仿刺参体腔细胞原代培养以及灿烂弧菌胞外产物对其毒性的研究

采用CCM、HSM和L-15N 3种培养液对刺参(Apostichopus japonicas)的体腔细胞进行了体外原代培养,并用MTT还原法对细胞的体外存活力进行测定,结果显示:CCM和HSM培养的体腔细胞,在体外分别存活至3 d和6 d大量死亡;L-15N培养液可使细胞在1周内保持存活.用刺参病原菌灿烂弧菌的胞外产物与刺参体外培养细胞共培育,发现对体腔细胞有毒性作用,半致死蛋白质浓度(IC_(50))为27.6 μg/mL.     

弧菌拮抗菌的筛选

用平板划线或点种法对 6 0 2株海洋细菌进行筛选 ,得到 4株对海水养殖动物 (鱼、虾、贝 )的病原菌有拮抗作用的细菌。并对拮抗菌 QJ2的拮抗作用进行了研究 ,结果为 :QJ2有广泛的弧菌抗菌谱 ,对 37株弧菌的抗菌阳性率达到 89.2 % (33/ 37) ;用活菌平板计数法和 O.D.60 0 nm研究了QJ2培养物的去细胞上清液 (CFS)与病原菌 W- 1的作用动力学 ,15min时 W- 1的细菌数便开始减少 ,4 h时细菌数最少 ,6 h后开始增加 ,而对照组的细菌数呈逐渐上升趋势 ;QJ2对自身的拮抗物质不敏感 ;QJ2抗性物质的分子量不大于 80 0 0 Da;经常规生理生化方法和 API- 2 0细菌快速鉴定系统鉴定 ,QJ2为气味黄杆菌 (Flavobacterium odoratum)。     

青岛仿刺参中3种海参皂苷的分离纯化及结构鉴定

对青岛产仿刺参体内皂苷类成分进行分离及结构鉴定,确定其皂苷的主要组成及比例。应用大孔树脂,正相硅胶柱层析和半制备型HPLC对青岛产仿刺参体内的皂苷成分进行分离纯化,根据化合物的理化性质和波谱数据鉴定其结构。共分离并鉴定3种三萜皂苷类化合物,分别为Cladoloside B(1),Holotoxin A1(2)和Holotoxin B1(3)。青岛海域仿刺参体内的皂苷组成主要为Cladoloside B(1),Holotoxin A1(2)和Holotoxin B1(3),比例约为1∶4.5∶1.7。     

4种多环芳烃对仿刺参耗氧率和排氨率的影响研究

为探究多环芳烃(PAHs)对海洋生物的生态毒理效应,作者将仿刺参(Apostichopus japonicus)分别暴露于质量浓度为10、20、50、100、150μg/L的菲、三甲基菲、蒽和二甲基蒽中,检测4种代表性多环芳烃胁迫下仿刺参的耗氧率和排氨率.结果显示:在不同质量浓度多环芳烃的胁迫下,仿刺参的耗氧率均显著高...     

水体碳氮比对芽孢杆菌、乳酸菌与弧菌生长、拮抗作用及菌体碳氮比的影响

从凡纳滨对虾养殖池塘中采集分离芽孢杆菌、乳酸菌与弧菌,并设置水体碳氮比分别为:C∶Nw=2、5、10、15、20共5个水平。在养殖环境营养水平下研究了芽孢杆菌、乳酸菌与弧菌的生长、拮抗作用及细菌菌体碳氮比(C∶NB)的变化。研究发现,较高的C∶Nw适合芽孢杆菌(C∶Nw=15)与乳酸菌(C∶Nw≥10)的生长,较低的C∶Nw适合弧菌(C∶Nw=5、10)的生长,并且当C∶Nw较高时芽孢杆菌与乳酸菌对弧菌的生长具有明显的拮抗作用。因此向养殖水体和饵料中添加碳源,将环境C∶N提高至超过10的水平不仅可以促进芽孢杆菌与乳酸菌的快速生长,而且可以有效抑制弧菌的繁殖。     

枯草芽孢杆菌Bs-1拮抗溶藻弧菌的特性

研究了枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(Bs-1)抗菌物质产生的特点及培养液的无菌滤液的抗菌谱和理化性质,结果表明Bs-1生长快速,在5h内产生抗菌物质;该物质能抑制多种分离自养殖大海马Odobenus rosmarus肠道和海水的弧菌如溶藻弧菌Vibrio alginolyticus的生长;在一定范围内该物质对热、酸碱、变性剂和蛋白酶均有较好的稳定性。进一步尝试用Bs-1的含菌培养液来控制养殖海水中弧菌的数量,结果表明每升海水中加入4ml培养液(浓度为4×106CFU.ml?1)已能达到较好的抑菌效果;改变海水的pH和盐度,Bs-1培养液仍有较理想的抑菌作用。因此,Bs-1有望开发成良好的益生菌剂。     

枯草芽孢杆菌对泥蚶及养殖底泥中细菌总数和弧菌总数的影响

以平板计数法,研究了不同浓度枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)对泥蚶(Tegillarca granosa)及养殖底泥中细菌总数和弧菌总数的影响.试验分为1×10~6,5×10~6和10×10~6CFU/L 3个浓度试验组和对照组,试验共进行28 d,在第0、7、14、21和28天时采底泥和泥蚶,采用平板计数法检测细菌总数和弧菌总数.结果显示,在投施枯草芽孢杆菌后7 d内,养殖底泥和泥蚶体内细菌总数均呈明显上升趋势(P<0.05),7～28 d内缓慢下降,但差异不显著(P<0.05);投施枯草芽孢杆菌后,各试验组底泥和泥蚶体内弧菌总数显著低于对照组(P<0.05),5×10~6CFU/L和10×10~6 CFU/L试验组弧菌总数显著低于1×10~6CFU/L试验组(P<0.05).结果表明枯草芽孢杆菌具有抑制弧菌增殖的作用,枯草芽孢杆菌可应用于泥蚶池塘养殖.     

仿刺参体壁再生过程中两个核糖体蛋白基因的表达差异

本研究首次从仿刺参(Apostichopus japonicus)体壁中克隆得到核糖体蛋白L30(ribosomal protein L30,RPL30)的c DNA全长序列(Gen Bank:JQ770165),该序列包括56 bp的5′-UTR,162 bp的3′-UTR和339b p的开放阅读框,共编码112个氨基酸;Blast比对分析结果显示该序列的核苷酸序列以及推导的氨基酸序列与其他物种的同源性均在75%以上;RPL30基因在仿刺参各组织中均有表达,其中肠、体腔细胞、纵肌、体壁中表达量分别为呼吸树的7.24倍(P0.01)、4.47倍(P0.01)、3.12倍(P0.05)、1.35倍(P0.05);仿刺参体壁再生不同阶段核糖体蛋白基因RPL30和RPL17的表达存在差异,体壁再生第7 d时RPL30基因的表达出现峰值,为对照组的2.13倍(P0.05),其余天数的相对表达量均低于对照组,其中第1、5、6d的表达量与对照组差异均显著(P0.05);RPL17基因在再生第2、5d分别出现峰值,分别为对照组的7.47倍和5.60倍(P0.05),其余各天的表达量与对照组差异不显著(P0.05)。研究结果表明核糖体蛋白基因除构成核糖体参与蛋白质合成外,还有着各自的核糖体外功能。本研究结果将为进一步研究仿刺参蛋白质合成、再生及多种生理活动的调控机制奠定基础。     

刺参养殖池塘中一株益生芽孢杆菌的分离及鉴定

针对目前刺参池塘养殖中微生态制剂施用混乱、标准不一以及效果不稳定性等现状,本研究从刺参养殖池塘底泥中分离土著芽孢杆菌菌株,并通过菌落形态特征、16s rDNA测序分析和生理生化试验对该菌株进行了鉴定,确定该菌株为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis),命名为XA-01,该茵可为微生态制剂的制备提...     

温度和体质量对仿刺参消化道排空时间和排便量的影响

实验测定了不同体质量的仿刺参(Apostichopus japonicus (Selenka))在不同温度条件下, 消化道的排空时间、排便量和排便率。按仿刺参体质量大小分设10 g ± 0.5 g、40 g ± 2.0 g 和70 g ± 3.5 g 三个体质量组, 以及6、9、12、15、18、21 ℃共6 个温度梯度。结果表明, 各体质量组仿刺参的排空时间均随温度的升高, 具有先增大后减小的趋势, 10 g ± 0.5 g 和40 g ± 2.0 g 组分别在12 和15 ℃时排空时间最长, 且在9～15℃时差异不显著(P＞0.05), 但显著大于其他温度组(P＜0.05), 70 g ± 3.5 g 组仿刺参在12 ℃时的排空时间达各组最大值36.4 h。在6、18 和21 ℃温度条件下, 仿刺参的排空时间随体质量的增大总体呈增长趋势, 各温度组仿刺参的排便量均随体质量的增大而增加。仿刺参的个体排便率随体质量的增加而增大, 而单位体质量排便率多数随体质量增大而减小。10 g ± 0.5 g 和40 g ± 2.0 g 组的排便率均在6 ℃时最高, 70 g ± 3.5 g 组在9 ℃时达最高, 然后降低。温度和体质量对仿刺参排空时间和排便量均有极显著的影响(P＜0.01), 二者的交互作用对排空时间的影响也是极为显著的(P＜0.01),但对排便量的影响不显著(P＞0.05)。     

壳寡糖对刺参生长、免疫反应和抗病力的影响

以初始质量(5.28±0.03)g的仿刺参(Apostichopus japonicas Selenka)为实验对象,进行为期56d的摄食生长实验。在基础饲料中分别添加0、0.25%、0.50%、1.00%和2.00%的壳寡糖(Chitosan oligosaccharide,COS),配制成5种实验饲料,研究壳寡糖对仿刺参生长、免疫反应和抗病力的影响。结果表明:饲料中添加了壳寡糖后,刺参的特定生长率呈上升趋势,但与对照组无显著性差异(P0.05)。饲料中添加壳寡糖对刺参体腔细胞吞噬活性的影响不显著(P0.05),而显著提高了刺参体腔细胞的呼吸爆发活力(P0.05)。饲料中添加0.50%的壳寡糖可显著提高刺参体腔细胞的一氧化氮合酶活性(P0.05)。刺参体腔细胞内酸性磷酸酶活性呈下降趋势,其中0.50%壳寡糖添加组显著低于对照组(P0.05)。攻毒实验表明,饲料中添加壳寡糖对提高抵抗灿烂弧菌的能力无明显作用(P0.05)。综合比较表明,饲料中添加壳寡糖,对刺参的生长和抵抗灿烂弧菌的能力有一定的促进作用。     

养殖刺参腐皮综合征两种致病菌Dot-ELISA快速检测

以养殖刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合征两种主要致病原灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为抗原,分别制备兔抗血清,建立了两种病原菌的点酶ELISA(Dot-ELISA)检测方法。根据方正试验,确定检测用一抗、二抗最佳工作稀释度:灿烂弧菌抗血清稀释度320,酶标二抗稀释度3 000;假交替单胞菌抗血清稀释度160,酶标二抗稀释度2 000。阻断试验结果表明两种抗血清特异性均较高。灿烂弧菌抗血清在稀释度为40时与溶藻胶弧菌、河流弧菌、创伤弧菌等弧菌发生微弱交叉反应,提高稀释度到160时,不发生交叉反应。假交替单胞菌抗血清基本不与常见海水致病弧菌发生交叉反应。人工感染试验检测结果表明该方法能从患病海参溃烂组织、未发病海参组织和感染水体检测到相应致病菌,检测灵敏度为9.4×103个/mL。人工感染试验检测结果经直接凝集反应验证。该方法操作简便、灵敏度高,不需复杂仪器设备,适合在基层推广。     

灿烂弧菌粘附相关因子VsA的表达及功能研究

为了探究灿烂弧菌中 Zn2+转运系统的细胞周质组分 VsA 的表达与功能,本实验采用 PCR 克隆 vsA 基因,实时荧光定量测定 vsA 基因的表达,利用抗体封闭实验研究 VsA 蛋白的功能。生物信息学分析表明 VsA 具有结合和转运 Zn2+的结构基础。实时荧光定量结果表明,vsA 的表达受 Zn2+调控,且具有浓度依赖性,0.01 mmol/L 的 Zn2+可使 vsA 的表达量下调至对照组的0.5倍,而添加等摩尔量的 Cu2+、Fe3+、Mg2+和 Ca2+对 vsA 的表达无明显影响。而 0.1 滋mol/L Zn2+则会诱导 vsA 的表达。此外,在大肠杆菌 Escherichia coli BL21 （DE3） 中进行了 VsA 的重组表达,制备了 VsA 的小鼠多克隆抗体。利用抗体封闭 VsA 蛋白可导致灿烂弧菌在 Zn2+限制条件下的生长受抑制,以及过氧化氢的能力和粘附效率的降低。本研究获得了灿烂弧菌的 vsA 基因,其表达受 Zn2+浓度调控,VsA 蛋白在灿烂弧菌生长、抗氧化以及粘附宿主细胞过程中发挥作用。     

不同配比饲料对刺参C、N、P营养盐收支的影响

本实验采用5种含有不同比例(即20∶80、40∶60、60∶40、80∶20和100∶0)的鼠尾藻和海泥的颗粒饲料喂养刺参(Apostichopus japonicus),并比较了不同饲料条件下刺参C、N、P营养盐的收支过程。结果表明:刺参C、N、P营养盐收支过程和饲料中鼠尾藻的含量显著相关(P<0.05)。刺参的摄食率和排粪率随着饲料中鼠尾藻含量的增加而显著降低(P<0.05);刺参的耗氧率、排氨率、排磷率,以及对C、N、P营养盐的摄入率、生长余力和吸收效率均随着饲料中鼠尾藻含量的增加而显著变大(P<0.05)。当饲料中鼠尾藻添加量大于60%时,刺参对营养元素的生长余力和吸收效率无显著变化(P>0.05),因此对于成参而言,饲料中鼠尾藻和海泥的比例为60∶40是较为理想的配制比例,既可以满足刺参生长代谢所需要的主要营养元素,又能够最大限度地减少刺参养殖活动营养盐的排放。     

光谱和体重对刺参耗氧率和排氨率的影响

实验采用室内受控的方法,研究了不同光色下,大(73.32±1.73) g、中(46.71±0.15) g和小(25.67±0.25) g 3种规格刺参(Apostichopus japonicus)的耗氧率和排氨率的变化.实验采用红、橙、黄、绿、蓝色和对照组(白色)6种光照处理.研究结果表明:光谱对刺参的耗氧率和排氨率均有显著性影响(P<0.05),3种规格刺参的耗氧率趋势相同:白色＞红色、黄色、绿色、蓝色＞橙色;3种规格刺参的排氨率有相似的变化趋势:白色＞红色＞橙色、绿色、黄色、蓝色.刺参的体重与单位体重耗氧率及排氨率之间的回归关系均可以表示为R=aW~b,耗氧率a值在0.005 9～0.012 1之间,b值范围是1.119 7～1.214 6,排氨率a值的变动范围为0.004 2～0.02,b值的变动范围为0.455 3～0.867 8.这说明光谱对刺参的耗氧率和排氨率有显著性的影响,丰富了刺参的基础研究,对于刺参养殖生产有一定的指导意义.     

泼洒和投喂芽孢杆菌对刺参生长以及消化和免疫相关酶活性的影响

通过拌饵投喂和水体泼洒2种使用方式,研究了不同浓度的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus,编号BC-01)对刺参(Apostichopus japonicus)幼参的生长、肠道消化酶和体腔液非特异性免疫相关酶活性的影响。其中,水体泼洒实验组芽孢杆菌使用量分别为106、108和1010cfu·m-3(以活菌量计),拌饵投喂实验组芽孢杆菌添加量分别为107、109和1011cfu·kg-1(以活菌量计),以投喂基础饲料且水体无芽孢杆菌泼洒组为对照组,整个实验持续56d。结果表明:(1)水体泼洒106 cfu·m-3和拌饵投喂109 cfu·kg-1的芽孢杆菌可以显著促进刺参的生长,并显著降低刺参体重变异系数(P0.05)。(2)泼洒108 cfu·m-3芽孢杆菌实验组的刺参肠道蛋白酶活性以及泼洒106和108 cfu·m-3芽孢杆菌实验组的脂肪酶活性均显著高于对照组(P0.05)。投喂芽孢杆菌能显著提高刺参肠道蛋白酶活性(P0.05),投喂107 cfu·kg-1芽孢杆菌的实验组刺参肠道脂肪酶活性和投喂109和1011cfu·kg-1芽孢杆菌的实验组淀粉酶活性均显著高于对照组(P0.05)。(3)水体泼洒芽孢杆菌则显著提高刺参体腔液LSZ活性(P0.05),但对SOD活性影响不大(P0.05)。1010cfu·m-3芽孢杆菌泼洒浓度可以显著增强刺参体腔液AKP和ACP活性(P0.05)。而投喂109和1011cfu·kg-1芽孢杆菌可以显著提高刺参体腔液过氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)和溶菌酶(LSZ)活性(P0.05)。可以看出,芽孢杆菌BC-01以饵料添加方式对刺参体腔液免疫酶活性的促进作用优于水体泼洒。综合比较表明,芽孢杆菌BC-01拌饵添加的适宜浓度为109 cfu·kg-1,对刺参的生长、消化功能和非特异性免疫能力均具有显著促进作用。     

刺参雌核发育二倍体的诱导及其早期生长发育

紫外线照射使精子遗传物质失活,用细胞松弛素B(CB)处理受精卵抑制第二极体释放,诱导刺参(Apostichopusjaponicus)雌核发育二倍体。用强度为2561μW/(cm2.s)的紫外线(254 nm)照射不同时间的精子与正常卵子受精。结果发现随照射时间的增加,卵裂率、早期胚胎存活率和小耳幼虫发生率逐渐降低,照射30 s时小耳幼虫发生率降为0。受精后35 min,显微镜下观察到有20%~30%受精卵排出第1极体时,用浓度0.5μg/mL的CB持续处理受精卵20 min,诱导出刺参第二极体抑制型雌核发育二倍体,雌核发育二倍体发育速度低于正常二倍体。微卫星分析表明,雌核发育二倍体诱导成功率为93.3%。     

不同盐度和培育密度对杂交刺参幼体生长发育的影响

分析了6个不同盐度和5个培育密度对中国刺参和日本红刺参(Apostichopus japonicus)杂交幼体的生长、存活和附着的影响。盐度实验结果显示,受精后第5天,30和35盐度组幼体成活率最高,分别为46.7%和40.0%。第2天至第5天,30盐度组耳状幼体的生长最快,到第5天平均体长达到最大值672.18μm;30盐度组的幼体附着率最高,为17.8%,而15和20盐度组中均没有出现附着的稚参。培育密度实验结果显示,受精后第5天,0.1个/mL密度组的幼体成活率最高,为66.7%,但各密度组的幼体成活率差异均不显著。0.5个/mL密度组幼体生长最快,到第10天达到最大平均体长,为801.38μm;在所有培育密度实验组中,0.5个/mL密度组的幼体附着率最高,为19.1%。因此,为实现单位水体的苗种产量最大化,刺参杂交幼体培育的最佳盐度为30,最适宜的培育密度为0.5个/mL。     

盐度骤变对仿刺参hsp70及hsp90基因表达的影响

为研究夏季暴雨导致的养殖池塘盐度变化对仿刺参(Apostichopus japonicus)生理的影响,在实验室内模拟野外盐度变化,采用半定量RT-PCR的方法研究了其hsp70、hsp90a及hsp90b基因的表达。实验中,盐度先以每6h降2.5的速度由30降至20;保持96h后,再以同样的速度由20升至30,随后在盐度为30条件下保持96h。在盐度变化过程中随机取样。hsp70和hsp90b基因在盐度降至20后表达量开始显著升高(P<0.05),hsp90a基因在盐度降至22.5时表达量开始显著升高(P<0.05);但保持在盐度为20条件下,3个基因的表达量均逐渐降低至初始值。在之后的盐度升高及恢复阶段,3个基因表达量均有先升高后降低的趋势,表明hsp70、hsp90a和hsp90b基因是仿刺参在盐度胁迫下的重要响应因子。