HIV多表位核酸疫苗构建及其免疫原性

目的设计新型HIV复合多表位疫苗,并检测其在小鼠体内的免疫效果。方法检索抗原表位数据库,进行新型HIV多表位核酸疫苗的设计,利用化学合成的方法合成多表位基因,并构建重组质粒pVAX1-MEGNp24,转染BHK-21细胞,间接免疫荧光法检测多表位基因的表达。重组质粒免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测抗体动态变化,流式细胞仪检测脾T淋巴细胞亚类。结果重组质粒pVAX1-MEGNp24经酶切及测序分析,证明构建正确。间接免疫荧光显示能在BHK-21细胞中表达多表位基因。免疫小鼠可诱导小鼠特异性体液免疫和细胞免疫。结论已成功构建了重组质粒pVAX1-MEGNp24,小鼠免疫试验显示其具有良好的免疫原性。     

口蹄疫病毒多价DNA疫苗的构建及其免疫原性

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)多价DNA疫苗,并检测其免疫原性。方法以复合多表位表达盒OAAT及AsiaⅠ型FMDV的P1-2A-3C基因为基础,构建FMDV多价DNA疫苗pIRES-OAAT-P1-2A-3C,并用间接免疫荧光(IFA)方法检测目的蛋白在HeLa细胞中的表达。进一步进行小鼠免疫试验,并应用ELISA法检测小鼠血清抗体,ELISPOT检测小鼠脾淋巴单细胞IFN-γ的分泌水平,流式细胞术检测脾T淋巴细胞亚群数量,淋巴细胞转化试验检测特异性淋巴细胞增殖水平。结果所构建的FMDV多价DNA疫苗在HeLa细胞中获得了正确表达。免疫小鼠后,血清特异性抗体水平、脾淋巴单细胞IFN-γ的分泌、脾T淋巴细胞亚群CD4+和CD8+的数量及特异性淋巴细胞增殖水平均显著提高。结论已成功构建了FMDV多价DNA疫苗,并诱导小鼠产生了特异性的细胞免疫和体液免疫应答。     

Asia 1型FMDV复合多表位亚单位疫苗在毕赤酵母中的表达及其免疫原性

目的构建以霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)为分子佐剂的Asia1型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)复合多表位亚单位疫苗,在毕赤酵母中进行表达,并评价其免疫原性。方法构建毕赤酵母表达质粒pPIC9K-P1/2A-CTB-TEpi,转化至毕赤酵母GS115中,甲醇诱导表达,表达产物经硫酸铵沉淀法纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。将纯化的P1/2A-CTB-TEpi蛋白和FMD灭活疫苗分别免疫BALB/c小鼠,以注射PBS作为对照,分别于0、21d各免疫1次。每周尾静脉采血,分离血清,ELISA法检测血清抗体水平;第2次免疫后10d,处死小鼠,分离脾脏淋巴细胞,进行淋巴细胞增殖试验和IFNγELISPOT检测。结果目的蛋白在毕赤酵母中经诱导表达后可分泌到培养上清中,在相对分子质量约为82600(P1/2A)和40500(CTB-TEpi)处可见2条特异性蛋白表达条带,占上清液中可溶蛋白的21%。纯化后的目的蛋白P1/2A和CTB-TEpi的比例约为1∶2,且具有良好的反应原性。P1/2A-CTB-TEpi蛋白免疫小鼠产生了较强的体液免疫和细胞免疫反应,其特异性血清抗体水平与灭活疫苗组差异无统计学意义(P>0.05),而淋巴细胞增殖水平和IFNγ分泌水平显著高于灭活疫苗组(P<0.01)。结论构建了以CTB为分子佐剂的Asia1型FMDV复合多表位亚单位疫苗,其免疫原性良好,为FMD多表位疫苗和亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

多表位DNA壳聚糖微球疫苗的体液免疫应答

目的研究多表位DNA壳聚糖微球疫苗的体液免疫应答。方法制备多表位DNA壳聚糖微球疫苗pcD-NA3.1-HME-3C3d,经鼻腔免疫小鼠,蛋白检测微孔试剂盒检测小鼠特异性IgG抗体水平。结果经免疫的小鼠均能产生针对各表位的特异性IgG抗体,DNA壳聚糖微球疫苗的抗体水平明显高于DNA疫苗。结论壳聚糖微球疫苗投递系统可提高多表位DNA疫苗的免疫应答效果。     

C3d分子多表位DNA疫苗体液免疫应答的增强作用

目的研究C3d分子对多表位DNA疫苗体液免疫应答的增强作用。方法通过PCR方法合成多表位HME基因,分别插入真核表达载体pcDNA3.1和pcDNA3.1-3C3d,构建多表位DNA疫苗pcDNA3.1-HME和pcDNA3.1-HME-3C3d,经肌肉注射免疫小鼠,ELISA检测小鼠特异性抗体水平。结果经免疫的小鼠均能产生针对各表位的特异性IgG抗体,且pcDNA3.1-HME-3C3d免疫组小鼠的抗体水平明显高于pcDNA3.1-HME免疫组。结论C3d可增强多表位DNA疫苗的体液免疫应答水平。     

猪流感复合多表位核酸疫苗的构建及其表达研究

目的构建猪流感病毒复合多表位核酸疫苗,并研究其表达产物的抗原性。方法以H3、H9亚型流感的HA抗原表位及流感病毒的其它主要抗原(NP、NA、M)表位基因为基础,再附以Kozak序列和适当的酶切位点,设计并合成一段长765bp的复合多表位基因(Epi),其中各表位基本独立,将其克隆入真核表达载体pIRES1neo,构建重组质粒pIRE-Epi。将多表位抗原基因Epi插入到融合表达基因H57中,构建重组质粒pIRE-H57-Epi。将构建的重组质粒在Hela细胞中表达,并用免疫荧光方法初步检测所表达蛋白的抗原性。结果所构建的融合表达载体pIRE-Epi和pIRE-H57-Epi,在Hela细胞中表达出流感病毒多表位抗原蛋白,并具有抗原性。结论已成功构建猪流感病毒多表位基因,有可能成为较理想的猪流感候选疫苗。     

口蹄疫病毒病毒样颗粒疫苗的研究进展

口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由 口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种烈性传染病,主要感染牛、猪、绵羊、山羊等偶蹄动物,我国将其列为一类传染病,注射疫苗是控制该疾病的有效措施.病毒样颗粒(virus-like particles,V...     

表位疫苗的设计与优化

表位疫苗是近年发展起来的一种独特的疫苗设计思路,其安全性好,诱发的免疫应答针对性强。要发挥表位疫苗中各表位的功能,合理的设计至关重要。本文就表位疫苗的设计及优化作一简要综述。     

利用HCV多表位复合抗原制备高效价抗体

目的利用HCV多表位复合抗原免疫家兔制备高效价抗HCV多克隆抗体,为改进丙型肝炎病毒抗原的诊断试剂盒提供必要条件。方法HCV多表位复合抗原与完全弗氏佐剂混合免疫家兔,获得高效价抗血清,经硫酸铵沉淀及PrintA/G亲和层析纯化。结果已获得效价大于1∶16000的抗HCV多克隆抗血清,经纯化后达电泳纯。该抗体能与HCVNS3、NS5及C抗原特异性结合。结论HCV多表位复合抗原具有较好的免疫原性,可用于改进HCV病毒抗原诊断试剂。     

宫颈癌CTL表位疫苗TATHPV蛋白的构建与表达

目的　构建宫颈癌的CTL表位疫苗 ,并在大肠杆菌中表达。方法　应用PCR的方法合成编码CTL表位疫苗基因序列 ,将其亚克隆入pET2 8a- TAT表达载体中 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达重组蛋白 ,用Westernblot对重组蛋白进行鉴定。结果　通过 4轮PCR获得疫苗的基因片段 ,构建的重组表达载体pET2 8a -TAT -HPV在大肠杆菌中得到高效表达 ,Westernblot检测显示特异性条带。结论　构建的宫颈癌CTL表位疫苗在大肠杆菌中得到了表达 ,为该疫苗的功能性研究奠定了基础。     

口蹄疫病毒VP1、VP4基因核酸疫苗质粒的构建及其免疫原性

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)VP1、VP4基因核酸疫苗质粒,并研究其免疫原性。方法通过RT-PCR获得FMDVVP1、VP4基因,以真核表达载体pIRESneo为基础,构建VP1单表达以及VP1、VP4融合表达和共表达质粒。转染BHK-21细胞后,Western blot检测目的蛋白的表达。将上述3种基因核酸疫苗、VP1单表达与VP4单表达联合疫苗、灭活疫苗和空载体对照免疫豚鼠,检测血清特异性抗体及中和抗体水平,并进行保护力试验。结果VP1单表达,VP1、VP4融合表达及共表达质粒经PCR及酶切鉴定,证明构建正确。各组核酸疫苗质粒均能诱导产生中和抗体,且具有一定的保护效力。VP1单表达组和联合组保护率均为28.6%;共表达组和融合表达组保护率均为42.9%;灭活疫苗组保护率为100%;空载体组保护率为0。结论口蹄疫病毒VP1与VP4共存时能发挥更好的免疫原性。     

二价重组鸡痘病毒口蹄疫疫苗的豚鼠免疫试验

目的检测携带口蹄疫病毒(FMDV)Asia-1型P1-2A-IL18基因和O型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒疫苗诱导豚鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫的能力。方法将重组鸡痘病毒vUTAL-P1-2A-IL18-P1-2A-3C、w-FPV和PBS分别经肌肉注射免疫豚鼠,检测豚鼠脾T淋巴细胞亚群数量、特异性CTL细胞杀伤活性和血清中抗FMDV特异性抗体水平。结果重组鸡痘病毒免疫豚鼠脾细胞中T淋巴细胞亚群数量和特异性CTL细胞杀伤活性均显著高于w-FPV和PBS对照组,且能产生抗O型和Asia-I型FMDV特异性抗体。结论二价重组鸡痘病毒口蹄疫疫苗能诱导豚鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫。     

口蹄疫病毒WFL株2C-P3-3′NCR片段的克隆及适于设计siRNA的序列分析

目的筛选出口蹄疫病毒(FMDV)基因组上适于设计siRNA的基因片段。方法以FMDV WFL株RNA为模板,用3′RACE法扩增出2C-P3-3′NCR序列,将PCR扩增片段克隆到pMD18-T载体上,转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,进行序列测定,并与参考毒株序列比较。结果扩增的基因片段大小为4033bp,其2C、P3和3′NCR序列的核苷酸序列与参考毒株的同源性分别为87·11%～94·23%、84·91%～96·66%和66·98%～82·35%,2C和P3与参考毒株的氨基酸同源性分别为94·97%～99·39%和91·84%～98·55%,WFL株P3基因的第1150～1270、1680～1840和2080～2490bp以及2C基因的第354～470bp范围内与参考毒株具有高度保守的特性。因此,可以依据siRNA设计原则,在这4个区域内筛选抑制效果好的siRNA。结论成功克隆了FMDV WFL株2C-P3-3′NCR基因的序列,并筛选出4个适于设计siRNA的基因区段。     

共表达口蹄疫病毒O型P1-2A-IL-18基因和Asia I型P1-2A-3C基因重组鸡痘病毒的构建

目的构建共表达口蹄疫病毒(FWDV)O型P1-2A-IL-18基因和AsiaI型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒。方法将酶切得到的FWDVO型P1-2A-IL-18基因和AsiaI型P1-2A-3C基因克隆至鸡痘病毒表达载体pUTAL上,构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-P1-2A-IL-18,与鸡痘病毒(FPV)282E4株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过BrdU3次加压筛选,挑选出单克隆重组病毒株,进行RT-PCR及间接免疫荧光(IFA)鉴定。结果重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-P1-2A-IL-18经双酶切鉴定证明构建正确。经RT-PCR和IFA鉴定,证明所筛选的重组鸡痘病毒在CEF中能正确表达P1-2A-3C-P1-2A-IL-18基因盒。结论已成功构建了共表达FMDVO型P1-2A-IL-18基因和AsiaI型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒。     

DNA表达载体构建及HIV多表位核酸疫苗的设计与表达

目的利用塞姆利基森林病毒(SFV)复制子构建新型真核表达载体,并对含HIV-1中国流行株B亚型核心蛋白p24及多表位MEG嵌合基因的核酸疫苗进行表达与鉴定。方法将含SFV复制子的元件从pSFV-MCS中切下,连入含CMV启动子及增强子的pIRESneo载体中,构建新型真核表达载体pCS,再将含HIV-1 MEGp24基因插入至pCS载体中,构建重组核酸疫苗pCS-MEGp24。用脂质体法将重组质粒转染入BHK-21细胞,进行表达产物的检测。结果间接免疫荧光检测显示,重组质粒转染的BHK-21细胞能有效表达HIV-1 MEGp24,并与HIV阳性血清反应。结论所构建的核酸疫苗可在BHK-21细胞系内进行表达,且MEGp24基因的表达蛋白具有特异性,为构建新型HIV-1中国流行株核酸疫苗的可行性提供了重要实验依据。     

HIV-1 DNA疫苗的构建及免疫原性

目的构建稳定表达HIV-1Gag-Pol蛋白的DNA疫苗,提高目的基因的表达效率。方法对HIV-1野生型Gag-Pol基因序列进行优化,使用本室构建的表达载体VR,构建重组质粒VR-GPCINS。将构建的重组质粒VR-GPCINS转染HEK293细胞,Western blot鉴定表达产物。用构建的DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,Western blot检测体液免疫反应。结果成功构建能稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的VR-GPCINS质粒,Western blot在免疫小鼠的血清中检测到抗p24的特异性抗体。结论含优化Gag-Pol基因序列的质粒DNA疫苗VR-GPCINS在细胞表达和体液免疫方面均明显优于含野生型Gag-Pol基因序列的质粒DNA疫苗VR-GP。     

水泡性口炎病毒保护性抗原基因核酸疫苗质粒的构建及其免疫原性

目的构建水泡性口炎病毒(VSV)保护性抗原基因的重组核酸疫苗质粒,并检测其免疫原性。方法利用RT-PCR从VSV中扩增G蛋白基因,构建重组表达质粒pIRES-G1500,转染BHK-21细胞,以间接免疫荧光、PCR、SDS-PAGE、ELISA和Westernblot检测质粒的表达,用核酸疫苗质粒免疫BALB/c小鼠,检测小鼠的细胞免疫和体液免疫水平。结果构建的重组核酸疫苗质粒在BHK-21细胞中获得正确表达,质粒免疫小鼠后,可刺激脾细胞、T淋巴细胞亚类数量及CTL杀伤活性显著升高,并可产生高滴度的抗VSV特异性抗体。结论该重组核酸疫苗质粒可作为VSV的候选疫苗。