鹿源牛病毒性腹泻病毒敏感中药筛选的研究

为筛选鹿源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)敏感中药,试验采用组织细胞培养方法测试了4种中药在牛肾细胞(MDBK)体外培养中的最大安全浓度和对鹿源BVDV敏感性.结果表明:4种中药对MDBK细胞无损伤的最大安全浓度分别是黄芪25、鱼腥草28、莪术油27、双黄连27;4种中药抗梅花鹿源BVDV作用由强到弱的顺序为莪术油、鱼腥草...     

牛病毒性腹泻/黏膜病毒敏感MDBK细胞克隆与鉴定

研究采用有限稀释法将MDBK细胞进行克隆,并放大培养。将2种生物型(致细胞病变型和非致细胞病变型)的牛病毒性腹泻/黏膜病毒混匀,接种克隆的MDBK细胞并收获毒液。采用间接免疫荧光技术检测病毒含量,筛选BVDV敏感细胞。试验成功获得4株单克隆细胞,其中C3株对病毒高度敏感且产毒稳定,确定为BVDV敏感细胞株。     

青蒿素与牛病毒性腹泻病毒NS5B蛋白的分子对接预测及其抗病毒作用

【目的】 采用分子对接以及体外试验确定青蒿素对牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）复制的抑制作用,为抗病毒药物和制剂开发提供新思路。【方法】 以BVDV-NS5B蛋白为作用靶点,通过PDB数据库检索蛋白三维晶体结构,并对其结构进行适当修饰处理;检索TCMSP数据库中的青蒿素结构,应用Autodock软件将两者进行分子对接及结合能打分。随后采用CCK-8试剂盒测定青蒿素对MDBK细胞的最大安全浓度;将选定浓度的青蒿素进行梯度稀释,采用先加病毒后加药物、先加药物后加病毒、中药和病毒同时作用的3种不同加药方式进行药物抗病毒试验,确定对病毒的最佳药物抑制浓度、预防浓度和杀灭浓度。应用实时荧光定量PCR法检测3种药物作用方式下BVDV的拷贝数,进一步明确药物对BVDV复制的作用。【结果】 分子对接数据表明青蒿素与BVDV-NS5B存在相互作用,结合自由能为-28.6748 kJ/mol。青蒿素在MDBK细胞上的最佳药物安全浓度为100 μmol/L。3种作用方式下青蒿素浓度为100 μmol/L时均可有效影响BVDV的复制,青蒿素对BVDV的抑制作用最为明显。【结论】 青蒿素可与BVDV-NS5B蛋白靶点互作,并能在MDBK细胞上有效抑制BVDV的复制,本研究为抗BVDV中药筛选奠定了基础。     

中药金银花体外抗牛病毒性腹泻病毒的作用研究

为了研究中药金银花是否具有抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)活性的作用,试验首先测定了金银花对牛肾细胞(MDBK细胞)的最佳用药浓度,用该浓度的金银花对在细胞内和细胞外两种状态的BVDV进行试验。细胞外试验中,把BVDV与金银花在体外混合,作用0,6,12 h后接种MDBK细胞,以研究金银花在细胞外抗BVDV活性作用。细胞内试验中,将BVDV先接种至MDBK细胞,然后用含金银花的细胞维持液培养1 h,最后用细胞维持液继续培养24,36,48 h,以观察金银花对BVDV复制的影响。采用免疫荧光试验、病毒半数组织细胞感染量(TCID_(50))测定及荧光定量PCR方法,检测金银花对BVDV活性和复制的影响。结果表明:当金银花浓度为2.5×10~(-2) g/mL时,对细胞的毒性最小。因此,用该浓度的金银花对BVDV在细胞内和细胞外两种状态进行试验。细胞外试验组免疫荧光试验结果显示,金银花与BVDV作用0 h,培养72 h后,仍有特异性荧光;而金银花与BVDV作用6 h和12 h,培养72 h后则无特异性荧光出现,表明在细胞外金银花对BVDV活性起到了良好的抑制作用。随着金银花与BVDV在体外作用时间的增加,病毒对照组TCID_(50)极显著高于试验组(P0.01)。BVDV与金银花作用0,6,12 h后感染细胞,试验组与病毒对照组样品中BVDV mRNA相对含量均差异极显著(P0.01)。细胞内试验组免疫荧光试验结果显示,金银花作用24 h样品仍有少量特异性荧光,而作用36 h和48 h样品则无特异性荧光。随着金银花与BVDV作用时间的增加,病毒对照组TCID_(50)逐渐增大;而试验组TCID_(50)基本不变,与病毒对照组差异极显著(P0.01)。细胞内的BVDV与金银花作用36,48 h后,试验组与病毒对照组样品中BVDV mRNA相对含量差异极显著(P0.01)。说明金银花可对细胞内外的BVDV活性起到良好的抑制作用,可以抑制BVDV的活性。     

金刚烷胺抑制牛病毒性腹泻病毒复制的研究

为了在细胞水平测试金刚烷胺对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的抑制作用,试验采用细胞培养技术和CCK8法测定不同浓度金刚烷胺对牛肾原代(MDBK)细胞的毒性作用,确定药物的安全浓度。将感染BVDV的MDBK细胞用金刚烷胺处理,通过荧光定量PCR方法检测金刚烷胺对BVDV的抑制作用。结果表明:金刚烷胺的浓度为500μmol/L时,对MDBK细胞有很强的毒性;当浓度低于125μmol/L时,基本对细胞无明显毒性作用。BVDV的半数致细胞病变量(TCID_(50))为1×10~(-2.5)/mL。在浓度为250,166,125,100μmol/L的金刚烷胺的作用下,病毒的相对表达量分别为4.17%、4.19%、7.51%、21.69%。说明金刚烷胺在合理浓度下对动物体细胞无显著毒性,且具有抑制BVDV复制的作用。     

不同细胞进行牛血清中牛病毒检测的比较试验

选出最适合牛血清中外源病毒增殖的细胞,用于牛血清中病毒检测,可以提高血清中病毒的检出率,以确保用于疫苗生产的牛血清是安全可靠的。将牛腹泻病毒、牛腺病毒、牛细小病毒、牛副流感病毒、呼肠孤病毒和狂犬病毒接种到培养好的MDBK细胞、VERO细胞、BT细胞中,逐日观察细胞的病变情况,待观察到10%细胞出现病变或者培养7天后,进行免疫荧光染色,选择出适合用于此六种病毒增殖的细胞系。结果显示BT细胞对所有病毒敏感,vero细胞对BAV、BVDV病毒不敏感,MDBK对REO、BVDV、RV三种病毒不敏感。综合比较后,选择BT细胞为BPIV、BPV、BAV、BVDV的增殖及实验用细胞,vero细胞为REO、RV的增殖及实验用细胞,为了提高血清中病毒的检出率,可以选用多种细胞进行同时实验。     

藏羊源牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及生物学特性分析

为了确定临床病例的致病原,并掌握该致病原的生物学特性,试验采用PCR检测、病毒分离培养与细胞病变观察、PCR分型鉴定、间接免疫荧光试验、中和试验、生物学特性检测等方法对临床病料样品进行研究。结果表明:病料样品经牛病毒性腹泻病毒(BVDV)特异性引物检测为阳性,病料样品可引起MDBK细胞出现典型的圆缩、拉网等细胞病变现象,PCR分型鉴定中分离毒株经BVDV-1特异性引物检测为阳性,间接免疫荧光试验中分离毒株可引起MDBK细胞出现特异性荧光,中和试验中分离毒株可被BVDV阳性血清特异性中和,分离毒株的TCID_(50)为1×10~(-5.61)/0.1 mL,对5-氟脱氧尿核苷不敏感,对乙醚、氯仿、胰蛋白酶等敏感,对酸性敏感,对碱性不敏感,54℃1 h可灭活。说明临床病例的致病原为藏羊源BVDV毒株。     

不同生物型BVDV感染对MDBK细胞类泛素基因转录水平的影响

探讨牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染对牛胚肾细胞(MDBK)类泛素基因转录水平的影响。对致细胞病变型(cp型)BVDV标准株NADL毒株及非致细胞病变型(ncp型)BVDV分离株shz 132毒株进行增殖,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)反应测定2种病毒拷贝数,按照Reed-Muench法测定BVDV NADL病毒TCID50值。以100TCID50BVDV NADL病毒和同等拷贝数的BVDV shz 132病毒分别感染MDBK细胞不同时间(4、12、24、48h)后收集细胞,提取细胞总RNA,反转录得到cDNA。以cDNA为模板,采用特异性引物,通过RT-qPCR反应检测细胞类泛素基因SUMO1、SUMO2、SUMO3、Ubc9的转录水平。结果显示,致细胞病变型BVDV NADL感染MDBK细胞48h,引起细胞显著的病变,而非致细胞病变型BVDV shz 132感染不引起细胞病变。BVDV NADL和shz 132的病毒拷贝数分别是1.13×1011 copies/mL和1.77×1011 copies/mL,BVDV NADL的TCID50是10-4.9 TCID50/0.1mL。RT-qPCR分析显示,与对照组相比,2种BVDV病毒感染都能引起MDBK细胞SUMO1、SUMO2、SUMO3、Ubc9基因的相对表达量变化。在BVDV shz 132感染的细胞中,SUMO1、SUMO2、SUMO3的相对表达量在各个感染时间都高于或接近于BVDV NADL感染的细胞,且在感染后24h,以上3个基因的相对表达量下调,差异极显著(P0.01);而Ubc9基因的相对表达量则低于或接近于BVDV NADL感染的细胞,且在感染后24h,其相对表达量上调,差异极显著(P0.01)。结果表明,BVDV感染调控了MDBK细胞SUMO系统,提示细胞SUMO系统参与了BVDV在胞内的活动,且这种调控作用与病毒的生物型存在密切联系。     

HEBP1基因敲除对牛病毒性腹泻病毒在MDBK细胞中增殖的影响

为研究血红素结合蛋白1(HEBP1)对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)复制的影响,应用CRISPR/Cas9技术建立HEBP1基因敲除的MDBK细胞系;用BVDV TC株感染HEBP1基因敲除的MDBK细胞,用免疫荧光染色检测BVDV双链RNA(dsRNA)水平,观察BVDV致细胞病变效应(CPE)情况,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测BVDV 5′UTR mRNA水平,Reed-Muench测定病毒滴度变化。结果表明,成功构建HEBP1基因敲除的MDBK稳定细胞系,敲除效率为72.41%;敲除HEBP1基因显著性抑制BVDV 5′UTR mRNA和dsRNA积累,减弱BVDV感染靶细胞的CPE,降低BVDV滴度。说明敲除HEBP1基因显著性抑制BVDV的复制,为抗BVDV研究提供新的思路和药物靶点。     

小分子药物索非布韦对牛病毒性腹泻病毒体外复制的影响

试验旨在研究小分子药物索非布韦是否具有抑制牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）复制的作用。通过MTT法测定了不同时间和不同浓度索非布韦对牛肾细胞（MDBK）增殖的影响;采用免疫荧光染色试验筛选出能有效抑制BVDV复制的索非布韦最适浓度,用实时荧光定量PCR、致细胞病变作用（CPE）和病毒半数组织细胞感染量（TCID₅₀）测定的方法检测索非布韦对BVDV复制的影响。结果显示,索非布韦处理MDBK细胞24和48 h能极显著抑制细胞增殖（P<0.01）;与对照组相比,当索非布韦浓度为800 μmol/L时免疫荧光染色检测BVDV感染MDBK细胞的双链RNA（dsRNA）含量极显著降低（P<0.01）;实时荧光定量PCR检测发现,与DMSO处理组相比,BVDV感染索非布韦处理组MDBK细胞,BVDV 5'UTR mRNA含量在病毒感染24和48 h时极显著降低（P<0.01）;BVDV感染索非布韦处理组MDBK细胞病变现象明显减弱;索非布韦处理24 h后能极显著减弱BVDV感染MDBK细胞后子代病毒颗粒的形成组与释放（P<0.01）,降低病毒滴度。综合上述结果表明,小分子药物索非布韦能有效抑制BVDV体外复制。     

牛病毒性腹泻病毒XC株的分离与鉴定

将BVDV阳性血清样品接种MDBK细胞,结果分离出1株BVDV。采用MDBK细胞培养法、直接免疫荧光、RT-PCR与TCID_(50)等方法对分离毒株进行鉴定分析。结果表明,分离株在MDBK细胞上盲传至10代均未出现细胞病变;在直接免疫荧光试验中呈阳性;RT-PCR扩增均获得5'-UTR、Npro预期大小DNA片段;分离株滴度为10~(-5.9)TCID_(50)/0.2 mL。进化分析显示,该分离株属于BVDV-1m。以上结果推断,成功分离鉴定1株BVDV,该分离株为非致细胞病变型BVDV-1m,命名为BVDV-1 XC株,为研究致病机理奠定基础。     

10种中药提取物体外抗传染性支气管炎病毒效果的研究

采用体外细胞培养法,研究板蓝根、大青叶、黄连、菊花、淫羊藿、人参、茯苓、黄芪、山药和当归10种中药提取物在鸡胚成纤维细胞体外培养中的最大安全浓度,借助光学倒置显微镜,肉眼观察提取物对细胞形态的影响。在安全浓度范围内分别考察各味中药对传染性支气管炎病毒标准株M41型(IBV-M41)的防治效果,确定4种抗病毒力最强的4种中药进行后续的试验。结果表明,板蓝根、大青叶、黄连和淫羊藿对IBV-M41的抗病毒效果最好。     

牛病毒性腹泻病毒LN-1株的分离鉴定及基因组序列分析

【目的】查明并掌握辽宁地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)的流行特性及生物学特点,为BVDV的防治提供理论基础和技术支持。【方法】采集辽宁省某养牛场疑似发生BVDV感染的病死牛脾脏组织,用牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus, BRSV)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)及BVDV基因特异性引物进行RT-PCR鉴定,将组织液接种MDBK细胞分离病毒。对细胞进行细胞病变效应(CPE)观察后再通过电镜观察、间接免疫荧光试验(IFA)鉴定病毒,PCR扩增病毒全基因组序列并对其进行遗传进化分析。【结果】BVDV特异性引物RT-PCR鉴定结果为阳性,在280 bp处有条带,与预期条带大小相符,其余病原特异性引物未扩增出条带,证明未感染其他病原;分离得到的毒株在MDBK细胞中培养未出现明显细胞病变效应;病毒纯化后,...     

吉林某牛场牛病毒性腹泻流行病学调查及分析

为全面了解吉林省某规模化牛场牛病毒性腹泻(BVD)的流行情况,试验采集临床血清样品157份,粪便样品18份,肝脏、精液等组织样品17份,应用BVDV抗体检测试剂盒进行血清抗体检测,利用BVDV1型引物,采用纳米PCR方法对血清及临床样品进行BVDV抗原检测,对抗原阳性样品进行测序分析;将抗原阳性样品经研磨、稀释后用0.22μm滤膜过滤除菌,接入牛肾细胞(MDBK)进行病毒分离培养,盲传3代后再次进行抗原检测;采用免疫荧光技术检测病毒对MDBK细胞的侵染作用;利用Mega软件绘制系统进化树并进行同源性比对分析。结果显示,该牛场临床血清BVDV抗体阳性率为77.1%,血清抗原阳性率为12.1%,临床粪便等样品抗原阳性率为74.3%;病料接入细胞未观察到细胞病变,分离毒株PCR产物测序分析结果与样品抗原检测结果一致;免疫荧光检测结果显示,分离株毒液正常吸附于MDBK细胞中,有明显荧光反应;抗原测序分析显示,该牛场BVD主要流行毒株与BVDV JL-1株同源性高达99.0%,且均为BVDV 1型毒株。本研究对该牛场BVDV流行情况进行了全面调查,为开展净化工作奠定了基础。     

用荧光染色法检测BVDV最佳条件的探索

本实验对荧光染色法检测BVDV的最佳条件进行了摸索,包括MDBK细胞培养的密度、BVDV一抗和二抗浓度等因素对荧光染色效果的影响,获得BVDV染色一抗稀释度在1:150~1:200,二抗稀释度在1:200为最佳稀释比例,MDBK的细胞密度在104个/ml时制备的荧光染色片最优,可获得最佳观察效果,有利于判定实验结果.     

吉林某牛场牛病毒性腹泻流行病学调查及分析

为全面了解吉林省某规模化牛场牛病毒性腹泻(BVD)的流行情况,试验采集临床血清样品157份,粪便样品18份,肝脏、精液等组织样品17份,应用BVDV抗体检测试剂盒进行血清抗体检测,利用BVDV1型引物,采用纳米PCR方法对血清及临床样品进行BVDV抗原检测,对抗原阳性样品进行测序分析;将抗原阳性样品经研磨、稀释后用0.22μm滤膜过滤除菌,接入牛肾细胞(MDBK)进行病毒分离培养,盲传3代后再次进行抗原检测;采用免疫荧光技术检测病毒对MDBK细胞的侵染作用;利用Mega软件绘制系统进化树并进行同源性比对分析。结果显示,该牛场临床血清BVDV抗体阳性率为77.1%,血清抗原阳性率为12.1%,临床粪便等样品抗原阳性率为74.3%;病料接入细胞未观察到细胞病变,分离毒株PCR产物测序分析结果与样品抗原检测结果一致;免疫荧光检测结果显示,分离株毒液正常吸附于MDBK细胞中,有明显荧光反应;抗原测序分析显示,该牛场BVD主要流行毒株与BVDV JL-1株同源性高达99.0%,且均为BVDV 1型毒株。本研究对该牛场BVDV流行情况进行了全面调查,为开展净化工作奠定了基础。     

莪术油注射液体外抗猪细小病毒的试验

制备莪术油注射液,评价莪术油注射液体外对猪细小病毒(PPV)7909标准毒株的作用效果。在PK-15细胞上,通过不同加药方式观察PK-15细胞病变(CPE),用MTT法测定细胞活力。结果在PK-15细胞上,药物最大安全浓度(TD0)为86.4μg/mL,半数感染浓度(TD50)为162.2μg/mL;在药物安全浓度范围内,莪术油注射液对PPV 7909标准毒株的半数抑制浓度(IC50)为1.865μg/mL,半数阻断浓度(IC50)为3.75μg/mL,半数直接杀灭作用浓度(IC50)为81.2μg/mL。结果表明莪术油对PPV 7909标准毒株有明显的体外抑制作用,但直接杀灭作用不明显。     

梅花鹿α干扰素基因在MDBK细胞中表达及抗BVDV活性检测

采用基因工程技术克隆出梅花鹿α干扰素(IFN-α)成熟肽基因序列,并将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.0(+),经酶切、PCR及测序鉴定,成功构建了pcDNA3.0-IFN-α真核重组表达质粒。将鉴定正确的阳性重组质粒经非脂质体法转染至MDBK细胞,间接免疫荧光试验检测其具有较高转染效率;Western blot法检测IFN-α蛋白在MDBK细胞中得到有效表达;病变抑制试验检测转染后的MDBK细胞具有明显抗BVDV活性;抗BVDV活性的定量试验表明转染pcDNA3.0-IFN-α质粒的MDBK细胞与感染未转染的MDBK细胞相比抗BVDV活力提高了66192倍。本试验在MDBK细胞中成功表达了梅花鹿IFN-α,并检测出其具有明显抗BVDV作用,这为梅花鹿IFN-α活性机理研究以及开发更高效的抗梅花鹿病毒性疾病干扰素制剂提供物质和理论基础。     

鹿源牛病毒性腹泻病毒JZ05-4株的分型鉴定

为研究牛病毒性腹泻病毒(BVDV) JZ05-4毒株生物型、基因型及遗传背景,本研究将其在MDBK细胞上进行传代培养并观察细胞培养特性,利用荧光抗体染色和RT-PCR的方法对其进行基因型鉴定研究.试验结果证明,BVDV/JZ05-4毒株为CPE生物型、BVDV-2基因型.     

中药体外对Marc-145细胞的影响及抗PRRSV突变株的作用

将板蓝根、甘草和鱼腥草3种单味中药各含量为100mg/mL的中药粗提物作连续倍比稀释后,采用CPE和MTT法将其在Marc-145细胞上进行最大安全质量浓度和对细胞增殖的影响试验,同时采用体外细胞培养的方法在Marc-145细胞上进行抗猪繁殖与呼吸综合征病毒突变株(PRRSV PX株)作用试验。结果显示,3种中药粗提物最大安全作用质量浓度板蓝根和甘草均为3.125g/L、鱼腥草为1.563g/L;板蓝根、甘草、鱼腥草分别在3.125～0.049、3.125～0.195、1.563～0.391g/L时测得细胞D值大于细胞对照组,对细胞分裂增殖均有促进效果,最佳作用质量浓度均为1.563g/L;3种中药粗提物有不同程度的抗PRRSV PX株作用,板蓝根和甘草粗提物阻断、抑制PRRSV PX株感染及直接灭活PRRSV PX株效果最好的质量浓度;阻断为3.125、3.125g/L、抑制为1.563、0.391g/L:阻断、直接灭活为0.782、0.782g/L,鱼腥草粗提物在0.782g/L时阻断和抑制PRRSV PX株效果为好,但其对PRRSV PX株基本没有直接灭活作用。