人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建及筛选

目的　构建人丙型肝炎病毒 (HCV)特异性噬菌体抗体库 ,制备人源抗HCV单克隆抗体 (mAb)。方法　用常规RT PCR法 ,直接从 5例丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中 ,扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因 ,与噬菌体载体pComb3连接 ,构建噬菌体抗体Fab库。对抗体库进行 5轮吸附 -洗脱 -扩增的亲和选择后 ,以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体。结果　RT PCR可有效地扩增出Fd和κ基因 ,并以此构建成容量为 1 2× 10 7的噬菌体抗体库。经 5轮亲和选择可使特异性噬菌体抗体得到高度富集 ,抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达 96 %。结论　抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCVmAb的制备 ,为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具     

人源性噬菌体抗体库的构建和抗CEA抗体的筛选及表达

目的构建人源性噬菌体抗体库,筛选和表达人源性抗癌胚抗原(CEA)单克隆抗体。方法从结肠癌患者肠系膜淋巴结中的淋巴细胞克隆出免疫球蛋白Fd段和κ链基因,建成噬菌体抗体库。用人CEA对抗体库进行筛选,将得到的阳性克隆进行表达及检测。结果抗体库库容为5．2×106,Fab基因重组率为30％。ELISA及Western blot分析检测,证实表达出人源抗CEA单克隆抗体。DNA序列测定,证实所获基因为人免疫球蛋白可变区基因。结论成功构建噬菌体抗体库,从中获得人源性抗CEA的单克隆抗体。     

人源性噬菌体抗体库的构建及抗amylin抗体的初步筛选

目的:构建人源性噬菌体抗体库,从中筛选胰淀素(amylin)单克隆抗体(mAb),测定其特异性及抗原结合活性。方法:从正常健康人的外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增人免疫球蛋白Fd段和轻链基因,构建噬菌体抗体库。酶切和PCR鉴定后,阳性克隆进行DNA测序分析。用人amylin抗原对抗体库进行筛选富集,将得到的阳性克隆进行Phage-ELISA鉴定,结果进行统计学分析。结果:最终构建的抗体库库容约为0.8×108,酶切鉴定显示有插入片段,抗体库重组率为70%。阳性克隆进行DNA测序证实所获基因为人免疫球蛋白可变区基因。以amylin抗原进行3轮筛选,抗体库得到特异性富集。阳性克隆进行Phage-ELISA检测证实有良好的抗胰淀素抗原的特异性。结论:成功构建了一个人源性噬菌体抗体库,为从中获得人源抗amylin的mAb奠定了实验基础。     

肺癌患者噬菌体抗体库的构建及抗肺癌单抗的筛选

目的　探索从人体肿瘤局部引流淋巴结扩增免疫球蛋白基因构建噬菌体抗体库及从中筛选抗肿瘤单抗的可行性。方法　从肺癌患者肺门淋巴结提取总RNA ,经逆转录 聚合酶链反应扩增免疫球蛋白重链Fd段和κ链基因 ,以pcomb3H为载体 ,构建噬菌体抗体库 ,以 2株肺癌细胞对噬菌体抗体库进行 6轮亲和筛选 ,再以人成纤维细胞进行 2轮吸附 ,以筛选出抗肺癌细胞抗体。以细胞ELISA法初步鉴定抗体活性。结果　构建成噬菌体抗体库 ,库容为 7.5× 10 7个克隆 ,κ链和Fd段基因与载体DNA的重组率分别为 10 0 % (10 / 10 )和 90 % (9/ 10 )。通过亲和筛选和吸附从中获得了能与肺癌细胞结合的人单抗。结论　从人体肿瘤局部引流淋巴结扩增免疫球蛋白基因构建噬菌体抗体库并从中筛选抗肿瘤单抗是可行的 ,以肿瘤细胞作抗原从抗体库中筛选抗肿瘤抗体是可取的。     

人源抗人免疫缺陷病毒1型噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建人免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）特异性噬菌体抗体库，制备人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体。方法以半巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）从ＨＩＶ－１感染者外周血单个核淋巴细胞中扩增抗体重链Ｆｄ和轻链（ｋ）基因，与噬菌体载体ｐＣｏｍｂ３连接，构建噬菌体抗体Ｆａｂ组合文库。对抗体库进行３轮吸附－洗脱－扩增的亲和选择后，以ＥＬＩＳＡ法筛选抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体，并进行ＤＮＡ序列分析和Ｆａｂ的可溶性表达。结果半巢式ＰＣＲ有效地扩增出Ｆｄ和ｋ基因，以此构建成容量为１９５×１０７的噬菌体抗体库。３轮亲和选择使特异性抗体得到高度富集，抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体阳性克隆占３２％。对一阳性克隆抗体基因ＣＨ１和ＣＬ部分ＤＮＡ序列进行了测定，并在大肠杆菌表达出可溶性Ｆａｂ。结论抗ＨＩＶ－１特异性噬菌体抗体库的构建和人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体的制备为今后筛选抗ＨＩＶ中和抗体奠定了基础，具有重要的应用价值。     

人源性噬菌体抗体库的构建及HBsAg人单抗的筛选

用聚合酶链伸反应从人外周血淋巴细胞克隆出Ｆｄ段和ｋ链基因，重组到表达载体ｐＣＯＭＢ３中，构建了人源性噬菌体抗体，将乙肝病毒表面抗原固相化对噬菌体抗体库进行了三轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选，使特异性噬菌体抗体得到了富集，筛选到了抗ＨＢｓＡｇ的人单抗。     

人源噬菌体抗体库的构建及抗人NH-LBP抗体的筛选与鉴定

目的: 构建人源噬菌体抗体库并制备抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段 (NH- LBP)的单克隆抗体 (mAb)。方法:以噬菌体展示系统(pComb3H/VCSM13)建立人源噬菌体抗体库(Fab), 并以昆虫细胞sf21在无血清培养基 (SF 900Ⅱ )中,通过BAC- TO- BAC杆状病毒表达系统来表达NH -LBP。再以NH -LBP为抗原, 从人源噬菌体抗体库中筛选可产生抗NH- LBPmAb的菌株并进行鉴定。结果: 昆虫细胞sf21可表达人源NH- LBP, 经亲和纯化柱芯 (TALON)有效纯化后, 获得约8mg的NH- LBP。成功地建立人源噬菌体抗体库, 库容达5. 0×108 CFU。经 8轮筛选后, 抗体库被富集 1. 85×104 倍。经ELISA法鉴定, 获得 3株可产生抗NH -LBPmAb的菌株(核酸序列及氨基酸序列见GenBank中的: AY337713,AY337714 )。结论: 以昆虫细胞sf21表达NH LBP及以其为抗原制备噬菌体mAb是可行的。本研究为进一步建立抗NH- LBP的二硫键稳定的Fv抗体 ( disulfidestabilizedFvfrag ments, dsFv), 研究人体内LBP的变化规律和过度炎症反应的防治奠定了基础。     

从半合成噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白人抗体

目的：从半合成噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白抗体并进行鉴定。方法：以表皮角蛋白为抗原,通过吸附－洗脱－扩增过程从半合成噬菌体抗体库中筛选特异性抗角蛋白抗体,对其抗原结合活性的序列进行分析鉴定。结果;经过４轮筛选,获得２０个能与角蛋白结合的阳性克隆,其中可产生特异性抗角蛋白抗体的克隆１８个。经ＤＮＡ指纹分析,判断所获克隆分别包含４个不同的Ｆａｂ段基因。     

抗SARS-CoV抗原的人源Fab段噬菌体抗体库的构建

目的 :利用抗SARS冠状病毒IgG抗体阳性的SARS康复患者外周血淋巴细胞 ,构建人源Fab段抗体文库。方法 :制备外周血淋巴细胞总RNA ,逆转录成cDNA。以其为模板 ,利用针对家族特异性Ig基因的引物扩增重链Fd段和轻链基因 ,并重组到噬菌粒载体pComb3中 ,将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌XL 1Blue,酶切鉴定抗体库的重组率 ,并测定噬菌体抗体库的库容量。结果 :构建了源于SARS康复患者血清中抗Fab段的抗体文库 ,轻链、重链Fd段基因的重组率分别为91%和 75 % ,库容量为 7.2 3× 10 7。结论 :成功地构建了抗SARS CoV抗原的人源Fab段噬菌体抗体库     

人源化抗HCMV噬菌体ScFv库的构建

目的　构建抗巨细胞病毒噬菌体单链抗体库 ,以探索制备巨细胞病毒感染治疗用单克隆抗体。方法　巨细胞病毒感染患者外周血淋巴细胞为材料 ,建立噬菌体单链抗体库 ,并对其进行鉴定。结果　构建完成了一个滴度为 6 .5×10 6 CFU mL的抗体库。结论　源化抗巨细胞病毒噬菌体单链抗体库的建立为下一步抗体的筛选、表达奠定了基础     

抗肝癌细胞噬菌体单链抗体库的构建及筛选

构建抗人肝癌细胞单链抗体库 ,从中筛选与肝癌细胞特异结合的高亲和力单链抗体。从HepG2细胞免疫的BALB/c小鼠脾脏提取总RNA ,RT PCR扩增小鼠抗体重、轻链可变区基因 ,用 (Gly4Ser) 3 连接肽基因 ,经重叠延伸反应 ,在体外将VH 和VL 连接成单链抗体 (scFv)基因 ,并克隆入噬菌粒载体pCANTAB5E中 ,构建噬菌体单链抗体库。以HepG2细胞为抗原对抗体库进行淘选 ,ELISA法鉴定各单克隆与肝癌细胞的结合活性 ,并对阳性克隆进行表达。成功构建了库容为 1 1× 10 6抗肝癌细胞的噬菌体单链抗体库 ,经筛选得到了与HepG2细胞具有较强结合能力的单链抗体 ,实现了scFv在大肠杆菌中的可溶性表达。序列测定结果表明 ,VH 和VL 基因符合小鼠抗体可变区特征 ,scFv基因拼接正确     

人源性天然抗体库的构建及初步鉴定

目的 构建较大容量的人源性天然抗体库。方法 以未经铭疫的健康人外周血单个核细胞为基因来源，扩增多样性的Ｋ轻链基因和 ＩｇＧ／ＩｇＭ重链Ｆｄ段基因，分别构建铡库和重链库，然后组合为Ｆａｂ段面展示的噬菌体抗体库。通过多次重组积累达到理想的库容，对抗体库进行筛选和鉴定。结果 经过５次轻、重链基因的重组和转化，获得了库容为１×1０～９的人源性天然抗体库。该抗体库性能良好，用３种抗原进行“亲和吸附－洗脱－扩增”淘筛，获得针对其中两种抗原的７株特异性噬菌体抗体。结论天然抗体库为用于不经免疫制备人源性单克隆抗体创造了良好的条件。     

Sj-UV-致弱尾蚴单链抗体库的构建及筛选

目的构建和鉴定日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj）紫外线（UV）-照射致弱尾蚴单链抗体（single chain Fv,ScFv）表达文库,并以此作为高通量的库源筛选出针对有潜在保护力的Sj尾蚴66-68 kDa抗原（Schistosoma japonicum cercariae antigen 66-68kDa,SCA66-68kDa）的单链抗体。方法选择最佳紫外灯照射条件,构建UV-致弱尾蚴小鼠模型,通过其血清被动转移实验证实其是否具有抗血吸虫攻击感染的保护效果;随后提取该小鼠脾脏mRNA,利用噬菌体展示技术构建UV-照射致弱尾蚴单链抗体库,并从库容量、多样性等方面进行鉴定;运用直接菌落挖集法以SjSCA66-68kDa筛选该抗体库,获得阳性克隆进行蛋白表达,再与SCA进行反应,验证其与SjSCA66-68kDa反应的特异性。结果构建UV-致弱尾蚴动物模型中的血清转移至小鼠体内得到42.5%的减虫率,显著高于日本血吸虫感染血清转移组的减虫率（28.0%）;日本血吸虫UV-致弱尾蚴单链抗体库的库容量测定为1.9×108,重组率为100%;运用抗原直接菌落挖集法筛选共获得6个SCA66-68kDa阳性克隆,经SDS-PAGE、Western-blot分析结果显示可溶性ScFv获得了正确表达,且与相应抗原SjSCA66-68kDa特异性结合,证实成功获得了特异性抗SjSCA66-68kDa单链抗体。结论成功构建了高效日本血吸虫UV-致弱尾蚴单链抗体库,从该库筛选共获得6个阳性克隆,均能诱导表达SjSCA66-68kDa特异性可溶性单链抗体。     

抗血管性血友病因子A1区单链抗体噬菌体展示文库的构建和筛选

为构建抗人vWF-A1的全套单链抗体噬菌体表面展示文库,从中筛选与vWF-Al高亲合力的单链抗体,为其临床应用奠定基础。从vWF-A1免疫小鼠的脾淋巴细胞中提取总RNA,纯化mRNA并反转录成cDNA后,用抗体可变区混合引物扩增全套轻、重链可变区基因,经重叠延伸反应,在体外装配成单链抗体(scFv),将其克隆至噬菌体载体pHENl中,构建单链抗体噬菌体抗体库。对抗体库进行亲合筛选后,ELISA法鉴定抗vWF-A1单链抗体。结果经过5轮“吸附-洗脱-扩增”的富集过程,phage-ELISA筛选到与vwF-A1有高亲和力的克隆。序列测定符合抗体可变区结构特点。成功构建了全套抗vWF-A1单链抗体噬菌体展示文库,并筛选出具有结合vWF-A1功能的单链抗体。     

抗转铁蛋白受体抗体的筛选和鉴定

目的:从全人源噬菌体抗体库中筛选抗转铁蛋白受体(TfR)的抗体。方法:从HeLa细胞中提取总RNA,分两段反转录TfR胞外区cDNA,经两轮PCR后,获得胞外区基因。测序正确后,将其插入表达载体pPROEXTMHTa中,并在E.coliBL21(DE3)中表达。目的蛋白通过NiNTA金属螯合层析柱进行纯化、复性。用复性的TfR包被免疫管,从库容为1013cfu/L的全合成人源噬菌体单链抗体库中,筛选抗TfR的抗体。结果:得到约1.9kb的TfR胞外区基因,该基因以包涵体的形式在大肠杆菌中表达;利用纯化、复性的TfR从抗体库中筛选到了8个可与人TfR特异性结合的单链抗体。结论:利用TfR在大肠杆菌表达的复性产物,可以筛选到与天然TfR特异性结合的单链抗体。     

人源性抗HBsAg单抗重链可变区基因序列分析

应用生物工程菌表达法，本文建立了抗ＨＢｓＡｇ单克隆抗体片段组合文库。并筛选阳性株制备了相应的抗体活性片段。人工法对５个阳性株的抗体编码ＤＮＡ重链可变区序列进行了分析，结果表明，５株中有２株ＤＮＡ序列相同，与国外学者所作同类抗体的序列不同，提示是具有抗体活性的不同菌株。同时比较ＤＮＡ、序列发现，氨基酸排列的异同决定抗体的结合活性。ＤＮＡ序列相同的２株其抗体片段的表达能力也相似，表现为酶免疫测定时Ａ值近似。抗体编码基因的序列分析有助于深入探讨抗体的表达能力、亲和力等特性。     

Identification of Peptide Sequences Specific for Serum Antibodies from Human Papillomavirus-Infected Patients Using Phage Display Libraries

Three random phage display peptide libraries were screened with sera from human papillomavirus (HPV)-infected patients to characterize the specificities of antibodies present in patients' sera and to identify molecules that correspond to or mimic natural epitopes; 141 phage clones were randomly selected in three rounds of bioselection and their binding properties were analyzed in ELISA using sera from 36 patients with confirmed HPV 16 infection and 24 healthy control female blood donors. Sixteen of 36 (44%) patients' sera reacted with at least 1 phage clone, and only 2 of 24 female donors' sera showed positive reaction with 1 of the selected clones. We conclude that the combination of various disease-specific epitopes generated by screening of phage display peptide libraries may potentially lead to a multicomponent diagnostic assay for the early detection of HPV infection and precancerous cervical lesions, making possible the prevention of one of the most common cancers in women.     

从噬菌体随机环七肽库筛选可模拟C1qR的C1q结合肽

为获得能结合C1q并模拟C1q受体 (C1qR )配体结合位点的短肽 ,以C1q为钓饵蛋白筛选噬菌体环七肽库 ,采用C1q结合ELISA、U937细胞配体结合抑制试验、多聚IgG (AIgG )竞争抑制试验鉴定阳性克隆 ,再进行单链DNA测序和分析。结果经 3轮筛选后 ,随机挑选 2 3个噬菌体克隆进行ELISA鉴定 ,10个克隆与C1q有较强的结合 ;利用U937细胞配体结合抑制试验 ,得到了 7个阳性克隆 ;从其展示肽DNA测序结果推导氨基酸序列 ,获得 7个短肽序列 :QTPFQLW、NPFNWTS、SPFXLTS、FLTWLDP、FSTFLYP、GPMWWSY和NPFXLIL。