植物RNA干涉载体的构建及其在水稻基因表达沉默中的应用

为了方便利用RNA干涉（RNA interference，RNAi）研究植物基因的功能，本研究构建了2个用于RNAi的植物转化载体pRNAi-35S和pRNAi-Ubi。这两个载体以pCAMBIA双元载体为骨架，含有2个多克隆位点区进行目的基因片段的正向和反向克隆，并分别由CAMV35S启动子和玉米泛素基因启动子控制发夹结构RNA的产生。为了验证该载体的有效性，用PCR扩增了1个水稻转录因子（Arabidopsis AP2／EREBP同源基因）基因片段组装入pRNAi—Ubi，转化水稻获得转化体。在所检测的7株转化株中，5株的内源目标基因的mRNA被降低至RNAblot检测不到的水平。这些结果说明本研究构建的RNAi载体对基因表达沉默是有效的。     

津田芜菁隐花色素CRY1 RNA干涉载体的构建

隐花色素CRY1在拟南芥光形态建成及光信号转导中起重要作用,在津田芜菁(Brassica rapaL. subsp. rapa ‘Tsuda’)中是否起相同作用尚未报道。本研究利用实验室已克隆得到的津田芜菁CRY1基因的cDNA全长序列,在NCBI进行序列比对,选取特异的片段。同时根据Gateway克隆技术特点,设计含有attB接头的引物。利用高保真的LA Taq DNA聚合酶,通过PCR方法在目的片段的两端加上attB序列。通过BP反应和LR反应将CRY1基因片段克隆到pH7GWIWG2(I)双元干涉载体。对重组载体pH7GWIWG2(I)-CRY1的鉴定结果表明成功构建了CRY1基因的干涉载体。利用Gateway克隆技术构建植物干涉表达载体简便易行,该结果为遗传转化研究其功能奠定了基础。     

应用Gateway技术构建水稻OsDAD1基因的RNA干涉载体

近年来,RNA干涉广泛应用于植物基因功能研究.Gateway技术是通过采用多重载体高效构建目标基因及任何DNA片段克隆和表达载体的研究平台,该技术以λ噬菌体的位点特异性重组体系为基础,两端具有重组位点的DNA片段或目标基因可以非常容易地被重组克隆到含同源重组位点的载体上.这种以重组为基础的克隆体系目前已被广泛应用于分子生物学中来分析基因的功能.本文应用Gateway技术体系替代传统载体构建方法,构建了水稻基因OsDAD1的RNA干涉载体,从而证明了Gateway技术的可行性.     

OsRPK1基因过表达和RNA干涉对水稻苗期耐盐性的影响

水稻OsRPK1基因属于富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶,在盐胁迫下其表达量暂时升高后出现明显下降。前期研究表明, OsRPK1基因过表达会造成拟南芥非生物胁迫耐受性明显降低。本研究对OsRPK1基因在水稻中实现过表达和RNA干涉,进而对OsRPK1的抗逆性功能加以探究。结果表明, OsRPK1基因表达量增加时,水稻幼苗表现为耐盐性下降;RNA干涉则使水稻幼苗表现为耐盐性增加。盐胁迫后OsRPK1过表达植株脯氨酸含量低于野生型、MDA含量和相对电导率显著高于野生型,而OsRPK1-RNAi水稻植株的脯氨酸含量显著高于野生型、MDA含量和相对电导率显著低于野生型。因此, OsRPK1基因的表达量对水稻耐盐性具有明显影响,脯氨酸含量及细胞质膜受破损程度的改变可能是造成转基因水稻耐盐性变化的内在原因。本研究为进一步阐明OsRPK1基因的抗逆作用机制奠定了基础,对于通过调整该基因表达改良水稻的耐盐性具有重要意义。     

植物RNA干涉载体的构建并用于拟南芥芥子酶基因的表达

为了研究RNA干涉在抑制芥子酶基因TGG4和TGG5表达中的作用,本文在TGG4、TGG5编码序列中设计IT45 siRNA的特异靶序列,以拟南芥7SL-4基因为模板扩增启动子和终止子,连接并克隆到植物表达载体pBP5中,构建成了siRNA真核表达载体.同时利用花序浸泡法转化拟南芥.最后酶活测定的结果显示,TGG4、TGG5基因的表达受到了大部分抑制.这说明本研究构建的RNAj载体对基因表达沉默是有效的.     

植物多倍化过程中小分子RNA调控基因表达机制研究进展

多倍体在植物界中广泛存在,因其往往具有显著超出双亲的生长优势和适应性而成为植物学研究的热点之一。越来越多的研究表明小分子RNA介导的基因激活或沉默及染色质修饰在植物多倍化过程中的基因表达调控方面发挥重要作用。本文结合本实验室在小麦多倍化研究中的观察,着重综述近几年来小分子RNA层面的植物多倍化过程中基因表达调控的机制,以期对多倍体作物的研究和利用提供有益的借鉴。     

RNA干涉技术及其在作物育种研究中的应用

RNA干涉(RNAi)是通过双链RNA(dsRNA)将同源mRNA高效特异降解,从而阻断特定基因的表达。作为一种新兴的下调表达技术在作物研究中得到广泛应用。本文简要概括RNAi的原理,回顾了近年来RNAi技术在作物基因功能研究、作物品质改良、作物抗病虫方面的应用,并对其存在的问题作了初步探讨。     

RNA干涉及其在植物改良上的应用

NA干涉是一种双链RNA诱导的转录后基因沉默现象,存在于多种生物体内.由于转录后基因沉默(PTGS)和双链RNA引起的基因沉默都具有系统传递的特性,因此可以在特定部位诱导RNAi,利用RNAi的系统传递性抑制其他部位该基因的表达.本文简要介绍了RNAi的机理,RNAi表达载体的构建方法以及RNAi传递性及其作物育种上的应用,以助于在植物研究中实现RNAi.     

一种适宜棉花microRNA实时定量分析的总RNA提取方法

为满足棉花组织micro RNA结构与功能研究的需要,建立了棉花高质量的总RNA提取方法.以陆地棉纤维和胚珠为供试材料,采用改良的异硫氰酸胍-硫氰酸铵-酸酚法提取总RNA,利用stem-loop RT-qPCR法鉴定成熟的miRNA.结果表明此方法能得到高质量的总RNA,并且miRNA的回收率较高,足以满足mi-croRNA水平的实时定量分析.     

RNA干扰及其植物抗病毒应用

【研究目的】RNA干扰(RNA interference,RNAi)是分子生物学研究领域的一项新兴技术,在动植物的遗传改良、功能基因组、基因治疗等研究中广泛应用;【方法】它是指一些小的双链RNA分子介导的、序列特异的转录后基因沉默现象;【结果】本文就RNA干扰的作用机制、RNA干扰与植物病毒间的互作以及RNA干扰表达载体构建的一些研究进展进行了综述;【结论】随着RNAi研究的进一步深入,RNAi必将成为遗传育种工作者培育抗病毒植物的有力手段,促进植物抗病育种的发展。     

RNA干扰及其在植物研究中的应用

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是双链RNA诱导的转录后基因沉默。RANi在生物体内普遍存在,且高度保守,被生物学家誉为生物体在基因组水平上的免疫系统。随着RNAi机制研究的不断深入,RNA干扰作为一种高效的、序列特异的基因沉默,可在植物基因功能分析、农作物基因组改良和植物抗病毒研究等方面发挥重要作用。     

软体动物毛蚶RNA干扰技术的应用研究

为了在软体动物中建立RNA干扰技术,以用于毛蚶基因功能研究。通过体外转录技术合成双链RNA,并将其注射毛蚶干扰目标基因的表达。肌肉注射双链RNA 48 h后取样,用RT-PCR技术检测目标基因的表达变化,以确定干扰的有效性。结果显示：各目标基因的表达均能被各自特异的双链RNA有效干扰而降低。在注射双链RNA后不同时间点,即12、48、72、96、120 h,取样检测目标基因的时序表达,以确定目标基因表达被干扰的时间效应。发现目标基因的表达在48 h即能有效降低,而且有效时间能持续至120 h以上。对注射双链RNA的动物个体,于48 h取样检测不同组织的目标基因表达,发现毛蚶的RNA干扰效应能系统性地在不同组织发生,表明干扰效应能在不同组织之间进行传递。因此,本研究报道了一种稳定的毛蚶RNA干扰技术,为在毛蚶中进行基因功能鉴定和抗病毒研究提供了一个有效的分子生物学的方法。     

siRNA干涉技术在黄曲霉毒素抑制中的研究

构建真菌基因敲除突变体的传统方法周期较长,为了快速检测和高通量筛选具有特定功能的目标基因,本研究利用小分子RNA干涉技术,沉默了黄曲霉毒素生物合成关键基因,有效降低了黄曲霉毒素B1(AFB1)的生物合成。通过设计合成人工小干涉RNA(artificial siRNA),特异靶向黄曲霉毒素合成路径的关键基因aflR,将siRNA直接转化黄曲霉原生质体,有效沉默了黄曲霉毒素合成的关键调控基因aflR,并导致AFB1的合成明显减少。利用特异靶向黄曲霉毒素合成路径中其他11个靶标基因的siRNAs,通过原生质体转化方法可直接沉默这些基因,沉默后这些基因的转录水平均显著降低,其中hypC和aflW两个基因沉默后AFB1的生物合成量与对照相比下降显著。此外,利用特异靶向黄曲霉毒素合成基因簇外基因的siRNA,如pks-nrps基因,通过siRNA干涉技术沉默该基因同样可显著降低AFB1的合成。因此,本研究借助小分子RNA干涉技术,建立了一种快速检测和高通量筛选黄曲霉毒素生物合成路径相关基因的反向遗传学方法。     

RNA干涉技术与棉花高油育种

 棉子脂肪酸既是重要的食用油,又是重要的工业原料。但是关于棉子遗传改良的研究报道甚少。研究表明,PEPcase和ACCase的相对活性决定种子的蛋白质与油脂的含量,应用RNAi技术抑制PEPcase催化活性,可以提高脂肪酸总量。本文概述了棉花油分与RNAi技术的研究现状,并阐述了应用RNAi技术改良棉花高油分育种的技术路线。     

以RNA干扰γ-氨基丁酸转氨酶1基因(OsGABA-T1)表达提高稻米γ-氨基丁酸(GABA)含量

γ-氨基丁酸(GABA)是一种四碳非蛋白质氨基酸, 具有降血压等功能。为提高稻米中GABA含量, 利用RNA干扰技术, 构建水稻中GABA代谢关键酶GABA转氨酶1基因(OsGABA-T1)的干扰载体, 通过农杆菌介导法, 将其转化至粳稻品种宁粳1号中。实时荧光定量PCR检测结果表明导入的RNA干扰结构成功地降低了目的基因OsGABA-T1的表达, 且干扰家系中OsGABA-T2基因表达也随之下降。对转基因T₃代稻米GABA含量测定发现, 糙米中GABA含量相对于对照增加了13倍以上, 精米中GABA含量也显著增加, 而其他主要氨基酸含量则没有明显变化。测定储藏4个月的转基因稻米发现, GABA含量仍具有较高水平。所以, 利用RNA干扰技术可有效提高稻米γ-氨基丁酸(GABA)含量, 为培育富含GABA的降血压功能性水稻品种提供基础。     

青虾transformer-2基因RNA干扰规律的研究

通过对青虾性别调控相关基因transformer-2（tra-2）的RNA干扰规律进行研究,探讨了tra-2 基因RNA干扰的最适注射部位、注射剂量、干扰效果以及干扰规律等。通过对青虾肌肉、心脏、围心腔和眼柄基部注射比较发现,围心腔注射死亡率最低,适宜RNA干扰研究。采用4 μg/g 的dsRNA剂量进行时间依赖性干扰试验,RT-PCR检验注射后第1,7,14 天的卵巢tra-2 表达量,结果显示第7 天基因表达量出现显著降低（P<0.05）。不同剂量水平（0.4 μg/g、4 μg/g 以及12 μg/g）干扰研究发现,0.4 μg/g dsRNA没有干扰结果,4 μg/g 和12 μg/g 剂量的干扰效果均显著。与4 μg/g 的剂量相比,12 μg/g 的dsRNA能在较短时间内起到明显的干扰效果,且能持续较长的时间,表明干扰规律会随着剂量的改变而变化。但两组tra-2的最低表达量分别为正常水平的23%和21%,无显著差异（P>0.05）。     

棉铃虫HaHR3基因的克隆及其植物RNA干扰载体的构建

采用RT-PCR方法克隆了棉铃虫蜕皮调节转录因子HaHR3基因,该基因含有1671 bp的完整开放阅读框。序列分析表明,HaHR3与多种昆虫蜕皮调节转录因子高度同源。利用生物信息学方法对HaHR3的结构特征进行分析发现,HaHR3具有蜕皮调节转录因子超家族的典型特征,包括两个锌指结构和一个DNA结合结构域,不存在信号肽序列和N糖基化位点。选择HaHR3基因的部分片段构建了RNAi中间载体pRNAi1017-HaHR3sa,再将HaHR3正反向序列亚克隆至植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS,成功构建了由35s启动子调控的HaHR3基因的正反向RNA干扰载体pCAM-RNAi-HaHR3。这一载体的成功构建为下一步通过植物介导的RNA干扰技术防治棉铃虫打下了坚实的基础。     

紫花苜蓿光敏色素B基因片段克隆及RNA干扰表达载体的构建

根据紫花苜蓿2级标准品种Vernal PhyB基因的序列(GenBank登录号为GQ379903.1),设计2对含有酶切位点的特异性引物F1/R1和F2/R2,以紫花苜蓿总RNA为模板,通过RT-PCR法扩增得到PhyB基因正向、反向目的片段,将片段连接到pGEM-T Easy载体上得到重组载体pGEMB-1和pGEMB-2,再以中间载体pHANNIBAL和植物双元表达载体pART27为基础,通过多次酶切和连接,成功地构建了紫花苜蓿PhyB的RNAi表达载体。为进一步研究光敏色素B与苜蓿秋眠性之间的关系奠定了基础。     

RNA干扰对烟草NtPPO8基因沉默的效应分析

多酚氧化酶（PPO）是发生酶促褐变的关键酶,PPO活性过高会使烟叶变褐。为明确烟草NtPPO8基因对PPO活性的影响,建立降低NtPPO8基因表达量的病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）体系,探究使用RNA干扰技术对烟叶NtPPO8基因表达量及PPO活性的影响。以中烟100和K326为材料,分析在移栽后50d进行VIGS载体侵染的植株,并在侵染后10、20、30、40d分别测定NtPPO8基因表达量及PPO活性。结果表明,接种VIGS载体的转化植株,其中在侵染后20d时NtPPO8基因的沉默效率最高,为78.46%;随着侵染时间推移,NtPPO8基因的沉默效率逐渐降低,在接种后40d内有效表达;且转化植株中的病毒载体会随着植株的生长而向上传导,随着接种部位的上移,沉默效率逐渐降低。因此,研究建立VIGS体系能够有效沉默NtPPO8基因的表达,并且有效降低PPO活性,为提高烟叶耐烤性及降低烟叶褐变比例提供了新的思路和方法。