转基因大豆及其制品二重荧光定量PCR的建立与验证

研究选用花椰菜花叶病毒35S启动子(P-35S)和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子(T-NOS)为靶标基因,运用多重实时荧光PCR技术对转基因大豆及其制品进行快速筛选检测。实验通过样品核酸提取与质控,多重引物及荧光探针的设计与筛选,反应条件和反应体系的对比优化,摸索出二重荧光定量PCR检测的最佳反应体系。同时通过特异性、重复性、灵敏性和适用性实验验证,确保了该方法在同时检测2个靶标基因时,无荧光信号的相互干扰,不会出现假阴性和假阳性结果。结果表明,方法特异性高,可同时筛查两个靶标基因,扩增效率在90%~110%之间,标准曲线决定系数R²>0.98,确定了最低检测限为2拷贝/μL。开发和建立的二重荧光定量PCR检测技术可以实现一管多检的实际需要,降低试剂成本,缩短检测时间,为大豆及其深加工产品转基因成分的快速检测提供了有效方法,为促进食品进出口提供技术保障。     

大豆加工食品中转基因成分多重PCR检测体系的建立

以大豆内源基因 (Lectin)、筛选基因 3 5S启动子 (Cauliflowermosaicvirus 3 5S ,CaMV3 5S)、Nos终止子 (Nopalinesynthase,Nos)和外源基因 (5 enolpyruvylshikimate 3 phosphatesynthase ,Ep sps)为检测对象 ,通过对PCR扩增体系中各引物终浓度及PCR扩增过程中退火温度的探讨 ,研究了不同引物终浓度配比及退火温度对转基因大豆多重PCR检测的影响 ,建立了大豆加工食品中转基因成分多重PCR检测体系。结果表明 ,当各组引物的终浓度分别为 1 0、2 0、2 0、3 0 μmol/L即引物终浓度配比为 1∶2∶2∶3 ,退火温度为 5 5 4℃时 ,所建立的多重PCR检测方法能够有效地检测出大豆中的转基因成分 ,具有特异性好 ,简便 ,快速 ,准确等优点。     

豆制品中转基因成分的二重PCR检测体系的优化研究

目的由于转基因大豆及其制品日益增多,其安全性亦受到了越来越多消费者的关注。为满足消费者的知情选择权,本研究建立一种快速检测外源基因的方法。方法以转基因豆制品中存在的CaMV35S启动子和NOS终止子为检测目标,优化了二重PCR反应体系和条件,包括引物比例和酶的用量;运用聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测,并对聚丙烯凝胶电泳的银染条件进行探索研究。结果建立了运用聚丙烯酰胺凝胶电泳更好地区分出外源基因CaMV35S启动子和NOS终止子的目的条带的方法。结论本实验中的二重PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳方法适用于对转基因豆制品中这两个外源基因的检测,为转基因豆制品检测提供了指导。     

大豆异黄酮中转基因大豆成分检测研究

利用含有35S启动子、NOS终止子片段的质粒,确定相应检测方法的灵敏度为15个拷贝和150个拷贝;采用扩增CaMV35S启动子的2对引物、扩增NOS终止子的2对引物、扩增EPSPS目的基因的1对引物,对大豆异黄酮样品中转基因成分进行了检测,结果均扩增出了特异性片段,且测序结果正确。     

马铃薯及其制品中转基因成分的多重PCR检测

采用CTAB法提取15个马铃薯及其制品样品中的总DNA,内源PATA基因的PCR扩增结果均为阳性,表明已提取到DNA。应用根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因(nos)终止子和大肠杆菌K12菌株新霉素磷酸转移酶Ⅱ(nptⅡ)基因的二重PCR对样品进行转基因成分检测,结果均为阴性。将马铃薯DNA和阳性质粒pBI121混合作为PCR的反应模板,建立了内源PATA基因、花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaicvirus,CaMV)35S启动子、nos终止子和nptⅡ基因之间的多重PCR检测方法。多重PCR方法具有节约试剂、节省时间等特点,在转基因产品检测上的应用值得推广。     

玉米及其制品中转基因成分的单一 PCR及多重PCR检测

采用CTAB法提取玉米及其制品的总DNA，用PCR方法检测其中的转基因成分如花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus，CaMV）35S启动子、根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）胭脂碱合成酶甚因（nos）终止子、根癌农杆菌CP4菌株的EPSPS基因、吸水链霉菌（Treptomyces hygroscopicus）bar基因及苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种（Bacillus thuringiensis subsp．kurstaki）crylA（b）基因，筛选到阳性样品，并建立了几组玉米内源zein基因和转基因成分之间的多重PCR检测方法。结果表明，建立的多重PCR方法用于同时检测玉米内源基因和转基因成分是可行的，值得推广；虽然我国还未有己获准商品化生产的转基因玉米，但国外转基因玉米已流入福建省。     

PCR法检测大豆加工食品中的转基因成分

通过分子生物学手段,以聚合酶链式反应(PCR)技术为基础,建立了检测大豆加工食品中转基因成分的方法。实验分别采用CTAB法和试剂盒(Kit)法对大豆锅巴、豆浆、豆奶粉、豆腐、豆腐丝等五种大豆加工食品中的DNA进行了提取,用内标基因Lectin对此两种方法的提取效果进行了比较,并以提取的DNA为模板,利用不同的引物分别对目标基因35S和NOS进行了PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明:Kit法的DNA提取效果优于改良CTAB法,上述五种大豆加工食品中均检测出35S启动子和NOS终止子,且均含有转基因成分。     

PCR法定性检测大豆食用油中转基因成分

针对大豆食用油中核酸含量低且被严重破坏、DNA难以提取的问题,对CTAB法进行优化,有效从食用油中提取到可用于PCR扩增反应的DNA模板。同时定性检测出大豆内源基因lectin,外源调控序列启动子CaMV35S、终止子Nos及目的基因CP4-EPSPS序列,成功建立了基于PCR技术在大豆食用油中快速检测转基因成分的方法。     

PCR法定性检测大豆食用油中转基因成分

针对大豆食用油中核酸含量低且被严重破坏、DNA难以提取的问题,对CTAB法进行优化,有效从食用油中提取到可用于PCR扩增反应的DNA模板。同时定性检测出大豆内源基因lectin,外源调控序列启动子CaMV35S、终止子Nos及目的基因CP4-EPSPS序列,成功建立了基于PCR技术在大豆食用油中快速检测转基因成分的方法。      

五重PCR检测转基因大豆

旨在建立一套准确、快速、可靠的用于转基因大豆检测及DNA提取方法;以35S启动予(Cauliflowermosaicvirus 35S, CaMV 35S)、Nos终止子(Nopalinesynthase, Nos)、NPTⅡ、CP4-EPSPS四种外源基因和大豆内源基因(Lectin)为检测的目的片段,建立五重PCR反应体系,并采用改进的方法提取DNA,进行PCR扩增,实际检测了已知转基因大豆和市售大豆;改进的DNA提取方法与经典的CTAB方法相比,提取时间至少缩短了1h,降低了提取成本.经过PCR扩增对五种外源基因进行了检测,经DNA测序证实了产物为目的扩增产物.转基因大豆的检出限为0.2%～0.5%.改进后的DNA提取方法能够快速提取用于PCR扩增的高质量模板,消除了PCR反应的抑制因子;建立的五重PCR反应体系能够高效、准确的检测转基因大豆.     

番木瓜及其深加工制品中转基因成分定性PCR检测方法的建立(英文)

本研究对番木瓜不同材料及其深加工制品的核酸提取方法进行了优化,成功提取出可用于PCR扩增反应的DNA。选取番木瓜特异性的内源蛋白PAPAIN基因片段作为内参基因,用于检验提取DNA的质量,有效避免了PCR反应的假阴性并能用于确定检测样品中是否含有番木瓜成分。选取国内目前应用比较多的外源目的基因环斑病毒外壳蛋白(CP)基因以及复制酶(RP)基因作为品系鉴定的基因。本方法适用于出入境检验检疫部门和农业部门对转基因番木瓜及其制品的检验监测。     

转基因大豆MON89788双重数字PCR通用定量检测方法的建立

建立一种特异、稳定、灵敏、通用的转基因大豆MON89788品系双重数字聚合酶链式反应（digital polymerase chain reaction,dPCR）定量检测方法,在一个体系内同时进行内外源基因的定量检测,适用于微滴式数字PCR（droplet digital PCR,ddPCR）和芯片式数字PCR（chip digital PCR,cdPCR）平台,并通过了食品分析能力评价体系国际能力验证项目的盲样检测评价。ddPCR平台对大豆MON89788品系和内源Lectin的绝对定量限分别为8.0copies/μL和8.2copies/μL;cdPCR平台对大豆MON89788品系和内源Lectin的绝对定量限分别为7.443copies/μL和7.646copies/μL;ddPCR和cdPCR对转基因大豆MON89788品系成分相对含量的相对定量限均为0.1%。     

多重PCR方法对大豆转基因食品的定性检测

为了同时检测转基因食品中所含的多个目标基因序列,本文采用多重PCR分析技术对转基因大豆食品进行了检测。为了排除扩增结果的假阴性,大豆外源凝集素基因和肌动蛋白基因被作为内部对照以评价所有PCR反应的效率。当转基因大豆含量仅为0.15%时,仍然可以对转基因食品进行可靠的鉴定,从而表明该方法的高度敏感性。该文所述的多重PCR系统是一种简单、准确并且敏感的检测方法,只需要进行一个反应就可以检测多个目标基因序列,因而可以用来对转基因原材料及加工成品进行高精度、高灵敏的检测。     

多重PCR 检测转基因水稻的转基因成分

以水稻内源基因SPS、外源抗虫基因Cry1Ab、外源抗虫基因Cry1Ab/Ac、外源抗虫基因Btc、报告基因GUS、NOS终止子和CaMV35S启动子为检测对象,设计7对引物,通过优化PCR扩增体系中不同引物浓度的配比及退火温度,建立水稻转基因成分的七重PCR检测体系。结果表明：建立的七重PCR体系能有效检测出水稻及其他作物(大豆、玉米、棉花籽、菜籽粕)中的转基因成分,检测过程简便、特异性好。     

利用微滴式数字PCR技术检测大豆毛油中的转基因成分

我国是转基因大豆的进口大国,由转基因大豆加工而成的大豆油成为进入消费者生活的食用油,判定食用的大豆油是否含有转基因成分,是国家监管部门和公众消费者密切关心、关注的问题。大豆油在制备精炼过程中破坏了大豆的DNA,造成检验时DNA富集难度增加,严重影响了大豆油转基因成分检测的准确度。到目前为止,国家已经颁布的标准中没有涉及转基因大豆油的检测标准。本研究利用高灵敏度、精确度的数字PCR技术,并通过优化大豆毛油DNA提取方法和PCR反应体系,对大豆毛油样品进行外源转基因成分检测。检测结果显示,大豆毛油外源转基因成分被成功检测到。实验结果表明,本研究建立的大豆毛油转基因成分检测方法准确可靠,可进行推广应用。     

SYBR Green实时荧光定量PCR检测大豆转基因成分

采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术,建立了食品中大豆转基因成分的定量检测方法。通过设计特异引物,扩增内源参照基因lectin和转基因靶基因CP4EPSPS,建立两种基因的拷贝数-CT标准曲线,根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量,并且通过熔解曲线分析扩增反应特异性。结果表明,lectin和CP4EPSPS基因标准曲线线性关系好,R2值分别为0.9984和0.9953,方法的回收率为95%～110%,检测限为0.01%。本检测方法具有快速、灵敏、准确、特异、高通量等优点,可以作为食品中大豆转基因成分的定量检测方法。     

荧光PCR和数字PCR法检测转基因DAS-44406-6品系大豆

目的：建立实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测转基因DAS-44406-6品系大豆的定性检测方法和使用数字PCR检测转基因DAS-44406-6品系大豆的定量检测方法。方法：针对转基因DAS-44406-6大豆品系,进行5’-RACE,测定该品系转基因大豆外源片段与大豆染色体重组的边界序列,并根据该边界序列设计引物和探针。使用23 种非DAS-44406-6品系转基因植物作为阴性对照测试实时荧光PCR引物和探针的特异性,以DAS-44406-6品系样品制备6 个含量梯度的样品进行检测低限实验。使用数字PCR技术进行定量检测,并确定定量检测的低限。结果：建立的转基因DAS-44406-6大豆品系的实时荧光PCR特异性检测方法品系鉴定特异性较强,实时荧光PCR检测方法的检测低限在模板DNA浓度为100 ng/反应时,为0.01%的转基因大豆含量,约为16.6 个拷贝的DAS-44406-6基因组DNA;数字PCR检测方法的检测低限在模板DNA浓度为0.5 ng/反应、转基因大豆含量为1%时,相对标准偏差为0.7%。因此,建立的转基因DAS-44406-6大豆品系实时荧光PCR和数字PCR特异性检测方法符合转基因检测的要求。