小鼠胚胎干细胞移植后两种示踪方法的比较

目的 观察小鼠胚胎干细胞(ES)移植入大鼠脑内后绿色荧光蛋白(GFP)质粒和Thy-1抗体在指示细胞及细胞分化方面的特点.方法 标记方法一:将p-EGFP-N1质粒转入ES细胞,连续10代抗生素筛选表达GFP的GFP-ES,并将GFP-ES移植入活体大鼠脑内.取材后冰冻切片,在荧光显微镜下观察切片上的绿色荧光.标记方法二:直接移植胚胎干细胞后取材,用特异性抗小鼠Thy-1抗体作移植细胞的免疫组织化学染色,荧光显微镜下观察.另外,两种标记方法均做神经元和胶质细胞的特异抗体神经细胞核抗体(NeuN)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫组织化学染色,观察是否与GFP或Thy-1抗体双标记,以此判定细胞分化情况.结果 GFP质粒转化后的ES细胞团和单细胞均表达亮绿色的GFP,转化效率为30%;移植21d后,大鼠脑内存活的移植细胞仍表达GFP,但不能和NeuN、GFAP的染色双标记.大量Thy-1阳性的植入细胞和NeuN、GFAP双标记.结论 GFP质粒标记胚胎干细胞后移植可以较好地显示移植细胞,但不能观察细胞分化;而Thy-1抗体不仅在显示移植细胞上有较好的效果,还可以准确地标记分化细胞.     

绿色荧光蛋白作为神经干细胞示踪标记的实验研究

目的研究携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的腺病毒感染神经干细胞(neural stem cells,NSCs)后的荧光稳定性和持久性及其对NSCs生物学特性的影响;探讨利用其作为NSCs示踪标记的可行性.方法利用GFP-腺病毒空载体感染NSCs(NSCs-GFP),经G418筛选并连续传代,在相差显微镜下观察未感染NSCs和感染NSCs的形态以及在荧光显微镜下观察感染NSCs及其诱导分化后的GFP表达情况;并检测NSCs-GFP的细胞活性和细胞周期.调整GFP标记神经干细胞浓度为1×105/μl,将其植入大鼠侧脑室内,观察其在脑内的表达.结果未感染NSCs和感染NSCs的形态学、细胞活性和细胞周期等无明显差异(P＞0.05).GFP在诱导分化后的NSCs-GFP子代细胞中有高表达,并且第1代和第20代NSCs-GFP的绿色荧光无明显差别.在植入侧侧脑室周围可见绿色荧光的强表达,且持续时间较长.结论 GFP荧光稳定持久,对转染细胞的生物学特征无明显影响,并且移植后的荧光呈长时间强表达,因此可以将其作为神经干细胞的示踪标记,这将有利于神经干细胞移植后的可塑性研究.     

骨髓间充质干细胞两种示踪方法的优缺点比较

【目的】探讨荧光染料CM-DiI直接标记和慢病毒感染法EGFP标记人骨髓间充质干细胞（hMSC）用于体内示踪的优缺点。【方法】利用FUGW质粒构建携带EGFP基因的慢病毒载体,并感染P3代hMSC,荧光倒置显微镜下观察细胞的感染效果及传代前后细胞EGFP表达情况的变化;CM-DiI直接标记P3代hMSC,观察CM-DiI标记对细胞生物学特性的影响及传代前后细胞标记效果的变化。分别将CM-DiI和EGFP标记的P3代hMSC移植入新生大鼠左侧脑室,2周后取大鼠脑组织行冰冻切片,比较两种标记方法用于体内示踪的效果。【结果】慢病毒感染hMSC 48h后,约40%细胞表达绿色荧光,体外培养1个月,EGFP阳性细胞数增至50%左右,荧光强度基本保持不变,细胞生长不受病毒转染的影响。CM-DiI标记hMSC 12h后,95%以上细胞呈现很强的红色荧光,1个月后,阳性细胞减少至50%左右,荧光强度也有一定程度降低,未见染料对细胞形态和生长产生明显影响。CM-DiI标记的hMSC移植后2周脑冰冻切片可以找到红色荧光的标记细胞,EGFP标记的hMSC移植后2周脑冰冻切片未找到绿色荧光细胞。【结论】CM-DiI和EGFP均可在体外高效标记hMSC,但CM-DiI标记的hMSC体内示踪效果优于EGFP标记。     

绿色荧光蛋白腺病毒表达载体在肌源性干细胞移植修复脊髓损伤实验中的应用

目的:观察绿色荧光蛋白腺病毒表达载体在肌源性干细胞移植修复脊髓损伤实验中的应用。方法:40只成年SD大鼠随机分为移植组(n=20)和对照组(n=20),均进行脊髓半切损伤。伤后9d,移植组于伤处移植体外转染GFP基因的大鼠MDSCs,而对照组仅注射等量PBS,于移植后1、2、3、4周用BBB评分方法测大鼠的运动功能,同时进行损伤脊髓取材、快速冰冻切片进行荧光显微镜观察。结果:移植后1周两组动物运动功能恢复无明显差异;移植后2、3、4周与对照组比较,移植组显著提高运动功能;荧光显微镜观察经绿色荧光蛋白基因标记的肌源性干细胞在损伤脊髓组织局部生长良好,并且有沿着脊髓神经束向头尾两侧迁移的趋势。结论:携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒表达载体的细胞标记方法是安全可靠、简便有效的生物示踪标记方法,可以用于标记细胞移植实验研究。     

异体骨髓间充质干细胞在骨髓嵌合小鼠体内分化为肝细胞的实验研究

目的 探讨小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)在体内分化为肝细胞的可行性.方法 雌性C57BL/6J小鼠全身一次性接受10Gy 60Coγ射线照射后立即接受同品系绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞移植.移植后1周、1、3个月取骨髓嵌合小鼠肝脏,石蜡切片行GFP抗体免疫组化,冰冻切片在荧光显微镜下观察GFP阳性细胞在肝内分布.石蜡切片行GFP抗体和白蛋白(albumin,Alb)抗体以及GFP抗体和细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)抗体免疫荧光双标染色法,以此检测GFP阳性细胞在受体小鼠肝内的分化情况.结果 移植后1周、1、3个月骨髓嵌合小鼠肝内皆可见GFP阳性细胞,且有随时间减少的趋势,并都可见GFP和Alb双阳性细胞.结论 异体骨髓间充质干细胞可在骨髓嵌合小鼠体内分化为表达Alb和CK18的肝细胞,为肝组织的再生和修复提供了新思路.     

骨髓间充质干细胞两种示踪方法的优缺点比较

  【目的】 探讨荧光染料CM-DiI直接标记和慢病毒感染法EGFP标记人骨髓间充质干细胞(hMSC)用于体内示踪的优缺点｡【方法】 利用FUGW质粒构建携带EGFP基因的慢病毒载体,并感染P3代hMSC,荧光倒置显微镜下观察细胞的感染效果及传代前后细胞EGFP表达情况的变化;CM-DiI直接标记P3代hMSC,观察CM-DiI 标记对细胞生物学特性的影响及传代前后细胞标记效果的变化｡分别将CM-DiI和EGFP标记的P3代hMSC移植入新生大鼠左侧脑室,2周后取大鼠脑组织行冰冻切片,比较两种标记方法用于体内示踪的效果｡【结果】 慢病毒感染hMSC 48 h后,约40%细胞表达绿色荧光,体外培养1个月,EGFP阳性细胞数增至50%左右,荧光强度基本保持不变,细胞生长不受病毒转染的影响｡CM-DiI标记hMSC 12 h后,95%以上细胞呈现很强的红色荧光,1个月后,阳性细胞减少至50%左右,荧光强度也有一定程度降低,未见染料对细胞形态和生长产生明显影响｡CM-DiI标记的hMSC移植后2周脑冰冻切片可以找到红色荧光的标记细胞, EGFP标记的hMSC移植后2周脑冰冻切片未找到绿色荧光细胞｡ 【结论】 CM-DiI和EGFP均可在体外高效标记hMSC,但CM-DiI 标记的hMSC体内示踪效果优于EGFP标记｡     

不同途径移植大鼠骨髓间充质干细胞对大鼠肝硬化的作用研究

目的探索不同途径移植绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记的大鼠骨髓间充质干细胞（rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs）在慢性肝纤维化中的作用,以及移植后细胞在肝脏组织内的存活、分布情况。方法全骨髓差速贴壁法分离、培养BMSCs,利用携带GFP基因的慢病毒载体感染P3代BMSCs,建立四氯化碳慢性肝纤维化大鼠模型,通过不同途径移植GFP标记的BMSCs,移植后维持四氯化碳肝损伤,1月后处死大鼠,行肝脏功能相关指标白蛋白（albumin,ALB）、谷丙转氨酶（alaninotransferase,ALT）和谷草转氨酶（aspartate aminotrans-ferase,AST）检测,观察肝脏局部组织标本苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE）、胶原纤维染色和荧光分布情况。结果不同途径BMSCs移植对大鼠四氯化碳所致慢性肝纤维化肝脏功能无明显改善,移植后GFP标记的BM-SCs均可向损伤肝脏迁移或停留,不同途径移植的BMSCs在肝脏内分布不同。结论大鼠骨髓间充质干细胞移植对大鼠慢性肝纤维化无明显治疗作用,可能参与了肝纤维化的形成。     

pEGFP-N1-VirB8真核表达载体的构建及其在大鼠脑内的表达

目的构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统VirB8蛋白的真核表达载体pEGFP-N1-VirB8,研究其在大鼠脑内的表达,为探讨VirB8蛋白的功能及在布鲁氏菌致脑损害中的作用奠定基础。方法利用从羊种布鲁氏菌中提取的总DNA为模板,从中扩增出羊布鲁氏菌VirB8全长序列,并克隆到真核表达载体pEGFP-N1上,构建pEGFP-N1-VirB8真核重组载体。采用注射法将阳离子脂质体和重组质粒pEGFP-N1-VirB8混合后注入大鼠侧脑室,以空白质粒及生理盐水为对照组,转染1周后取脑组织制作冰冻切片,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(greenfluoerscentportein,GFP)的表达,并用Western blot检测融合蛋白的表达。结果经双酶切及测序鉴定证明pEGFP-N1-VirB8载体构建成功;荧光显微镜下观察可见转染pEGFP-N1-VirB8表达载体的大鼠脑组织有GFP的表达;Western blot结果显示,VirB8融合蛋白在大鼠脑组织中表达。结论 pEGFP-N1-VirB8载体构建成功,且阳离子脂质体介导的pEGFP-N1-VirB8重组质粒在大鼠脑内可成功表达VirB8融合蛋白。     

骨髓间充质干细胞经慢病毒转染绿色荧光蛋白后的体内观察

目的:观察经慢病毒转染绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs)移植注入兔椎间盘后的荧光时效性.方法:体外培养并纯化BMSCs,并用含有GFP标记的重组慢病毒载体(Lentivirus-GFP)转染后移植入兔椎间盘,在移植后2、4、6、8、10、12周用激光共聚焦显微镜观察BMSCs荧光强度及细胞增殖情况,考察慢病毒转染GFP体内荧光维持时间.结果:经慢病毒转染GFP后的BMSCs,荧光显微镜下48 h开始显现绿色荧光,72 h荧光亮度达到最高.植入体内后8周内均能用激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光,8周后荧光强度开始逐渐减弱,第2、4、6、8、10、12周6个时间点GFP-BMSCs的阳性率分别是(21.75±1.32)%、(33.07±3.53)%、(33.20±3.60)%、(29.90±4.23)%、(19.64±2.93)%和(10.91±3.43)%.结论:BMSCs在椎间盘微环境中能够稳定增殖,用慢病毒转染GFP的方法能在至少8周内可靠示踪其在椎间盘内的存活状态,8周后荧光强度开始逐渐减弱.     

帕金森病大鼠尾静脉注射和脑内两点直接注射超顺磁性氧化铁标记的BMSCs后活体MRI示踪观察

目的 选择有效的帕金森病(PD)大鼠超顺磁性氧化铁(SPIO)标记的骨髓基质干细胞(BMSCs)移植后MRI活体示踪研究方法.方法 分离、获取、纯化大鼠BMSCs,制作PD模型,SPIO标记BMSCs,用尾静脉注射和脑内两点直接注射将SPIO标记的BMSC移植到PD大鼠体内,MRI活体观察脑内SPIO标记的BMSCs情况,行组织病理分析.结果 PD大鼠脑内两点直接注射SPIO标记BMSCs后MRI TSE-TIWI、TSE-T2WI、FFE-T2WI序列均显示移植区低信号区,相应区的脑组织铁染色也可见SPIO标记的BMSCs;尾静脉注射法脑内均未见低信号灶,病理观察仅有1只鼠脑内见散在几个SPIO标记的BMSCs.结论 两种方法注射SPIO标记的BMSCs移植PD大鼠脑活体MRI示踪观察,脑内两点直接注射法优于尾静脉注射法.     

骨髓基质细胞自体移植治疗兔创伤性脑损伤

目的:研究BrdU和GFP作为兔骨髓基质细胞标记物的可行性。方法:分别用上述两种标记物标记兔骨髓基质细胞,检测了标记率,及细胞周期、凋亡率,并描绘生长曲线;制作兔创伤性脑损伤模型,并将标记的细胞经腰穿自体移植,移植后4周,行脑组织冷冻切片,并进行免疫荧光检查。结果:BrdU的标记率为73.3%,GFP的标记率为81.6%。两者对体外培养的兔骨髓基质细胞的生长特性均无明显影响。并在脑损伤部位发现移植细胞。结论:BrdU和GFP均可以作为兔骨髓基质细胞的标记物,自体移植标记后的细胞可以迁移到损伤脑组织。     

骨髓间充质干细胞移植对急性期脑梗死大鼠的干预作用

目的观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对急性期脑梗死大鼠的干预作用。方法按随机化原则将50只脑梗死大鼠模型随机分为BMSCs移植组、上清液移植组各22只及对照组6只。BMSCs组在脑梗死大鼠模型成功后3 h经静脉注入BMSCs 1 ml,上清液组注入上清液1 ml,对照组注入磷酸盐缓冲液(PBS)1 ml。术后28 d检测PBMSc在脑内的存活转化情况。分别于0、7、14及28 d观察记录各组大鼠的神经损伤严重程度评分(NSS)。结果 28 d后,BMSCs脑梗死灶边缘可见少量BrdU阳性细胞表达神经元特异性烯醇化酶(NSE),而上清液组及对照组病灶边缘则无NSE;细胞移植后,各组神经功能均有不同程度的恢复;从第7天起,BMSCs移植组NSS评分明显低于上清液组及对照组(P<0.05),而后2组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论骨髓间充质干细胞移植入急性脑梗死大鼠体内后,可存活、移行至梗死灶周围,并分化为神经元细胞,而且能够减轻脑梗死大鼠的神经损伤程度。     

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的BMSCs移植对脑出血大鼠TrkA表达的影响

目的：观察GDNF基因修饰的BMSCs移植对脑出血大鼠TrkA表达的影响。方法：通过脑立体定位仪向SD大鼠脑尾壳核注射胶原酶和肝素建立脑出血动物模型,并随机将大鼠分为生理盐水组、BMSCs组和BMSCs/GDNF组,各组又根据细胞移植后再喂养时间的不同（1w、2w）分为2个亚组。在脑出血第3d分别注射生理盐水和移植BMSCs及BMSCs/GDNF。采用免疫组织化学和Western blotting方法检测TrkA在大鼠脑组织内的分布与表达水平。结果：免疫组化显示TrkA阳性细胞主要分布于出血灶周边的纹状体、大脑皮质和下丘脑等区域;与生理盐水组相比,BMSCs组在1w和2w时TrkA免疫阳性产物表达明显增高;而BMSCs/GDNF组的TrkA免疫阳性产物表达在1w和2w时均显著高于BMSCs组和生理盐水组。Westernblotting检测也显示出BMSCs/GDNF组的TrkA蛋白表达在1w和2w时均明显高于BMSCs组和生理盐水组。结论：GDNF基因修饰的BMSCs移植能增强TrkA的表达,有利于改善病灶部位及周边区微环境,促进神经组织重塑。     

超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞治疗大鼠脑卒中的磁共振活体追踪

目的探索利用磁共振技术活体追踪干细胞的可行性以及干细胞对卒中大鼠脑梗死体积的影响。方法采集大鼠后肢股骨和胫骨骨髓,采用密度梯度离心法分离并培养骨髓间充质干细胞(BMSCs)。利用超顺磁性氧化铁和多聚左旋赖氨酸的混合物标记BMSCs,普鲁士蓝染色检测标记率。线栓法建立18只大鼠脑缺血2h再灌注动物模型,分为缺血对侧BMSCs移植组(细胞数1.5×105/15μl)、缺血同侧纹状体移植组(细胞数1.5×105/15μl)和对照组(15μlD-Hanks液)3组,每组6只。分别在脑缺血后第1天、细胞移植后第1天及第14天进行磁共振扫描,对各时间点梗死体积的变化进行统计学分析。结果超顺磁性氧化铁对BMSCs的标记率为96%。磁共振追踪显示移植后第14天缺血同侧移植组BMSCs向缺血灶边缘迁移,缺血对侧移植组BMSCs沿胼胝体弥散,但是3组之间的脑梗死体积变化差异无显著性(P>0.05)。结论超顺磁性氧化铁对干细胞标记率高,磁共振活体追踪有利于了解干细胞移植后的存活和迁移。BMSCs脑内移植对于卒中大鼠脑梗死体积的影响无统计学意义。     

转染绿色荧光蛋白-胰岛素融合基因的小鼠骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病小鼠

目的:构建含增强绿色荧光蛋白(EGFP)及胰岛素融合基因的重组质粒,转染小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察转染融合基因后BMSCs移植治疗糖尿病模型小鼠的治疗效果。方法:应用重叠延伸PCR技术合成insulin-IRES-EGFP和IRES-EGFP两段序列,分别克隆至逆转录病毒载体pMSCV中,经过包装细胞PT67的包装后转染小鼠BMSCs。荧光显微镜观察转染后EGFP的表达；RT-PCR法检测转染后胰岛素基因的表达。将转染了两种质粒的BMSCs培养后分别植入两组糖尿病模型小鼠体内,观察各组受体鼠血糖及体质量等指标的变化,并以正常对照组小鼠作对照。结果:成功构建重组质粒pMSCV-insulin-IRES-EGFP、pMSCV-IRES-EGFP;倒置荧光显微镜下观察到转染后的BMSCs发出稳定的绿色荧光信号。转染了pMSCV-insulin-IRES-EGFP的BMSCs能稳定表达外源性胰岛素基因,转染后小鼠血糖明显低于转染pMSCV-IRES-EGFP组(P<0.05),但仍高于正常对照组(P<0.05)；转染后35 d体质量明显高于转染pMSCV-IRES-EGFP组(P<0.05)。结论:重构的insulin-EGFP载体能够起到良好的示踪作用,且EGFP的表达不影响胰岛素基因的表达；转染融合基因的小鼠BMSCs移植治疗糖尿病小鼠可以部分缓解小鼠糖尿病症状。     

大鼠脑内移植超顺磁性氧化铁标记骨髓基质干细胞的MRI扫描序列优化研究

目的筛选并确定大鼠纹状体定向移植超顺磁性氧化铁（SPIO）标记骨髓基质干细胞（BMSCs）进行MRI活体观察的最佳扫描序列。方法32只大鼠于右侧纹状体单点注入20μlSPIO标记的BMSCs。使用1.5T超导磁共振成像仪和显微线圈,运用TSE-T1WI、TSE-T2WI和FFE-T2WI3种序列在大鼠移植细胞后即刻行MRI检查,测量并比较各序列图像的面积及信号强度,筛选出最佳观察序列。结果注射SPIO标记BMSCs的大鼠MRI检查于各序列断面图上纹状体区均可见类圆形、不规则形低信号区。其中FFE-T2WI序列显示低信号区域最大,且平均信号强度最小;TSE-T1WI序列低信号区域最小,平均信号强度最大;TSE-T2WI序列居中。结论使用1.5T超导磁共振成像仪和显微线圈,TSE-T1WI、TSE-T2WI和FFE-T2WI3种序列中FFE-T2WI序列可作为SPIO标记BMSCs进行MRI活体示踪最敏感的序列。     

BMSCs鼠脑移植对HIBD新生鼠脑血管再生的影响

摘 要：目的：分离培养鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）通过脑室注射移植给缺血缺氧性脑损伤（HIBD）大鼠,观察其对大鼠影响。方法：治疗组予脑室注射BMSCs,对照组予脑室注射等量生理盐水,免疫组织化学法进行检测。结果：在受损半球,治疗组各个时间点 VEGF表达强度及微小血管密度显著高于对照组。在移植后第1d,对照组及治疗组VEGF表达强度无差异。第3、7d治疗组VEGF表达强度及新生小血管均多于对照组,至2周两组再次恢复到相同水平。在治疗组大鼠脑组织切片中可以看到Brdu阳性细胞。结论：BMSCs通过脑室内注射的进入脑组织成活并定植,可增强VEGF表达。外源性的细胞移植能促进损伤脑组织血管再生,从而减轻脑组织缺氧缺血损伤的程度。     

恒磁场对Feridex-GFP 双标记BMSC 在损伤肝脏中定植的影响

目的：评价体外恒磁场作用下,双标记干细胞经外周静脉、门静脉、肝动脉移植在损伤肝脏中的定植 率及治疗急性肝损伤的有效性。方法：分离骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),经培 养传代纯化、体外诱导,分化为肝样细胞,绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和菲立磁(Feridex)体外双标 记BMSCs,不同途径移植双标记BMSCs至肝脏,于移植后第1,2,3,4周处死大鼠,测定血清丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)水平,并取肝组织做苏木精-伊红染色(HE染色)、荧光显微镜下观 察肝内GFP阳性率。结果：双标记BMSCs通过尾静脉、门静脉、肝动脉3种途径及其外加恒磁场作用下,移植后第4周 均能定植于肝脏,改善肝功能;在远期疗效不变的前提下,肝门静脉移植+恒磁场组、肝动脉移植+恒磁场组促进肝 功能的早期恢复。结论：BMSCs移植可有效治疗急性肝损伤,首选经门静脉+恒磁场、肝动脉+恒磁场途径,次选外 周静脉或外周静脉+恒磁场途径。