测多克隆抗体的特异性。结果:获得ZIKV-E~(200)基因片段,并构建了其相应的原核表达载体pET22b-ZIKV-E~(200),在大肠杆菌中表达了重组ZIKV-E~(200)蛋白,其相对分子质量约为25 000,与理论值一致;用分离的蛋白ZIKV-E~(200)免疫小鼠后获得了抗ZIKV-E蛋白的多克隆抗体,该多克隆抗体检测到了酵母表达的寨卡病毒E蛋白。结论:ZIKV-E~(200)蛋白的多克隆抗体可用于酵母表达的寨卡病毒E蛋白的检测等研究。     

人免疫缺陷病毒I型Vif蛋白的原核表达、纯化及单克隆抗体制备

目的：克隆、表达、纯化人免疫缺陷病毒I型（HIV-1）Vif蛋白,制备其单克隆抗体。方法：提取感染了HIV的细胞基因组DNA,PCR扩增vif基因,插入表达载体pET32a,转化大肠杆菌BL21（DE3）获得工程菌株,IPTG诱导蛋白表达,Western印迹鉴定目的蛋白,亲和层析纯化目的蛋白;免疫BALB／c小鼠,制备单克隆抗体。结果：构建了Vif蛋白的原核表达载体vif-pET32a,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以包涵体形式存在;纯化获得高纯度的重组Vif蛋白,蛋白浓度可达0．56mg／mL;建立了抗Vif蛋白单克隆抗体细胞株,制备了腹水,滴度可达1：16×10^6,抗体纯化后保持了活性和特异性。结论：在原核表达系统中表达、纯化了重组Vif蛋白,制备了针对Vif蛋白的单克隆抗体,为研究Vif蛋白的功能和抗原性奠定了基础。     

寨卡病毒NS1的结构研究进展及其应用

寨卡病毒感染与小头畸形和神经系统并发症紧密相关,甚至可能损伤男性生殖系统,引起了全球性的关注,研究其结构和致病机制以及开发有效的诊断治疗方法成为当务之急。寨卡病毒的非结构蛋白NS1是病毒与宿主相互作用的重要蛋白,在病毒复制、发病机制及免疫逃逸中起着关键作用。本文总结了寨卡病毒NS1的空间精细结构,并将其与其它黄病毒NS1进行比较。本文也分析了寨卡病毒基于NS1的致病机理,总结了NS1在疾病诊断中的应用。     

EpCAM蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备

目的:原核表达EpCAM蛋白并制备抗EpCAM特异性单克隆抗体,初步鉴定相应单克隆抗体的特性。方法:PCR扩增EpCAM基因胞外区,将目的基因亚克隆至载体pET-28a(+),转化至大肠埃希菌株BL21,IPTG诱导表达,组氨酸亲和层析法纯化表达产物。纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,将成功免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合,经ELISA筛选得到分泌特异性抗EpCAM的单克隆抗体的细胞株,免疫BALB/c小鼠进一步制备相应的单克隆抗体,并通过Western blot(蛋白质印记)和FACS(流式细胞分析)鉴定单抗的特异性及生物学活性。结果:成功构建重组表达载体pET28a-EpCAM并在大肠杆菌中获得表达,经His-tag亲和层析法获得纯化的EpCAM重组蛋白。EpCAM重组蛋白免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合、筛选,获得两株稳定分泌EpCAM抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4B2、2F2并免疫BALB/c小鼠获得相应的单克隆抗体。Western blot结果显示4B2腹水纯化所得单抗能够识别FaDu细胞系(人咽鳞癌细胞)中的EpCAM蛋白,但2F2未能识别FaDu细胞中的变性的EpCAM蛋白。FACS结果显示两者均能和FaDu细胞中天然的EpCAM蛋白结合。讨论:成功制备了抗EpCAM的单克隆抗体,并能够识别人咽鳞癌细胞系FaDu中表达的EpCAM,为进一步研究EpCAM抗体在肿瘤治疗中的作用提供基础。     

寨卡病毒非结构蛋白研究进展

自2015年巴西确诊首个寨卡病毒感染病例以来,该病毒在全球范围内迅速蔓延,引发了大规模疫情。寨卡病毒感染不仅会导致新生儿小头畸形,还会引起格林-巴利综合征,后者是一种严重的神经系统疾病,可以导致患者瘫痪乃至死亡。但是目前并没有特异性的疫苗或药物可以用于阻断寨卡病毒的感染。近几年来,寨卡病毒在复制传播过程中多个关键蛋白的结构逐步得到解析,在一定程度上为其致病机制的阐释提供了理论基础,并对特异性药物设计具有一定指导意义。主要对寨卡病毒多个非结构蛋白的三维空间结构研究进展及其抑制剂研发的主要方向进行了综述,以期为药物靶点的分析筛选及抗病毒药物的开发设计提供参考。     

抗丙肝病毒NS5蛋白单克隆抗体的研制及鉴定

用基因重组的丙肝病毒 ＮＳ５蛋白免疫Ｂａｌ ｂ／ｃ ／小鼠,制备免疫脾Ｂ淋巴细胞,与小鼠骨髓瘤Ｓｐ２／０细胞系融合,筛选获得了１株能分泌抗 ＮＳ５蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,该株单克隆抗体为 ＩｇＧ１。ＥＬＩＳＡ及 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ证实该株单抗对 ＮＳ５蛋白有较好的特异性。     

寨卡病毒和寨卡病毒病

寨卡病毒自1947年首次在乌干达被发现以来,已经在非洲、东南亚和美洲等地造成多次暴发流行,且在中国已有输入性寨卡病毒感染病例的报道。寨卡病毒为黄病毒科黄病毒属,存在非洲型和亚洲型两个亚型。寨卡病毒主要依赖感染病毒的伊蚊类蚊媒叮咬传播,也可通过母婴传播以及血液和性传播。寨卡病毒感染人体后经血播散并可跨越血脑屏障进入中枢神经系统,患者一般临床症状较轻,但有可能出现格林巴利综合症,婴儿小头畸形也与寨卡病毒感染孕妇有关。寨卡病毒的实验室诊断主要包括核酸检测、血清学检测和病毒分离。目前尚无有效疫苗预防寨卡病毒感染,主要预防措施包括防蚊控蚊和提高个人防护意识,并在重点地区加强病例监测。     

金属离子激活寨卡病毒NS3解旋酶的分子机制

正自2015年寨卡病毒在巴西大规模暴发以来,寨卡病毒的传播呈现上升态势,并不断向亚洲地区扩散,各国科学家紧锣密鼓地展开了对寨卡病毒发病机制的研究.目前,人们已经成功解析出寨卡病毒颗粒以及数个病毒蛋白的三维结构,并对其不同结构组分进行了深入的研究.最新一项来自中国科学技术大学金腾川团队的研究,在寨卡病毒NS3解旋酶结构和机理方而取得了重要突破,相关结果在线发表于《核酸研究》(Nucleic Acids Research)~[1].寨卡病毒是黄病毒科的一种虫媒病毒,病毒基因组由单股正链RNA构成,分别编码3个结构蛋白     

CD14蛋白表达、纯化及单克隆抗体制备

摘要 目的：制备CD14重组蛋白及抗CD14单克隆抗体。方法：从人外周血淋巴细胞中克隆CD14编码基因,将其连接至质粒pRSETC,构建表达质粒pRSETC/CD14,转染大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),筛选阳性克隆、用IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测CD14蛋白表达水平,应用镍柱进行亲和纯化,SDS-PAGE及Western blot进行纯化产物鉴定。纯化后的CD14蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术筛选分泌单克隆抗体细胞株,制备单克隆抗体,利用Western blot鉴定抗体活性。结果：获得CD14编码基因,并成功进行了原核表达,SDS-PAGE显示CD14以包涵体形式表达,纯化产物的纯度超过95%。利用杂交瘤技术筛选出稳定分泌抗CD14抗体的细胞株,并制备了高纯度的单克隆抗体,抗体具有CD14蛋白结合活性。结论：成功表达纯化了CD14蛋白,并制备了抗CD14单克隆抗体,为后续开发CD14检测技术提供抗体。     

丙型肝炎病毒NS3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

提高对丙型肝炎患者实验室检测的灵敏度和特异性,对相关人群进行筛查和早期诊断,是控制丙型肝炎病毒(HCV)流行与传播的有效措施。为了建立更为可靠的HCV诊断方法,通过采用PCR方法从J6/JFH12a型病毒中克隆出HCV ns3基因片段,将其连接到p ET-28a载体上,重组载体p ET-28a-ns3转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达,以10%SDS-PAGE进行鉴定,获得表达的NS3重组蛋白分子量为72 k Da。将纯化的NS3蛋白免疫BALB/c小鼠,第4次免疫后采集血液并分离血清进行抗体活性鉴定,小鼠抗体效价为1∶256 000。进一步的Western blotting和间接免疫荧光结果显示,以重组NS3蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体可以很好地识别HCV感染Huh7.5.1细胞中的NS3蛋白,为下一步开展单克隆抗体制备和检测试剂盒研制工作奠定了基础。     

人巨细胞病毒gH蛋白表达及其单克隆抗体的制备

人巨细胞病毒(HCMV)是全球范围内普遍感染的一种疱疹病毒,也是引起胎儿先天性畸形和器官移植受者死亡最常见的病原体。有研究表明,gH蛋白是HCMV主要的中和性抗原,特异性抗gH抗体具有中和HCMV及阻断病毒在细胞间传播的潜力。本研究以含人巨细胞病毒临床株Toledo全基因组的细菌人工染色体(BAC)为模板,扩增去除信号肽和跨膜区的gH基因片段,并将其插入表达载体构建pET32a'-gH重组表达质粒,将序列鉴定正确的重组质粒转化进入表达菌株TransB,诱导重组蛋白表达。用纯化的重组gH蛋白免疫8周龄BALB/c雄鼠,经杂交瘤技术获得5株稳定分泌抗gH单克隆抗体的细胞株,分别命名为8A9、8B4、8C4、8D9、8D12。所获5株单克隆抗体对gH蛋白均具有良好的反应性,其中8A9、8B4、8D9和8D12具有一定的病毒捕获能力,且8D9和8D12的捕获能力较强。本研究获得了具有自主知识产权的抗gH单克隆抗体,抗体具有良好的病毒捕获能力。在此基础上,我们将进一步鉴定其是否为中和抗体,为今后开发治疗HCMV感染的中和抗体奠定基础。     

寨卡病毒蛋白结构与功能研究进展

2015年以来,南美暴发大规模寨卡疫情,因其与新生儿小头症等严重神经发育疾病密切相关,被世界卫生组织列为国际关注的突发公共卫生事件。与其他虫媒黄病毒类似,寨卡病毒为单股正链RNA病毒,其基因组编码的3种结构蛋白构成病毒颗粒,7种非结构蛋白参与病毒复制生活周期的调控。在全球科学家的共同努力下,寨卡病毒蛋白结构与功能的研究取得了突破性进展,极大地促进研究者对病毒复制与致病机制的认识,也为疫苗和药物研发提供了重要科学依据和潜在靶标。本文将对寨卡病毒蛋白的结构与功能的最新研究进展作一综述,并讨论当前面临的挑战和机遇。     

寨卡病毒研究进展

寨卡病毒(zikavirus,ZIKV)发现距今已有70多年。早期的患者临床症状较轻,通常为自限性疾病。近年来,由于基因突变使ZIKV致病力逐渐增强,导致严重的神经系统并发症,引起了人们普遍关注。目前,全球尚无针对性的疫苗和药物,ZIKV的暴发、流行已经成为全球公共卫生问题。为了有效防控ZIKV感染,许多国家和地区加快了对ZIKV的研究,并取得了一定的成果,现就ZIKV的生物学特征、流行特点、致病机制及防控措施等作一概述。     

用单克隆抗体纯化血浆蛋白排除病毒污染物

<正>血友病A和B是威胁生命失调的遗传性疾病,它们分别由于血浆凝血因子Ⅷ和Ⅸ缺乏所致。用从人血浆中分离的这些组分浓缩物治疗对于患者的保护起着十分重要的作用。Pool等人的发现是一个重要的突破。即治疗制品可用冰冻血浆和收集沉淀物以及融化沉淀的上清液制备。由此方法制备的浓缩物是现时适用的许多治疗制品的基础。然而,自从1964年的这种发现,制品纯度的改善是迟缓的。     

TT病毒重组蛋白单克隆抗体的制备

采用杂交瘤技术,获得了4株稳定分泌抗TTV重组蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,1株属IgG2bλ链、1株属IgG1κ链、2株属IgG2aκ链。4株杂交瘤细胞培养上清液效价为1：80-1：1280,腹水效价为1：32万-1：160万。     

寨卡病毒及其与宿主蛋白相互作用研究进展

寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)作为一种新出现的蚊媒病原体,与成人格林-巴利综合征(Guillain–Barré syndrome,GBS)、新生儿小头畸形以及神经系统缺陷等疾病有关。2016年世界卫生组织将寨卡疫情列为国际关注的公共卫生突发事件,近年来关于ZIKV病原学、流行病学、感染与致病、抗病毒免疫应答、疫苗与药物的研究越来越多,为有效防控该病提供了理论依据和具体实践。本文就ZIKV蛋白组成及相应功能、感染周期、ZIKV受体及ZIKV-宿主相互作用等的最新研究进展进行综述,旨在正确认识和深入理解ZIKV致病与机体抗病相关机制,为设计有效的预防或治疗疫苗或药物提供参考资料。     

鸡贫血病毒衣壳蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

利用PCR技术,以pPrpo-VP1为模板扩增得到鸡贫血病毒的衣壳蛋白基因(VP1),以T4多聚核苷酸激酶磷酸化处理、纯化后,克隆至表达载体pET-30a( )中,从而构建了原核表达质粒pET30-VP1。将pET30-VP1转化至感受态细胞E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析,可见约45kDa的目的蛋白获得表达。该蛋白经亲和层析纯化后,免疫6-8w的雌性Balb/c鼠,三次免疫后,采血分离血清,制得抗VP1的多克隆血清。以纯化的VP1为包被抗原,用ELISA方法检测,制备的血清效价达12800×以上。以Westernblot检测,该血清可与目的蛋白发生特异性反应,证明其具有良好的免疫原性。VP1蛋白的成功表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究VP1蛋白的功能及开展CAV疫苗及诊断制剂的研制奠定了基础。