犬冠状病毒核酸探针的制备及其基因序列的测定与比较

采用RT-PCR方法扩增犬冠状病毒(CCV)YS1、C11和NL-18株5′端部分S基因序列,以随机插入DNA法对CCV YS1株纯化的PCR产物标记32P同位素,制备核酸探针,并与3株CCV反转录产物杂交.用平端连接法将3株CCV PCR产物克隆于pUC19 Sma I位点或pGEM-T载体中,经PCR鉴定为正确重组质粒.以双脱氧末端终止法测定了重组质粒的cDNA核苷酸序列,并用DNASIS计算机软件进行多重比较分析,绘制系统树.结果表明,所制备的核酸探针可与3株CCV反转录产物杂交,其核苷酸序列与多株CCV相应序列的同源性高达91.9%～99.1%,为CCV的保守区.由此说明,制备的核酸探针可用于犬CCV感染的分子流行病学研究.     

核酸探针检测犬冠状病毒方法的建立和初步应用

以^32P标记犬冠状病毒特异性RT—PCR及产物制成核酸探针，与CCV NL-18株、犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒、狂犬病病毒反转录产物、正常CRFK细胞以及做10～10000倍稀释的CCV NL-18株反转录产物杂交，进行核酸探针的敏感性和特异性试验。结果表明，该探针仅与CCV HLl8株反转录产物呈阳性杂交，与对照病毒和正常细胞反转录产物均呈阴性反应。初步应用试验结果，该探针可与国内CCV分离病毒YSl、CI1株杂交，且可从8份腹泻犬粪便中检出5份CCV阳性病料。本研究为在我国开展犬冠状病毒感染的分子流行病学调查和临床诊断提供了一种敏感、特异的检测方法。     

犬冠状病毒分子生物学研究

本研究根据Ｗｅｓｓｅｌｉｎｇ发表的犬冠状病毒（ＣＣＶ）Ｋ３７８株纤突蛋白（Ｓ）基因序列，设计合成了４条寡聚核苷酸引物Ｐ１（１８ｂｐ，１５２０－１５３７ｂｐ），Ｐ２（１９ｂｐ，２０７２－２０９０ｂｐ）和Ｐ３９（２０ｂｐ，２６２１－２６４０ｂｐ），Ｐ４（２０ｂｐ，２９４４－２９６３ｂｐ），以Ｐ１，Ｐ２和Ｐ３，Ｐ４为引物，以美国ＣＣＶＮＬ－１８株反转发产物为模板，建立了ＣＣＶＲＴ－ＰＣＲ方法，并将其中纯     

犬冠状病毒纤突蛋白基因的序列测定与比较分析

将丙株犬冠状病毒国内分离毒CCVYS1，CCVCI1接种于CCV中和抗体效价低于1：4的2月龄幼犬，观察接种犬临床表现，体温和剖析变化。结果表明，CCVYS1株毒力较强，CCVCI1株毒力较弱，采用RT-PCR方法扩增出两株病毒部分S基因序列，克隆于pUC19SmaI位点或pGEM-T载体中，以双脱氧末端终止法测定插入质粒的cDNA核苷酸序列。用PROSIS计算机软件推导氨基酸序列，并与从Genbank上查到的CCV，TGEV和FIPV相应氨基酸序列进行多重比较。分别推测，CCVS蛋白上Ac抗原位点的氨基酸残基可能是影响病毒毒力的因素之一。     

犬冠状病毒BEI灭活苗的制备与免疫试验

烷化剂类灭活剂是一类含烷基分子去一个氢原子 ( Cn H2 n 1)化合物 ,它能与另一种化合物作用 ,将烷基引入形成烷基取代物 ,根据其结构可分为氮芥类、乙烯亚胺类和磺酸脂类。这类化合物的化学性质活泼 ,其灭活机制主要在于烷化 DNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤 ,引起单链断裂、双螺旋键交联 ,妨碍RNA的合成 ,从而抑制细胞分裂。另外 ,也可与微生物的酶系统和核酸蛋白起作用 ,干扰核酸的代谢 ,因此 ,这类灭活剂能破坏病毒的核酸 ,使其完全丧失感染力 ,但并不损害其蛋白质衣壳 ,得以保留其保护性抗原 ,故是制备灭活病毒疫苗较好的灭活剂。据报道…     

犬冠状病毒超免疫血清的制备及应用

采用犬冠状病毒（ＣＣＶ）弱毒株和强毒株多次免疫健康犬，采集超免疫血清，其ＣＣＶ血清中和（ＳＮ）抗体效价高达１：２１０。试验结果表明，该超免疫血清安全、特异，无毒副作用，每只幼犬注射１．５ｍＬ／ｋｇ体重的该血清即可使９０％以上的犬获得１０￣１５ｄ的被动免疫保护；对１１０只患ＣＣＶ性肠炎病犬的临床治疗结果表明，该超免疫血清治疗效果可靠，其治愈率达９４％。     

犬冠状病毒压力灭活苗的制备与应用研究

使用静水压高压灭活的方法制备犬冠状病毒（ＣＣＶ）蜂胶佐剂灭活苗,将此灭活苗免疫接种易感犬,同时以ＣＣＶ甲醛灭活苗作对比试验。结果表明,ＣＣＶ压力灭活苗安全可靠,其诱导试验犬产生中和抗体的能力明显高于该病毒的甲醛灭活苗,临床应用证明该灭活苗可以控制犬冠状病毒笥肠炎的发生与流行。     

犬冠状病毒的分离鉴定及其纤突蛋白基因的克隆与序列比较

以犬胎原代细胞，采用同步接种、带毒传代和添加新细胞的方法，从１例腹泻犬脾脏和１例临床健康犬肠内容物中分离出２株犬冠状病毒（ＣＣＶＹＳ１，ＣＣＶ ＣＩ１）。该２株病毒可使ＣＲＦＫ细胞出现典型的细胞融合病变，与从美国引进的ＣＣＶＮＬ－１８参考株形成的细胞病变相似；电镜负染和超薄切片观察，分离毒株细胞培养物中均含有典型的冠状病毒粒子，并形成胞浆内包涵体；经理化学、生物学鉴定，濉有ＣＣＶ的特性；间接免疫荧     

大熊猫犬冠状病毒部分S基因的克隆与全S基因序列分析

从重庆某动物园死亡的大熊猫肝脏中分离到一株病毒，经鉴定为犬冠状病毒（命名为CCV DXMV）。本实验根据CCV K378和CCV Insavc-1株基因序列设计合成了普通PCR引物SF1-SR1和SF2-SR2，以及半套式引物SF3-SR3、SR13、SF13、SF4-SR4和SF14，分段扩增了CCVDXMV株部分S基因，得到了368bp、792bp、737bp、1178bp和985bp5个基因片段。将纯化的RCR产物分别克隆到pGEM—T载体中，通过筛选和鉴定，获得了5个阳性重组质粒。将重组质粒送生物公司测序，将测得的基因序列与先前测定的该株病毒部分S基因序列，拼接成全S基因序列，并与其它株CCV及TGEV HN2002和FIPV79—1146株的S基因序列进行分析比较，绘制进化树。结果表明，该株病毒与CCV K378株的同源性最高，达到99．4％；而与CCV 23／03株的同源性最低，为56．9％；与FIPV和TGEV分别有90．4％和82．1％的同源性。     

鸭圆环病毒核酸探针的制备与应用

用地高辛标记鸭圆环病毒（DuCV）全基因组克隆制成核酸探针,与鸭病毒性肝炎Ⅰ型病毒（DHV-Ⅰ）的cDNA、鸭瘟病毒（DPV）的DNA和DuCV的DNA进行斑点杂交以检测核酸探针的特异性,结果该探针只与DuCV的DNA杂交呈阳性。敏感性结果表明,该探针对DuCV的最低检出量约为5PgDuCV的DNA。应用该探针对从山东、江苏、四川等地采集的196只鸭病料,共980份脏器的组织DNA进行检测,结果个体阳性率为33．2％（65／196）,在各脏器中法氏囊和肝脏中DuCV检出率较高,检出率分别为52．3％和49．2％。同时对上述样品进行PCR检测,核酸探针检测与PCR检测2种方法的符合率为87．5％。结果表明,制备的DIG标记的核酸探针特异性强、敏感性高,适合对DuCV进行诊断和流行病学调查。     

核酸探针技术及其在大肠杆菌诊断中的应用

核酸探针又称基因探针,是随着分子生物学及分子遗传学的深入发展而产生的一种新的检测技术。与常规的实验室检测方法相比,核酸探针技术具有高度特异、敏感、快速、简便等优点。近几年,基于探针只能和靶细菌等的 DNA 杂交,而不与其它 DNA 杂交的原理,已将探针技术作为一种有效的检测手段,应用于细菌、病毒、疟原虫、钩端螺旋体等的鉴定和分类,并收到一定效果。     

我国动物核酸探针的研究进展

核酸探针技术,是近几年来发展起来的新的检测方法和研究手段,它与传统的和新近发展起来的各种免疫学和血清学方法相比较,具有灵敏度高、特异性强、使用方便及核酸探针便于大批量生产等优点。自八十年代初用于诊断单纯疱疹病毒以来,已发展成为病毒、细菌和寄生虫病、遗传病等的临