人鼠共打靶 ERβ特异性基因沉默载体的构建和鉴定

目的：：构建人和鼠共打靶特异性 ERβ基因沉默慢病毒载体。方法：检索人和小鼠 ERβ基因转录本及其序列,应用 SiRNA Target Finder 软件设计人和小鼠共打靶 ERβ基因沉默 siRNA 和阴性对照siRNA,合成发夹状双链 shRNA,与线性化质粒 PLL3.7连接构建为重组质粒(ERβ-shRNA-PLL3.7和阴性对照质粒 ER-N-shRNA-PLL3.7),经鉴定后,转染人成骨肉瘤细胞 MG63和小鼠成骨细胞株MC3T3-E1,经 Realtime-PCR 和 western blot 法检测重组质粒对目的基因沉默效果。应用 SPSS16.0软件统计分析,检验水准为α=0.05。结果：经测序证明重组质粒中含有目的 shRNA 序列。分别转染小鼠成骨细胞株 MC3T3-E1和人成骨肉瘤细胞 MG63细胞后,无论 Realtime-PCR 检测 ERβ基因表达,还是western blot 法检测蛋白表达,均较空白对照组或阴性对照组显著降低,差异有显著性,P <0.05。结论：成功构建了人和小鼠共同高效打靶的 ERβ基因沉默慢病毒载体质粒,并包装成假病毒颗粒,为利用小鼠作为动物模型研究人基因功能或开发基因药物奠定了基础。     

RNA干扰介导的MAGE3基因表达沉默对肺癌细胞定植和转移的影响

目的构建针对人MAGE3基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体,观察RNA干扰介导的MAGE3基因表达默寂对肺癌细胞定植和转移的影响.方法设计MAGE3靶向的发夹状siRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSUPERneoGFP载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人肺癌细胞NCI-H446,采用RT-PCR和Western印迹检测MAGE3基因mRNA和蛋白表达水平的变化.用软琼脂克隆形成实验和细胞体外侵袭实验,观察对肿瘤形成能力和侵袭力的影响.结果把针对MAGE3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pSUPERneoGFP载体,经过酶切鉴定与测序,结果正确;RT-PCR和Western印迹检测显示, MAGE3基因的表达水平明显降低;转染siRNA表达载体组的肺癌细胞在软琼脂中形成克隆数和穿透Matrigel的细胞数都显著下降,与未转染和转染空载体组比较差异有显著性（P﹤0.05）.结论成功构建了针对MAGE3基因的siRNA载体, RNA干扰介导的MAGE3基因表达沉寂可有效降低肺癌细胞定植和转移.     

IRAK-4基因沉默对人成骨样细胞凋亡的影响

【目的】研究siRNA沉默白细胞介素-1受体相关激酶-4(IRAK-4)基因对人成骨样细胞株MG63凋亡及凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响。【方法】 以Lipofectamine 2000为载体将IRAK-4-siRNA转染入MG63细胞(CON组:不加入任何转染试剂;SC组:以scrambled siRNA序列进行转染;KD组:以特异性IRAK-4-siRNA序列进行转染),应用流式细胞术及TUNEL法检测细胞凋亡水平,western blotting检测Bcl-2、Bax基因的表达。【结果】 与对照组相比,靶基因沉默组(KD组)细胞的IRAK-4 mRNA及蛋白表达水平显著降低;转染48h后,KD组细胞增殖变缓,凋亡增加,Bcl-2蛋白的表达明显下调且Bcl-2/BaxSC>Bcl-2/BaxKD; Spearman等级相关分析显示MG63细胞凋亡比例与Bcl-2/Bax的比值间有显著的相关性。 【结论】 siRNA沉默IRAK-4基因能够诱导人成骨样细胞株MG63凋亡,且靶细胞凋亡水平与Bcl-2、Bax基因表达水平的比值相关.     

Relationship between the Expression of MTA-1 Gene and the Metastasis and Invasion in Human Osteosarcoma

Summary：To compare the expression level of metastasis associated-1 （MTA 1 ） gene in high and low metastatic： human osteosarcoma cell lines and examine the relationship of MTA 1 expression and the metastasis potentiality of osteosarcoma cells, the expression of MTA 1 in MC-63 osteosarcoma cell lines with high and low metastasis potential was detected by semiquantitative TR-PCR. Boyden chamber invasion assay was used to evaluate the invasive capacity in vitro in two osteosarcoma cell lines, The low metastasis MG-63 cells were transfected with MTA 1 full-length cDNA expression plasmid by lipofectamine and the changes of MTA 1 expression and in vitro invasion potential were examined after the transfection. Our results showed that MG63 cell line with high metastasis potential expressed significantly higher MTA 1 than that of MG63 cells with low metastasis as reavealed by RT-PCR The invasion potential of low metastasis MG63 cell line was increased after MTA 1 gene transfection. It is concluded that there may be a relationship between MTA 1 and invasive potentiality of human osteosarcoma cells, and the mechanism of MTA 1 in osteosarcoma metastasis and its possible role in associated gene therapy deserve further study.     

SiRNA沉默Livin基因促骨肉瘤MG-63细胞凋亡的实验研究

目的:研究特异性小分子干扰RNA(siRNA)沉默骨肉瘤MG-63细胞Livin基因对细胞凋亡的影响?方法:设计针对人源Livin基因的siRNA,转染至对数生长期的人骨肉瘤MG-63细胞株;RT-PCR检测转染后骨肉瘤MG-63细胞Livin基因表达的变化,Western blot检测转染后骨肉瘤MG-63细胞Livin蛋白表达的变化,PI染色后流式细胞仪检测转染后细胞凋亡的变化?结果:Livin特异性siRNA转染骨肉瘤MG-63细胞后,Livin基因表达较空白对照和阴性对照显著减少(0.195 ± 0.019 vs 0.539 ± 0.031?0.438 ± 0.029)?Western blot检测结果显示Livin蛋白质水平较空白对照和阴性对照显著减少(0.165 ± 0.022 vs 0.632 ± 0.034?0.625 ± 0.035)?流式细胞仪检测见siRNA组骨肉瘤MG-63细胞凋亡率较对照组明显增加?结论:RNA干扰能有效沉默骨肉瘤MG-63细胞Livin基因表达,促进骨肉瘤MG-63细胞凋亡?     

乙酰肝素酶基因siRNA表达载体的构建及其沉寂作用

目的:构建针对人乙酰肝素酶(HPSE)基因的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对HPSE基因的干扰作用。方法:设计HPSE靶向的发夹状siRNA,合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pRNATU6.1载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹转染人恶性黑素瘤细胞A375,采用半定量PCR测定HPSE基因RNA水平变化,Western blot检测HPSE蛋白表达的变化。结果:将针对HPSE基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆到pRNATU6.1载体,经过阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确;转染A375细胞后,半定量PCR和Western blot检测显示,HPSE基因和蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。结论:成功构建了针对HPSE基因的siRNA载体,转染细胞后可抑制HPSE的表达。     

RNAi抑制骨肉瘤细胞KDR蛋白表达的研究

目的研究siRNA表达载体对骨肉瘤MG63细胞KDR蛋白表达的抑制作用。方法构建psuper质粒，化学合成2段编码发卡RNA序列、靶向KDR基因的寡核苷酸，克隆进pSuper的pol Ⅲ HI启动子的下游，重组构建抑制KDR表达的siRNA质粒，并转染入骨肉瘤MG63细胞，Western blot检测转染后KDR基因在蛋白水平表达的变化。结果酶切后电泳鉴定正确的重组质粒小量扩增后测序，证实成功构建了KDR siRNA表达质粒，转染入细胞后，有效抑制了KDR基因在蛋白水平的表达。结论成功构建的siRNA表达载体有效抑制了骨肉瘤MG63细胞KDR蛋白的表达，为进一步分析骨肉瘤中KDR基因的功能及肿瘤治疗奠定了研究基础。     

针对MTA1基因siRNA载体构建和沉默效应

目的 构建针对人MTA1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,观察RNA干扰对食管癌细胞MTA1基因表达的抑制作用.方法 设计MTA1的siRNA靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸链,退火后重组入pRNAT-U6.2载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人食管癌细胞EC9706,采用RT-PCR和Western blotting分别检测MTA1基因mRNA和蛋白表达的变化.结果 把针对MTA1基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pRNAT-U6.2载体,经测序分析,插入片段正确;RT-PCR和Western blotting检测显示,MTA1基因的表达水平明显降低,其中以481-499(GACCCT GCTGGCAGATAAA)为靶序列的siRNA沉默作用最强,MTA1蛋白几乎完全不表达.结论 成功构建出沉默食管癌细胞MTA1基因表达的siRNA载体,为通过沉默MTA1基因的表达来减少恶性肿瘤侵袭转移提供了实验基础.     

Impact of silencing MMP9 gene on the biological behaviors of trophoblasts

This study examined the effect of MMP9 gene on the biological behaviors of trophoblasts and explore the relation between MMP9 gene and the "superficial implantation of placenta". In vitro cultured trophoblasts (TEV-1 cells) were transfected with synthesized double-stranded MMP9 RNA (siRNA) by using lipofectamine2000TM technique and the expressions of MMP9 mRNA and protein and the growth and invasiveness of the TEV-1 cells were determined. Our results showed that siRNA transfection could significantly inhibit the expression of MMP9 gene in the TEV-1 cells and the growth and invasiveness of the TEV-1 cells transfected RNA was significantly reduced (P<0.01). We are led to conclude that silencing of MMP9 gene with siRNA can inhibit the growth and invasiveness of trophoblasts and increasing the expression of MMP9 might help prevent and treat preeclampsia.     

体外RNAi对S100A4基因表达及其对骨肉瘤细胞侵袭、转移能力的影响

[目的]应用RNAi技术抑制人骨肉瘤MG-63细胞S100A4基因的表达,并观察对MG-63细胞增殖及体外侵袭能力的影响。[方法]合成针对S100A4的siRNA载体,并根据目的mRNA序列,设计3条RNA干扰靶序列及非特异性的siRNA。将培养细胞分为C组(空白对照组);C1组(转染脂质体组);C2组(转染非特异性的siRNA组);S1、S2、S3组(转染特异性的siRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ组)。荧光倒置显微镜下观察转染情况,Real-time PCR方法检测转染前后S100A4基因表达变化,应用Western-Blot方法检测转染前后S100A4蛋白表达变化。筛选出转染效率最高的特异性siRNA组作为后续实验的实验组。后续实验分为正常细胞组,阴性对照组和实验组,应用MTT法和平板克隆形成实验检测细胞的增殖率变化,应用Transwell小室实验检测细胞的侵袭及转移能力变化。[结果]倒置显微镜下C2组与S1、S2、S3组培养细胞的细胞浆均可见绿色荧光。S1、S2与S3组的S100A4 mRNA表达水平均有不同程度的下调,以S3组最为显著。Western-Blot检测S100A4蛋白表达结果与其相符。MTT法和平板克隆形成实验均显示S3组细胞增殖受到抑制,与正常细胞组、阴性对照组比较差异有显著性意义(P<0.05)。Tran-swell小室实验显示RNA干扰S100A4基因表达后肿瘤细胞的运动侵袭能力明显下降,穿过人工基底膜细胞数量明显减少,与正常细胞组、阴性对照组相比差异有显著性意义(P<0.05)。[结论]体外合成的S100A4特异性siRNA能够抑制骨肉瘤细胞系MG-63的S100A4表达,进而抑制细胞的增殖和体外侵袭能力。     

小干扰RNA抑制胃癌细胞肝素酶表达及侵袭的实验研究

目的 利用RNA干扰（RNAi）技术封闭胃癌细胞系SGC7901肝素酶表达,观察其对肿瘤细胞侵袭能力的影响。方法 体外转录合成小干扰RNA（siRNA）,经脂质体转染胃癌细胞系;结合逆转录（RT）-PCR,Western印迹检测类肝素酶mRNA及蛋白质表达;通过体外侵袭实验评价肝素酶RNAi后胃癌细胞系的侵袭能力变化。结果 肝素酶siRNA分子可以特异性地抑制SGC7901细胞肝素酶mRNA,抑制率达（70±6）％;肝素酶RNAi后SGC7901细胞的侵袭抑制率达（61±36）％。结论 靶向肝素酶基因的siRNA分子能特异性抑制其蛋白表达水平,降低肿瘤细胞的侵袭能力。肝素酶是促进胃癌细胞侵袭转移的关键分子,并可为抑制胃癌侵袭转移提供新策略。     

抑制硬化蛋白基因表达有利于诱导成骨细胞的分化:体外乳腺癌骨转移模型

目的 探讨在体外乳腺癌骨转移模型中抑制硬化蛋白基因的表达后对成骨细胞分化成熟的影响.方法 以干扰硬化蛋白基因表达的siRNA腺病毒感染乳腺癌细胞株MDA-MB-231,RT-PCR检测确认硬化蛋白基因表达的改变.分别以正常培养的MDA-MB-231上清液,感染空病毒的MDA-MB-231上清液,感染SiSOST病毒的MDA-MB-231上清液与MG63或C3H10共培养,并以成骨诱导培养基培养MG63及C3H10为阳性对照,普通培养基培养MG63及C3H10为阴性对照.定量PCR检测成骨细胞分化相关指标的改变,染色检测碱性磷酸酶(ALP)表达的改变.结果 感染Ad-siSOST病毒的MDA-MB-231细胞中硬化蛋白表达明显降低.定量PCR结果显示:与单独培养的MG63相比,加成骨培养基后其骨钙素、骨桥蛋白、护骨因子和整合素结合涎蛋白的表达均上升(P<0.01).在此基础上,与231细胞上清液共培养后其表达降低(P<0.01),差异具有统计学意义;MG63+231-RFP组结果一致,感染SiSOST病毒后,分化指标重新上升(P<0.01),差异具有统计学意义.C3H10细胞实验结果趋势一致.MG63细胞与阴性对照组相比,分化诱导培养基可促进ALP的分泌(P<0.01),但与231细胞共培养后,ALP分泌减少(P<0.01),感染Si-SOST后,可部分扭转ALP分泌的减少(P<0.01),ALP染色得到同样的结果.C3H10细胞结果与MG63细胞趋势一致.结论 在体外乳腺癌骨转移模型中,成骨细胞分化受阻;干扰硬化蛋白基因的表达有利于逆转成骨细胞的分化受阻.     

SiRNA抑制p63基因表达对胆管癌细胞增殖和侵袭的影响

目的构建SiRNA靶向p63载体,稳定导入胆管癌细胞QBC939后,观察细胞增殖和侵袭情况的改变。方法荧光定量PCR检测胆管癌细胞株QBC939细胞中p63表达。构建针对p63的shRNA慢病毒载体,转染胆管癌QBC939细胞中,建立稳定表达shRNA-p63胆管癌细胞株。Western blot检测干扰效率。噻唑蓝(MTT)和软琼脂集落形成实验检测细胞增殖的变化;Boyden小室检测细胞侵袭情况的改变。结果 p63基因显示在QBC939细胞中高表达。序列分析表明,重组到慢病毒载体中的shRNA序列正确。我们利用Western blot筛选了一个干扰p63表达效率为66.8%的单克隆细胞。p63表达降低不但能抑制细胞增殖体外能力,而且还能降低细胞侵袭能力。结论 p63在胆管癌QBC939细胞中高表达。SiRNA靶向抑制p63表达后,能明显降低细胞增殖和侵袭能力。     

VEGF靶向性siRNA表达载体的构建及其沉寂作用

目的：构建针对VEGF的siRNA表达载体,转染入人骨肉瘤细胞系MG-63观察其对细胞VEGF表达的沉默效应.方法：设计VEGF发卡样siRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入T载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染骨肉瘤细胞MG-63,用RT-PCR方法检测细胞VEGF mRNA表达水平.结果：把针对VEGF基因的siRNA的双链寡合苷酸片断克隆到表达载体pSuperneo,经过酶切鉴定与测序,结果正确;稳定转染人骨肉瘤细胞系MG-63后,用RT-PCR方法检测细胞VEGF mRNA表达水平明显降低.结论：成功构建出针对VEGF的siRNA表达载体pSuper-neo-VEGF,转染骨肉瘤细胞后能显著降低细胞VEGF mRNA表达.     

沉默WNT4基因对稳定转染PAX2基因大鼠肾小管上皮细胞迁移和侵袭能力的影响

目的：探讨沉默WNT4基因对稳定转染配对盒基因2（PAX2）大鼠肾小管上皮细胞迁移和侵袭能力的影响,阐明PAX2基因是否通过WNT4基因调控细胞生物学活性。方法：选取对数生长期的PAX2基因稳转细胞系,分为稳转组和对照组。稳转组细胞分为稳转对照组（不应用WNTsiRNA沉默）和沉默72 h组（应用WNTsiRNA沉默72h）。Western blotting法检测稳转组和对照组大鼠肾小管上皮细胞中PAX2和WNT4蛋白的相对表达量,Realtime PCR法检测稳转对照组和沉默72 h组大鼠肾小管上皮细胞中WNT4 mRNA相对表达量,细胞划痕实验检测稳转对照组和沉默72 h组大鼠肾小管上皮细胞的细胞迁移率,Transwell实验检测稳转对照组和沉默72 h组大鼠肾小管上皮细胞的穿膜细胞数。结果：Western blotting法检测,稳转组大鼠肾小管上皮细胞中PAX2和WNT4蛋白相对表达量高于对照组（P<0.05）。Real-time PCR法检测,沉默72 h组大鼠肾小管上皮细胞中WNT4 mRNA相对表达量低于稳转对照组（P<0.05）。细胞划痕实验10 h后,沉默72 h组大鼠肾小管上皮细胞的细胞迁移率低于稳转对照组,但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）;细胞划痕实验18 h后,沉默72h组大鼠肾小管上皮细胞的细胞迁移率低于稳转对照组（P>0.05）。Transwwell实验,沉默72 h组大鼠肾小管上皮细胞的穿膜细胞数低于稳转对照组（P<0.05）。结论：PAX2基因可能通过WNT4基因调控细胞的生物学活性。     

低表达Cbfa1基因的人牙周膜细胞模型的建立及鉴定

目的:构建针对核心结合因子a1(Cbfa1)的mU6小干扰RNA载体,并将其转染到人牙周膜细胞hPDLCs,观察其干扰效果,以期建立稳定的低表达Cbfa1基因的hPDLCs模型. 方法:设计针对Cbfa1基因编码区的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经双酶切线性化的小干扰载体mU6中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定. 以脂质体法将mU6空载体和重组质粒分别导人hPDLCs细胞系. 用含G418的培养液筛选,挑取阳性克隆后用RT-PCR技术检测各hPDLCs克隆内Cbfa1 mRNA水平的表达情况. 结果:经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒Cbfa1-siRNA中插入的目的基因片段与预计片段完全一致. G418筛选转染细胞4wk后获得稳定转染mU6空载体的细胞克隆株hPDLCs-mU6和稳定转染重组质粒的细胞克隆株hPDLCs-siRNA. 经RT-PCR鉴定,Cbfa1在hPDLCs-siRNA细胞中的表达比对照细胞明显降低. 结论:成功构建了针对Cbfa1的小干扰RNA载体,成功建立了稳定的低表达Cbfa1的hPDLCs模型,为进一步研究Cbfa1的功能奠定了实验基础.     

HO-1siRNA表达载体的构建及其稳定转染SGC7901细胞系的建立

目的:构建携带绿色荧光蛋白的HO-1基因siRNA表达载体,通过将载体转染入胃癌细胞株SGC7901筛选稳定转染细胞株.方法:参照前期工作,构建可用于筛选阳性克隆并带有绿色荧光的HO-1基因siRNA表达载体,采用脂质体转染法将载体转入SGC7901细胞中,并用G418进行阳性克隆筛选,获得稳定转染细胞系.结果:经酶切和测序验证,证实表达载体构建成功,将HO-1 siRNA表达载体转入SGC7901后,通过G418筛选获得稳定转染细胞系,经检测HO-1的表达水平明显低于为未转染的细胞.结论:本实验成功地构建了HO-1基因siRNA表达载体,筛选出HO-1基因沉默的稳定转染胃癌细胞系,为今后研究HO-1基因的作用机制提供了实验基础.     

pIRES-p16ink4a-hRb1载体的构建及其对骨肉瘤细胞周期的调控

目的 应用内部核糖体插入位点（IRES）序列构建单启动子双顺反子穿梭载体pIRES-p16ink4a—hRb1并鉴定，观察其导入骨肉瘤细胞后对细胞周期的调控。方法 利用基因工程技术，将p16ink4a与hRb1全长cDNA编码区依次亚克隆至pIRES载体中，质粒构建通过PCR、双酶切与测序鉴定；脂质体转染至p161nk4a表达缺失、hRb1表达阳性的骨肉瘤细胞株MG63，G418筛选获得抗性克隆，通过RT-PCR和Western blot法分析外源基因表达；流式细胞术分析细胞周期特异性和细胞凋亡率，四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法与细胞生长曲线观察细胞增殖情况。结果 成功构建出pIRES-p16ink4a—hRb1载体，外源基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达。与对照组比较，双基因导人组细胞生长抑制率显著上升，细胞周期显著阻滞在G1期，且细胞凋亡率极显著升高。结论 pIRES-p16ink4a—hRb1双顺反子穿梭载体的构建与真核细胞导入、目的基因表达成功，为进一步研究p16ink4a与hRb1相互关系在细胞周期调控中的作用奠定了基础。     

丝氨酸/苏氨酸激酶31对骨肉瘤恶性生物学行为的影响

目的 观察丝氨酸/苏氨酸激酶31(STK31)在骨肉瘤中的表达及其对骨肉瘤恶性生物学行为的影响.方法 收取15例骨肉瘤组织标本及瘤旁正常组织标本,利用免疫组织化学技术、实时定量PCR技术和Western blot技术检测肿瘤组织及瘤旁正常组织中STK31的表达;构建STK31敲除质粒pGenesil-STK31-shRNA,以骨肉瘤细胞系MG63细胞为靶细胞转染pGene-sil-STK31-shRNA或对照质粒pGenesil-1,通过CCK8细胞活性实验,检测STK31对MG63细胞增殖能力的影响;Tanswell实验观察STK31对骨肉瘤细胞迁移能力的影响.结果 免疫组织化学显示肿瘤组织中STK31表达明显高于瘤旁正常组织;实时定量PCR检测骨肉瘤STK31 mRNA的表达量显著高于瘤旁正常组织[(3.65±0.83)vs.(1.05±0.14),P＜0.05];Western blot显示肿瘤组织中STK31蛋白表达显著高于瘤旁正常组织(P＜0.05);CCK8细胞活性实验显示敲除STK31后MG63细胞增殖能力明显降低,36 h后与对照组相比[(1.71±0.17)vs.(1.39±0.11),P＜0.05],72 h后与对照组相比](2.15±0.21) vs.(1.54±0.14),P＜0.05],差异均有统计学意义;Tanswell实验显示转染pGenesil-STK31-shRNA后,MG63细胞迁移能力明显受到抑制[(13±4)个vs.(55±8)个,P＜0.05].结论 STK31在骨肉瘤组织中的表达升高,具有增加骨肉瘤细胞生物学活性的作用.