纳豆发酵及后处理生产工艺对纳豆激酶活性的影响

跟踪了纳豆发酵过程中纳豆激酶的变化.考察了纳豆冻干粉在模拟胃肠环境、冷冻干燥以及破碎过程中的酶活损失情况,为纳豆胶囊生产过程中工艺确立、剂型选择和食用方法提供了技术基础.     

纳豆激酶制剂的研究

以选取的纳豆菌-9号为出发菌株，在最佳摇瓶培养条件基础上通过5L发酵罐扩大培养，确定最优发酵培养条件，纳豆激酶活力较摇瓶培养提高2．05倍；发酵液经真空冷冻干燥得到纤溶活性较高的纳豆激酶干粉，并对纳豆激酶干粉的部分酶学性质进行了研究。     

响应面法优化包衣纳豆真空冷冻干燥工艺研究

采用真空冷冻干燥工艺对包衣纳豆进行保存,在单因素试验基础上,通过响应面法分析优化影响包衣纳豆活菌数和纳豆激酶的因素。选取加热温度、真空度、预冻结温度为影响因素,以纳豆菌活菌数和纳豆激酶酶活为响应值,用Box-Behnken试验设计建立响应面分析模型。结果表明,加热温度30℃,真空度33 Pa,预冻结温度-40℃时,纳豆菌活菌数为7.421×10~7 CFU/g,纳豆激酶酶活为759.62 IU/mL,与模型拟合程度高。     

纳豆激酶高产菌株的筛选及纳豆激酶的初步分离研究

从日本传统食品纳豆中筛选获得一株高产纳豆激酶的盐芽孢杆菌菌株,其产酶能力为227IU/g。该菌株经过固体发酵后获得含酶发酵物,采用硫酸铵分步盐析的方法对纳豆激酶进行了分离纯化,其沉淀物即纳豆激酶,经过分步盐析纳豆激酶的纯化倍数为1.34。     

纳豆激酶基因的克隆表达以及活性分析

应用PCR的方法从分泌纳豆激酶的枯草杆菌基因组DNA中扩增得到全长为1056bp的前导肽+成熟肽纳豆激酶原基因(pro-NK),并构建了纳豆激酶的重组表达载体pET-28a-pro-NK;转化E.coliBL21(DE3)后,在IPTG的诱导下实现了纳豆激酶的高效表达,经SDS-PAGE显示在28ku处有一特异带;表达产物经Ni2+亲和层析纯化后,纤维平板法测得的纳豆激酶的比活力为34245.1IU/mg;纯蛋白经透析和冷冻干燥处理后,纳豆激酶的比活力为16271.5IU/mg;在此基础上,对冻干保护剂的添加进行优化,最佳保护效果为甘露醇与纳豆激酶质量比为1:2,可比不加保护剂时比活力提高了30.9%。这可为基因工程方法生产纳豆激酶纯品,稳定其活性便于贮运,并将其开发成为临床药物提供技术参考。     

利用纳豆菌种发酵奶液的研究

纳豆激酶具有溶解血栓的作用,纳豆激酶是由纳豆菌发酵大豆产生,纳豆有比较特殊的味道,利用纳豆芽孢杆菌进行奶液发酵,能够获得较高的纳豆激酶活力,而且没有特殊的气味,本文针对不同发酵时间对利用纳豆菌发酵奶液在色泽、口感、pH、芽孢杆菌数、纳豆激酶酶活力进行测定,结果表明利用纳豆菌对奶液进行发酵,成熟只需16h,就能得到较高的纳豆激酶酶活力,并能在4℃冰箱中保存5天,酶活的减少率低于10%。     

纳豆激酶纤溶活性研究

通过制备纳豆提取液、纳豆激酶粗酶,对纳豆激酶纤溶活性进行研究。结果表明:纳豆激酶纤溶活性最适pH为8.0,pH6~10溶液中40℃以下基本稳定,pH<5失去纤溶活性;模拟胃环境的酸性条件下,粗酶失去纤溶活性,而纳豆浸提液纤溶活性保持25%;SDS-PAGE电泳显示,胰蛋白酶对纳豆激酶成分没有降解作用;体外溶栓作用表明,纳豆激酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不是通过激活纤溶酶原。     

纳豆激酶分子结构与潜在应用价值分析

纳豆激酶因具有较强的溶血能力而著称。目前国内外大量研究人员聚焦于纳豆激酶研究,其开发利用已经获得了长足发展,但同时许多问题与不足也随之暴露出来。一方面是对纳豆激酶的开发利用大多局限于溶栓活性的利用与开发,低估了纳豆激酶应有的整体价值;其次是针对该酶开发和利用的方法过于传统,尚未形成组学大数据和生物信息学技术相结合的探索思维。因此,需要利用更为开阔的研究思路和开发手段来实现纳豆激酶开发利用的最大化。作者从纳豆激酶分子水平和家族分类层次上系统地阐述该酶分子特征,同时对纳豆激酶家族蛋白酶的应用现状进行分析,并对纳豆激酶研发前景进行了展望。     

来源于豆豉的枯草芽孢杆菌MX-6所产纳豆激酶的稳定性研究

以中国豆豉中筛选到的1株纤溶酶高产菌株———枯草芽孢杆菌MX-6为研究对象,应用聚合酶链式反应(PCR)成功扩增到1473bp的纤溶酶编码基因aprN,系统进化树结果显示该纤溶酶为纳豆激酶。研究了纳豆激酶对热、pH、金属离子、化学物质、抑制剂和变性剂的稳定性及传代稳定性。结果表明:纳豆激酶在-20,4,30～50℃的热稳定性较好,pH在3～11之间酶活性相对稳定,Mg~(2+)、Ca~(2+)对纳豆激酶具有显著的激活作用,K~+、Fe~(2+)对纳豆激酶的稳定性基本无影响,而Mn~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Al ~(3+)、Ba~(2+)有显著的抑制作用,Hg~(2+)导致纳豆激酶完全失活,牛血清蛋白、明胶、蛋白胨能够显著提高纳豆激酶的稳定性,丙二醇、海藻酸钠对纳豆激酶的稳定性基本无影响,而乙醇显著降低纳豆激酶的稳定性。PMSF导致纳豆激酶的活性完全丧失,EDAT和DTT对纳豆激酶的活性基本无影响,10mmol/L的SDS显著降低纳豆激酶的稳定性,说明此纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶,不是金属酶,不含二硫键,且具有良好的传代稳定性。结果显示该酶的稳定性较好,具有开发为溶栓药物的应用价值,有利于纳豆激酶的工业化应用。     

固体发酵纳豆激酶培养基的优化

研究蔗糖、葡萄糖、谷氨酸钠3种培养基对固体发酵纳豆激酶的影响,发现添加蔗糖和谷氨酸钠能提高纳豆激酶酶活,而添加葡萄糖反而抑制酶活.优化后的培养基为:4%蔗糖、0%葡萄糖、2%谷氨酸钠.