里氏木霉和黑曲霉产酸性木聚糖酶及酶学特性比较

【目的】对黑曲霉和里氏木霉产酸性木聚糖酶的性能及所产粗酶的酶学特性进行分析比较,尤其是考察pH值为4时木聚糖酶酶活力及稳定性,从而确定潜在的较为理想的酸性木聚糖酶。【方法】将里氏木霉和黑曲霉接种至培养基进行产酶培养,比较分析两者的酸性木聚糖酶、酸性木糖苷酶的酶活力及酶学特性。【结果】黑曲霉酸性木聚糖酶和酸性木糖苷酶的酶活力最高分别达(52.36±2.61)U/mL和(0.57±0.01)U/mL,酸性木聚糖酶最适温度和pH值分别为55℃、5.0,酸性木糖苷酶最适温度和pH值分别为75℃、5.0;里氏木霉酸性木聚糖酶和酸性木糖苷酶的酶活力最高分别达(10.12±0.95)U/mL和(0.32±0.05)U/mL,酸性木聚糖酶最适温度和pH值分别为65℃、6.5,酸性木糖苷酶最适温度和pH值分别为65℃、4.5。黑曲霉和里氏木霉的酸性木聚糖酶兼有酸性CMCase酶活力,分别为(5.26±0.21)U/mL、(1.72±0.21)U/mL。【结论】黑曲霉所产酸性木聚糖酶明显比里氏木霉的更优良,是潜在的较为理想的酸性木聚糖酶。     

里氏木霉诱导合成木聚糖酶的调控

提出了两种不同用途的木聚糖酶的诱导合成方法。以里氏木霉为产酶菌,经适当处理后的玉米芯可诱导产生含纤维素酶（３．４ＩＵ／ｍＬ）的高活力木聚糖酶（５４．４ＩＵ／ｍＬ）。以混有少量纤维素的粗木聚糖作碳源,通过分批补料及对培养条件的限制性控制里氏木霉可选择性合成木聚糖酶;选择性合成程度与碳源浓度有关,当碳源浓度为１０ｇ／Ｌ时木聚糖酶和纤维素酶活力分别为３５．５ＩＵ／ｍＬ、０．２Ｕ／ｍＬ,两种酶活的比值达１７７．５。     

里氏木霉木聚糖酶的分离纯化及其性质

使用硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-25凝胶色谱脱盐、DEAE-Sephadex A-50和SP-SephadexC-50离子交换色谱等分离纯化技术，从里氏木霉（Trichoderma reesei）RutC-30培养液中分离出木聚糖酶组分，再经SephadexG-100凝胶过滤色谱进一步分离纯化，得到2个纯木聚糖酶组分A组和组分B。经SDS-PAGE鉴定两组分为单带，相对分子质量分别为20300和13500。组分A的最适反应条件为45℃、pH3.0-5.5很稳定，酶解产物主要是低聚木糖，只含少量木糖；组分B的最适反应条件为55℃、pH5.5，酶解产物全部是低聚木糖。     

木霉No.183菌株木聚糖酶的研究

 筛选到一株木聚糖酶高产木霉菌株(No.183),研究了该菌株产木聚糖酶的液态发酵和粗酶液的酶学性质.结果表明,以麸皮和木聚糖为主要碳源,28℃,190r/min摇瓶培养时,木霉No.183菌株在接种后84h酶活最高,达到298.47U/mL.该木聚糖酶的最适反应温度为50℃,最适pH为该木聚糖酶在pH5～7和40℃以下时相对稳定.Ca²⁺,Zn²⁺和Cu²⁺对该木聚糖酶有较强的促进作用,Fe³⁺和Hg²⁺对该酶有较强的抑制作用.     

里氏木霉产酶菌株的选育研究

采用紫外线和亚硝酸联合诱变技术,得到产纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶的高产的菌株里氏木霉Y07.试验表明,诱变后菌株的木聚糖酶活由325 U/g,提高到28 500 U/g,相对于出发菌株提高了88倍;纤维素酶活由560 U/g,提高到2600 U/g,相对于出发菌株提高了4.6倍;β-葡聚糖酶活由480 U/g,提高到5500 U/g,相对于出发菌株提高了11.5倍.     

间歇出酶对里氏木霉产纤维素酶的影响

在分批补料的基础上,采用间歇出酶的方法,对里氏木霉产纤维素酶进行了研究。结果表明:分批补料过程中最佳的补料速度为5.5 g/(L·d),在此条件下产酶第8天滤纸酶活力和β-葡萄糖苷酶活力达到14.40 U/mL和1.59 U/mL。在分批补料的基础上进行间歇出酶,与对照相比,第4、6、8天出酶模式(模式1)时,总滤纸酶活力提高18.14%; 第4、7天出酶模式(模式2)时,总滤纸酶活力提高17.75%; 第5、8天出酶模式(模式3)时,总滤纸酶活力提高27.35%。研究表明,通过间歇出酶可以有效提高纤维素酶总滤纸酶的活力。     

固定化里氏木霉制备纤维素酶的研究

采用多孔塑料吸附固定里氏木霉（Trichoderma reesei RutC30)菌丝细胞，以硫酸盐纸浆为底物，重复分批发酵生产纤维素酶，滤纸酶活力可达2.4IU.mL^-1，纤维二糖酶活力为0.2IU.mL^-1，分别是游离细胞发酵的1.6倍和2.2倍，固定化菌丝细胞性状稳定，连续使用40d以上，未见酶活力下降，酶解试验表明，固定化细胞生产的酶液对木质纤维原料具有很高的降解效率，当每克底物的酶用量在滤纸酶活力20IU以上时，酶解得率可达90%以上。     

里氏木霉发酵法制备纤维素酶粗酶液及其酶促打浆的应用

采用里氏木霉为发酵菌种,通过液体深层发酵的方法,制备纤维素酶粗酶液,并用于酶促打浆.在温度30,℃、转速120,r/min条件下培养96,h,系统研究了氮源和碳源种类、碳源用量、麸皮用量、微量元素液和营养元素液加入量对纤维素酶各组分酶活的影响.结果表明,在以0.2%硫酸铵为氮源,1%思茅松漂白硫酸盐浆为碳源,微量元素液和营养元素液加入量分别为0.2%、8%,麸皮加入量为1%的条件下,能够获得较高的纤维素酶酶活.酶促打浆研究结果表明:当纤维素酶用量为7,U/g时,思茅松漂白硫酸盐浆的打浆度提高40%,且纸浆强度性能损失小.     

里氏木霉几丁质酶基因的克隆及其同源转化研究

丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)外切几丁质酶具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性.根据里氏木霉基因组数据库获得了一个编号为21725的外切几丁质酶nagl基因序列,根据检索结果,从里氏木霉QM9414基因组DNA中克隆获得1.9kb的基因片段.构建了以cbhl为启动子和终止子的重组质粒pCbhNag,与含有pyr4基因的质粒pSKpyr4共转化里氏木霉pyr4缺陷株RutC30△U3.共得到99个转化子,初筛得到5株乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活较高的转化子,其中N3菌株的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活可达26.65 U/mL,而出发菌株的胞外几丁质酶几乎无酶活.成功实现了里氏木霉几丁质酶的克隆及同源表达.     

里氏木霉DWC1纤维素酶的研究

实验对纤维素酶高产菌株里氏木霉ＤＷＣ１的最佳产酶条件进行了研究。且分析了菌株在不同的营养及培养条件下的产酶情况。ＤＷＣ１菌株的最佳液体培养条件如下：温度（２５～２９）℃，初始ｐＨ５．０，发酵时间（５～７）ｄ。在此培养条件下菌株的ＣＭＣ酶活及滤纸酶活可分别达到４８３．３ｍｇ／（ｍｌ·３０ｍｉｎ）和１３６．７ｍｇ／（ｍｌ·ｈ）。     

影响固定化里氏木霉合成纤维素酶的动力学因素

对影响固定化里氏木霉细胞合成纤维素酶的主要动力学进行了研究。以纸浆为主要碳源，采用固定化细胞，在２５０ｍＬ摇瓶中重复分批发酵，结果表明，在一批加料条件下，适宜于固定化细胞产酶的条件是：纸浆浓度１．５％～２．０％，Ｃ／Ｎ为８，培养液的初始ｐＨ值４．０摇瓶转速２００ｒ／ｍｉｎ及２６℃。分批添加纸浆可以减少固体底物对氧气输送和物质扩散等方面造成的不良影响，有利于增加底物的总用量，从而促进纤维素酶的合成，     

玉米芯中木聚糖提取方法的研究

采用碱解玉米芯粉末后,玉米芯碱解液用30%(w:v)过氧化氢溶液脱色并且用10%(w:v)三氯乙酸溶液脱蛋白来提取木聚糖,收得率分别为24.4%。并用真菌DSM10635菌株产的木聚糖酶对以三种不同来源的木聚糖以及自提玉米芯木聚糖为底物测得的米氏常数进行比较,还检测比较了DSM 10635木聚糖酶以桦树和自提木聚糖作为底物的最佳酶促反应温度。结果表明,从玉米芯自提木聚糖的Km值7.5303与燕麦木聚糖的Km值5.6044相近,桦树和自提的木聚糖的最佳酶促反应温度也都在65-70℃左右,具有一定的取代性。方法简单,收得率较高的木聚糖提取方法对工业上大量生产具有重要的意义。     

初始pH对合成木聚糖酶和纤维素酶的影响

以里氏木霉（Trichoderma reesei)Rut C-30为产酶菌，研究了不同初始pH值对木聚糖酶和纤维素酶合成的影响。结果表明，初始pH较低有利于纤维素酶的合成，初始pH值高则延长了产木聚糖酶的时间，且强烈抑制纤维素酶的合成，致使木聚糖酶活与纤维素酶活的比值提高，从而有利于选择性合成木聚糖酶。初始pH值分别为４．０、４．４、４．８、５．４、６．０时，培养72h，木聚糖酶活与纤维素酶活的比值分别为259、327、425、865、1016。随着初始pH值的增加，里氏木霉对培养液中还原糖的消耗能力在降低，初始pH值在4．0－4．8范围内，培养48h时还原糖浓度到最低，并且维持在低浓度的水平上。当初始pH值在5．4－6．5范围内，培养72h时还原糖浓度才达到最低，并且培养液中还原糖浓度较高，初始pH值提高到6．5时，培养液中还原糖浓度维持在较高水平上，抑制了木聚糖酶和纤维素酶的合成。     

调控pH值提高木聚糖酶活力的研究

通过控制产酶过程ｐＨ 值能有效提高里氏木霉木聚糖酶活力。结果表明,当控制产酶ｐＨ 为４ ．０ 时,有利于提高木聚糖酶活力,且此ｐＨ 对提高β－ 木糖苷酶活力的影响更大。ｐＨ 调控时间不宜过长,一般应以控制１ ～２ ｄ 后让其自由发展为宜。     

调控酶解底物初始pH制备低聚木糖

研究在木聚糖酶定向酶解纯木聚糖及木聚糖碱抽提液制备功能性低聚木糖时,酸和缓冲溶液调控底物的初始ｐＨ对低聚木糖的影响。结果表明,木聚糖酶在ｐＨ５．０左右的活力最高;酸调控纯木聚糖底物的低聚木糖得率低于缓冲溶液调控的低聚木糖得率,但两者相关不大;而当底物为木聚糖碱抽提液是,由于木素的存在,两种调控方式的低聚木糖得率相差较大,酶解液出现浑浊状态;酸调控纯木聚糖,木聚糖碱抽提液时,低聚木糖得率最高的初始ｐ     

木聚糖降解酶酶法制取低聚木糖的初步研究

木聚糖酶是一类复合酶系,木聚糖水解酶具有多重性现象.酶解法的关键在于木聚糖酶对底物的适应性,即选择合适的木聚糖酶.着重介绍木聚糖的预处理、选择相关条件酶解.正交试验表明,木聚糖酶水解木聚糖的条件为:在摇床转速为220r/min,温度为45℃的条件下,50mL缓冲液(pH=3.6)中加入0.02%木聚糖酶酶解2g粗木聚糖5h,得到低聚木糖浓度为4.12mg/mL,低聚木糖占总糖浓度的41.18%.     

耐碱性木聚糖酶发酵生产条件的研究

研究了不同培养条件下的产耐碱性木聚糖酶的情况 .类黄假单胞菌SQ153 产酶适宜条件为 :以4%的麸皮为碳源 ,以 0 .6 %的尿素为氮源 ,pH 10 .0 ,37℃ ,2 0 0r/ pm培养 14h ,其酶活力达 5 98IU/mL培养基 .在 5L自控发酵罐中 ,产酶达到同样水平 ,发酵周期缩短约 1h .     

米曲霉利用农业废弃物产木聚糖酶的条件优化

主要研究了米曲霉利用农业废弃物产木聚糖酶的情况.对实验室保藏菌株米曲霉M-9生长所必需的碳源、氮源、培养温度和培养基初始pH等条件进行了优化.实验表明,此菌株最适碳源是粒度小于0.08 mm的玉米芯(质量分数为4.0%),最佳复合氮源是质量分数为1.2%的酵母提取物加质量分数为0.8%的大豆蛋白胨,最适初始pH值为7.5,最适产酶温度为30℃,最佳转速为200 r/m in,添加表面活性剂吐温60对菌株产酶有促进作用.在最适培养条件下,培养5 d,米曲霉沪酿M-9木聚糖酶的产量高达795.93 U/mL,是优化前的2.2倍.     

酶法制取棉籽水解蛋白研究

酶籽蛋白是一种优质植物蛋白,对棉籽蛋白采用酶法水解,能改善功能特性,研究得出,酶处理的最适参数范围为温度４０～４５℃,时间５－７ｈ,ｐＨ７～８,加酶量２－３％,棉籽水解蛋白ＤＨ为１７－１８时乳化性能较好,ＤＨ为１３－１４时起泡能力较强。