毛兰素诱导人白血病HL—60细胞的凋亡

目的：研究毛兰素对HL－60细胞增殖的抑制作用,探讨其诱导细胞凋亡的机制。方法：用MTT比色法测定了毛兰素对HL－60细胞增殖的抑制作用：应用荧光显微镜、透射电镜、DNA电泳及流式细胞仪观察了药物对细胞凋亡的诱导作用,并用免疫组化的方法从基因水平阐述了凋亡的发生。结果：毛兰素20－81．9nmol/L在72h内显著抑制HL－60细胞增殖,作用24h后,对HL－60细胞的IC50为38nmol/L,而阳性对照药长春新碱对HL－60细胞的IC50为101nmol/L,前者明显优于后者;形态学观察可见凋亡的特征性改变;琼脂糖电泳出现典型的DNA“ladder”;流式细胞仪结果表明细胞被阻滞于G2／M期;免疫组化可见bcl-2表达下降,bax表达升高。结论：毛兰素显著抑制HL－60细胞的生长,该抑制作用可能是通过诱导细胞凋亡和改变HL－60细胞bcl-2和bax基因的表达而实现的。     

砷诱导的肝癌细胞凋亡及端粒酶活性改变

目的：研究三氧化二砷（As2O3)对肝癌细胞凋亡的诱导作用及其机制。方法：1μmol/L As2O3处理培养的人肝癌HCC－9204细胞48h，用形态学观察、细胞超微结构分析和流式细胞仪检测等方法鉴定细胞凋亡。用噻唑蓝（MTT）比色试验观察蛋白质全盛抑制剂放线菌素D对As2O3凋亡诱导作用的影响。用TRAP－PCR－ELISA法检测As2O3处理前后肝癌细胞端粒酶活性的变化情况。结果：1μmol/L As2O3作用48h后，HCC－9204细胞出现了典型的凋亡形态学改变和超微结构变化；流式细胞仪检测到大量Annexin-阳性、PI－阴性细胞、放线菌素D可明显拮抗As2O3的凋亡诱导作用。细胞凋亡发生后端粒酶活性显著降低，A450/A630值从2．874降为0．767。结论：As2O3可以有效诱导肝癌细胞凋亡，端粒酶活性降低可能是其中的机制之一。     

As2O3诱导K562细胞凋亡过程中细胞表面电荷变化的研究

目的 :研究三氧化二砷 (As2 O3 )诱导K562 细胞凋亡时细胞表面电荷的变化 ,阐明As2 O3 诱导K562 细胞凋亡的可能机制 ,为As2 O3 在临床上的应用提供理论依据。方法 :应用细胞电泳仪检测As2 O3 诱导K562 细胞凋亡中细胞电泳率的变化。通过细胞增殖、活力检测 ,形态学观察 ,亚G1期细胞含量和DNA凝胶电泳等鉴定细胞凋亡。结果 :1.0～ 2 0 μmol·L-1As2 O3 作用于K562 细胞 ,在细胞形态、DNA凝胶电泳、FCM显示出典型的细胞凋亡特征之前 ,试验组细胞表面电荷已在 1.6h左右开始下降 ,6h内降低最明显 ,6h后虽有下降 ,但幅度明显减弱。与对照组比较 ,低于 1.0 μmol·L-1的As2 O3 对细胞表面电荷影响不大。结论 :细胞表面电荷的下降是K562 细胞凋亡的早期事件。细胞表面电荷的下降有一定的时间范围 ,超过此范围 ,细胞表面电荷下降趋向无限大。     

地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡中线粒体质量的变化

目的研究地塞米松(DEX)诱导的小鼠胸腺细胞凋亡中线粒体质量变化。方法分别设对照组(Control)和DEX组;在6 h,分别以NAO和M itotracker G reen(MG)单染流式细胞术检测线粒体质量变化,以D iOC6(3)染色流式细胞术检测线粒体膜电势变化,以Annexin V-PE/MG双染流式细胞术检测细胞凋亡中线粒体质量改变特点。结果NAO染色检测结果显示终浓度1μmol.L-1DEX可以诱导小鼠胸腺细胞线粒体心磷脂含量降低,与对照组比较P<0.01;MG染色流式细胞术结果表明DEX(P<0.01)诱导了胸腺细胞线粒体质量的降低;DEX(P<0.01)诱导线粒体膜电势依赖性D iOC6(3)在胸腺细胞中可染性下降;Annexin V-PE/MG双染流式细胞术显示,凋亡细胞中存在一定比例的低线粒体质量细胞,DEX组该群细胞多于对照组(P<0.01)。结论DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡中线粒体质量降低;线粒体质量评价在细胞凋亡相关药理学研究领域有应用前景。     

喜树碱诱导人白血病HL-60细胞凋亡过程中端粒酶的调控(英文)

目的:研究在喜树碱诱导人白血病HL—60细胞凋亡过程中端粒酶的调节变化规律.方法:用MTT法测定药物对细胞存活率的影响;用琼脂糖电泳及流式细胞术检测和定量凋亡的发生;用以PCR为基础的TRAP法测定端粒酶活力;逆转录PCR检测凋亡过程中bcl-2及端粒酶亚基hTR、hEST2/hTERT和TLPl/TPl的基因表达水平的变化.结果:端粒酶活力伴随喜树碱诱导HL-60细胞凋亡的发生而逐渐降低,在此过程中端粒酶各亚基的mRNA水平无可见性变化,而bcl-2的基因表达水平则相应下调.结论:端粒酶活力的下调和喜树碱诱导的HL-60凋亡密切相关,端粒酶活力的阻断并非发生在其亚基基因转录水平,bcl-2对端粒酶活力的调节也不是通过影响端粒酶亚基的转录水平来实现的.     

1，25二羟维生素 D3诱导喉癌细胞 Hep-2细胞凋亡及其对Bax／Bcl-2蛋白表达水平的影响

目的：研究1,25二羟维生素 D3抑制人喉癌 Hep-2细胞增殖作用,诱导细胞凋亡及其凋亡相关机制。方法用不同剂量（10－8、10－7、10－6 mol／L）1,25二羟维生素 D3处理 Hep-2细胞24 h、48 h、72 h,四甲基偶氮唑蓝法（MTT）检测 Hep-2细胞的增殖情况,计算抑制率。流式细胞术检测 Hep-2细胞的凋亡率。Western blot 检测用药前后细胞中 Bax 和 Bcl-2蛋白的表达水平。结果1,25二羟维生素 D3可以抑制 Hep-2细胞增殖（P ＜0．05）,最高抑制率可达30．71％,在上述浓度内随着浓度增加、时间延长抑制作用逐渐增强,呈时间－剂量依赖性。10－7、10－6 mol／L 1,25二羟维生素 D3作用48 h 后,Hep-2凋亡细胞比例显著增加,凋亡率高于空白对照组（P ＜0．05）。1,25二羟维生素 D3处理48 h 后,Hep-2细胞 Bax 蛋白表达上升,Bcl-2蛋白表达水平下降。结论在一定浓度范围内1,25二羟维生素 D3能够抑制人喉癌 Hep-2细胞的增殖,呈时间－剂量依赖性,其抑制作用与诱导细胞凋亡有关;1,25二羟维生素 D3可通过上调 Bax 蛋白表达、下调 Bcl-2蛋白表达诱导 Hep-2细胞凋亡。     

“金龙胶囊”抑制HL—60细胞生长并诱导细胞凋亡

目的：研究中药金龙胶囊冻干粉（Jin Long Capsules,简称JLC）对人白血病细胞的作用及其机制。方法：应用台盼兰拒染法观察0．01mg/ml,0.02mg/ml,0.04mg/ml JLC对HL－60细胞的抑制作用，光镜及透射电镜观察细胞结构变化，DNA电泳、流式细胞术等检测细胞凋亡。结果：1、JLC可抑制HL－60细胞的生长，这种作用呈剂量和时间依赖性；2、JLC作用后细胞出现典型的凋亡形态学改变，DNA片段化，流式细胞仪可检出亚G1期细胞；3、JLC作用后细胞阻滞于G0／G1期，S期细胞减少。结论：金龙胶囊冻干粉对白血病细胞有诱导凋亡作用，主要作用于S期。     

通关藤诱导白血病细胞U937,HL60细胞凋亡的实验研究

目的探讨通关藤抑制白血病细胞增殖作用及其机制。方法以不同浓度的通关藤提取物制剂处理白血病细胞U937、HL60,1~5 d,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测对细胞增殖的影响,以Annexin V/PI双染法检测细胞的凋亡程度,Western blot检测凋亡相关蛋白caspase3,PARP改变,以JC-1染色法检测线粒体跨膜电位(ΔΨm)水平。结果通关藤提取物制剂呈时间和剂量依赖性抑制U937、HL60细胞增殖,50μL/mL时能明显降低线粒体跨膜电位(ΔΨm),活化caspase 3,剪切PARP,诱导细胞凋亡。结论通关藤提取物制剂对U937、HL60白血病细胞有显著的抑制和诱导凋亡作用,能通过降低线粒体跨膜电位途径触发白血病细胞凋亡。     

小剂量阿糖胞苷体外诱导HL-60细胞定向分化的实验研究

目的 利用HL－60细胞定向分化的特征，探讨小剂量阿糖胞苷（Ara-C)诱导HL－60细胞的分化方向及可能的作用机制。方法 （1）分别于Ara-C 10mg/ml处理后0，2，4，6，8天收集HL－60细胞，采用流式细胞术（FCM）检测CD13、CD14、CD15、CD11b的表达，并进行细胞周期分析；（2）半定量逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测不同时段bcl-2的表达；（3）细胞涂片瑞氏染色，光镜下观察细胞形态变化。结果 （1）随药物作用时间的延长，S期细胞逐渐减少，而G0／G1期细胞逐渐增加，HL－60细胞增殖受抑；（2）药物作用一定时间后，HL－60细胞部分向单核细胞、部分向粒细胞分化；（3）抗凋亡因子bcl-2在mRNA水平的表达呈时间依赖性下降；（4）药物作用下，HL－60细胞形态学渐出现分化或凋亡的特征。结论 HL－60细胞经小剂量Ara-C诱导作用后，既有向单核，也有向粒细胞分化；小剂量Ara-C随作用时间的延长，其细胞凋亡作用甚或细胞毒作用可能更为明显，不失为临床急性非淋巴细胞性白血病（ANLL）安全而可靠的治疗手段之一。     

人白血病HL60细胞的分化状态对细胞凋亡的影响

用细胞培养和流式细胞术等方法,研究人白血病HL60细胞诱导分化后,对三尖杉酯碱(Har)和喜树碱(Cam)诱导细胞凋亡的影响。结果表明,12-豆蔻酰及13-乙酸佛波酯以16nmol·L^-1浓度处理HL60细胞24h,细胞向单核/巨噬细胞方向分化,阻断于G_{1期;分化细胞抗Har和Cam诱导的细胞凋亡,但其c-myc基因的表达无变化。1.4%二甲基亚砜处理HL60细胞48h,细胞向粒细胞方向分化,阻断于G1期;分化细胞抗Cam,而不抗Har诱导的细胞凋亡;分化细胞的c-myc基因表达明显下降。结果提示,人白血病HL60细胞的分化状态,明显影响三尖杉酯碱和喜树碱诱导的细胞凋亡,但可能与c-myc基因的表达变化无关。}     

人的核糖体蛋白S3a基因克隆、表达、纯化与亚细胞定位

目的克隆人核糖体蛋白S3a（Ribosomal protein S3a,RPS3a）基因,并表达、纯化其蛋白,分析RPS3a蛋白的细胞定位,为其功能研究奠定基础。方法应用RT-PCR从人胚肾HEK293细胞的总RNA中反转录并扩增出RPS3a基因,克隆到原核表达载体PET-21a中,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）进行蛋白表达。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下,PET21a-RPS3a融合表达载体在大肠杆菌菌株BL21（DE3）中以可溶性蛋白的形式高效表达RPS3a蛋白,超声破碎细胞,通过Ni~（2＋）-NTA亲和层析柱初步纯化,再应用50kD超滤膜进一步纯化。用Western Blot印迹实验检测纯化后的蛋白。构建绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）的pEGFP-N1-RPS3a表达载体,转染HEK293细胞,通过荧光显微镜观察RPS3a重组荧光蛋白在细胞内的分布。结果获得了较高纯度的RPS3a蛋白,亚细胞定位分析表明RPS3a蛋白主要分布于细胞质。结论成功克隆了RPS3a基因并表达纯化了其蛋白,确定其亚细胞分布,为进一步研究RPS3a蛋白的性质和功能奠定了基础     

Involvement of hydrogen peroxide and hydroxyl radical in chemically induced apoptosis of HL-60 cells.

Effects of three kinds of antagonists against reactive oxygen species were evaluated at the same time in chemically induced apoptosis of human leukemic HL-60 cells. Apoptosis of HL-60 cells induced by actinomycin D, H7, 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine, and daunorubicin was inhibited significantly by radical scavengers (vitamin E, N-acetyl-L-cysteine, and mercaptoethanol), catalase, and a spin trap, N-t-butyl-alpha-phenylnitrone. These results suggest that hydrogen peroxide and hydroxyl radical are common mediators of apoptosis caused by these chemicals with apparently different functional mechanisms. The consumption of vitamin E to inhibit apoptosis induced by actinomycin D was undetectable, suggesting that the generation of reactive oxygen species during apoptosis was not very extensive. Radicals were suggested to be a mediator of apoptosis of HL-60 cells induced by cisplatin based on the observations that the above inhibitors, except catalase, effectively inhibited apoptosis by the drug.     

核糖体蛋白RPS3a腺病毒载体的构建和体外表达

目的 构建核糖体蛋白RPS3a的腺病毒表达载体,并进一步验证其在细胞中的表达。方法 应用RT-PCR从人胚肾HEK293细胞的总RNA中反转录并扩增出RPS3a基因,并将RPS3a亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV中,酶切及测序鉴定后,再将含RPS3a基因的重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-RPS3a进行Pme I酶线性化处理,转化到含有骨架质粒的BJ5183感受态菌,进行同源重组。鉴定后,经Pac I线性化转染HEK293细胞,包装重组腺病毒。病毒感染NIH3T3细胞,Western blot 分析RPS3a蛋白的表达。结果 证实pAdTrack-CMV-RPS3a及pAdEas-RPS3a质粒构建正确;Western blot检测病毒感染的NIH3T3细胞总蛋白,与pAd-GFP阴性对照组相比,RPS3a蛋白表达量显著提高。结论 成功构建了能表达RPS3a基因的重组腺病毒载体,为进一步研究其生物学功能奠定基础。     

细胞凋亡过程中核糖体蛋白质S3a水平变化的研究(一)——应用GST基因融合蛋白系统制备核糖体蛋白质S3a(RPS3a)

目的应用GST基因融合蛋白系统制备核糖体蛋白质S3a(RPS3a)。方法将S3acDNA序列插入到pGEX-4T-2质粒中,制备GST/S3a融合蛋白及其抗体。结果S3acDNA序列在XhoI位点上插入到pGEX-4T-2质粒中,形成重组的pGEX-4T-2/S3a质粒。结论pGEX-4T-2质粒编码GST蛋白基因,在IPTG的诱导下可以表达GST/S3a融合蛋白。为下一步实验奠定了基础。     

放线菌素D不能抑制α-双炔失碳酯诱导的白血病K562细胞凋亡

目的：研究放线菌素Ｄ（ＡｃｔＤ）对α－双炔失碳酯（α－ａｎｏｒｄｒｉｎ，ＡＮＯ）诱导的人白血病Ｋ５６２细胞凋亡的影响。方法：用光学显微镜观察细胞形态学变化；用流式细胞仪、琼脂糖凝胶电泳分别检测ＤＮＡ含量和ＤＮＡ断裂。结果：ＡＮＯ５０μｍｏｌ·Ｌ－１处理人白血病Ｋ５６２细胞２４ｈ引起大约１０％Ｋ５６２细胞产生凋亡。同时加入ＲＮＡ合成抑制剂ＡｃｔＤ０．００５μｍｏｌ·Ｌ－１不能抑制ＡＮＯ诱导的凋亡，相反地，ＡｃｔＤ加强ＡＮＯ的这一作用，使凋亡细胞从１０％上升到２０％。ＡｃｔＤ０．５μｍｏｌ·Ｌ－１本身可诱导约３２％的Ｋ５６２细胞凋亡。Ｓ期细胞对ＡＮＯ诱导的凋亡较敏感，而ＡｃｔＤ则较易诱导Ｓ期和Ｇ２－Ｍ期细胞凋亡。结论：ＡＮＯ诱导的Ｋ５６２细胞凋亡不依赖于新的ＲＮＡ合成。     

细胞凋亡过程中核糖体蛋白质S3a水平变化的研究（二）——制备和纯化抗GST／S3a多克隆抗体

目的：制备和纯化抗GST／S3a多克隆抗体。方法：盐析法粗提抗体,用蛋白A－琼脂糖柱纯化IgG,ELISA法检测多克隆抗体水平。结果：ELISA法测定制备和纯化抗GST／S3a多克隆抗体的活性正常,产生了抗原－抗体反应复合物。结论：制备和纯化的抗体血清可以与GST／S3a融合蛋白相结合,产生抗原－抗体反应复合物,说明具有抗GST／S3a融合蛋白的性,为下一步实验奠定基础。     

Induction of apoptosis in two human leukemia cell lines as well as differentiation in human promyelocytic cells by cyanidin-3-O-beta-glucopyranoside

Little is known about the potentially chemopreventive mechanisms of anthocyanins apart from their antioxidant activity. We investigated the in vitro capacity of the anthocyanin cyanidin-3-O-beta-glucopyranoside (Cy-g) to induce apoptosis in T-lymphoblastoid, as well as apoptosis and differentiation in HL-60 promyelocytic cells. Although Cy-g-induced apoptosis (as well as necrosis) in the two systems, HL-60 cells were much less sensitive than T-lymphoblastoid cells. Moreover, treatment of HL-60 cells with Cy-g caused differentiation into macrophage-like cells and granulocytes. Concerning the mechanism of action, the induction of apoptosis in Jurkat T cells can be explained by a modulation of p53 and bax protein expression. At the molecular level, the induction of apoptosis and cytodifferentiation in HL-60 cells involved different proteins, thus suggesting that the effects of Cy-g on apoptosis and cytodifferentiation induction are two distinct events. These interesting biological properties should encourage further investigation into the chemopreventive and/or chemotherapeutic potential of Cy-g.     

放线菌素D抑制沙尔威辛诱导K562细胞凋亡但不减弱其细胞毒性

目的：研究放线菌素D对沙尔威辛诱导K562细胞凋亡和细胞毒性的影响．方法：采用四氮唑盐(MTT)还原法测定药物对K562细胞的生长抑制作用;凋亡诱导作用采用荧光显微镜术、DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术进行评价．结果：药物处理K562细胞24h后检测发现,放线菌素D能在一定程度上增强沙尔威辛6．25μmol/L的细胞毒性作用,平均生长抑制率由沙尔威辛单独应用时8％上升到联合应用放线菌素D0．04、0．4和4 μmol/L时的69％、71％和70％．在沙尔威辛浓度大于6．25μmol/L时,未见同样的增强作用,却也不减弱其抑制细胞生长的作用．这显示放线菌素D可以增强或至少不减弱沙尔威辛的细胞毒性作用．但荧光显微镜术、DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术却表明,在同等条件下,放线菌素D抑制沙尔威辛诱导K562细胞凋亡．结论：放线菌素D可增强沙尔威辛适当浓度范围内的细胞毒性作用,但却抑制其诱导的白血病细胞凋亡,提示该过程中存在着除凋亡以外的其它细胞死亡方式。     

Riccardin D, a novel macrocyclic bisbibenzyl, induces apoptosis of human leukemia cells by targeting DNA topoisomerase II

We studied the effect of riccardin D, a macrocyclic bisbibenzyl, which was isolated from the Chinese liverwort plant, on human leukemia cells and the underlying molecular mechanism. Riccardin D had a significant antiproliferative effect on human leukemia cell lines HL-60, K562 and its multidrug resistant (MDR) counterpart K562/A02 cells, but showed no effect on the topoisomerase-II-deficient HL-60/MX2 cells, as measured by the 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. The pBR322 DNA relaxation assay revealed that riccardin D selectively inhibited the activity of topoisomerase II (topo II). The suppression of topo II activity by riccardin D was stronger than that of etoposide, a known topo II inhibitor. After treatment with riccardin D, nuclear extracts of leukemia K562 and K562/A02 cells left the majority of pBR322 DNA in a supercoiled form. Further examination showed that riccardin D effectively induced HL-60, K562 and K562/A02 apoptosis as evidenced by externalization of phosphatidylserine and formation of DNA ladder fragments. The activation of cytochrome c, caspase-9, caspase-3 and cleaved poly ADP-ribose polymerase (PARP) was also enhanced, as estimated by Western blot analysis. By contrast, riccardin D was unable to induce apoptosis in the topoisomerase-II-deficient HL-60/MX2 cells, indicating that the induction of apoptosis by riccardin D was due to the inhibition of topo II activity. In addition, riccardin D was able to significantly decrease P-glycoprotein (P-gp) expression in K562/A02 cells. Taken together, our data demonstrate that riccardin D is a novel DNA topo II inhibitor which can induce apoptosis of human leukemia cells and that it has therapeutic potential for both regular and MDR strains of leukemia cells.     

Toxoplasma gondii inhibits the in vitro induced apoptosis of HL-60 cells

The integrity of the host cell may represent an important prerequisite for the intracellular survival and development of obligate intracellular pathogens. In the present study, we investigated the influence of infections with the protozoan parasite Toxoplasma gondii on the rate of apoptosis in the human leukemia cell line HL-60. After infection with T. gondii tachyzoites of the strain NTE and in uninfected controls, less than 2% of the host cells showed typical signs of apoptosis, i.e. condensation of chromatin after staining with Hoechst 33258 or internucleosomal DNA fragmentation after agarose gel electrophoresis of genomic DNA. After treatment with 0.1 to 0.5 microg/ml actinomycin D for up to 16 hours, HL-60 cells considerably underwent apoptosis. However, this actinomycin D-induced apoptosis was clearly reduced after concomitant infection with T. gondii as shown by staining with Hoechst 33258 and by DNA fragmentation assay. Inhibition of apoptosis by the intracellular pathogen T. gondii might be recognized as an evasion mechanism that enables intracellular survival and establishes long-lasting persistence.