可降解复合人工食管重建犬颈段食管的实验研究

目的：研究聚氨酯胶原蛋白壳聚糖复合人工食管重建犬颈段食管的可行性。方法：将医用聚氨酯管表面覆盖海绵状胶原蛋白壳聚糖膜制成的人工食管，通过手术替换15只犬颈段5cm食管缺损，术后给予营养支持，禁食2周或4周后通过内镜取出聚氨酯内管进行观察。结果：禁食2周后取出聚氨酯内管的5只实验犬，新生食管上皮再生不完全，术后1个月内均出现进行性狭窄无法吞咽；禁食4周后取出聚氨酯内管的10只实验犬，术后1个月新生食管完全上皮化，术后3个月，黏膜全层结构完整再生，术后6个月食管肌层部分再生。结论：聚氨酯胶原蛋白壳聚糖复合人工食管重建犬颈段食管具有可行性，通过聚氨酯内管提供临时通道，海绵状胶原蛋白壳聚糖膜提供适宜细胞爬行再生的三维多孔支架并维持足够长的降解时间，能促使自身食管完全再生。     

组织工程食管的研究进展

很多食管疾病需要行食管替代术,用自身组织行食管替代创伤大,术后并发症多,而现有的人工食管无法满足食管替代的要求.利用组织工程技术研究人工食管是解决这些问题的希望,本文就利用组织工程技术研究人工食管的发展进行综述.     

人工材料代食管动物实验的初步结果

目的观察人工材料代替犬切除食管后消化道重建的初步结果。方法将犬的食管切除一段,然后植入钛镍带膜支架,联接两食管断端,观察新生食管的生长情况。结果6只实验犬除1只因麻醉失败当场死亡外,其余5只均列入观察范围。第2、3、4只因感染分别于术后3、4、9d死亡,第5、6只分别存活62、127d后人为处死。第5、6只犬支架分别于术后第18、31天脱落,而且病理检查发现均出现了新生食管中段狭窄,发生呕吐甚至进流质饮食困难,但持续一段时间后狭窄又会逐渐缓解,能进半流质饮食。结论人工材料代替食管是可行的,虽然人工食管留置一段时间后必然会脱落,而且也会发生新生食管狭窄。但持续一段时间后又会白行缓解,具体原因还有待进一步观察研究。     

组织工程食管种子细胞的选择

食管癌的首选治疗方法是病变食管切除、食管重建术，临床上常用自体结肠、空肠、胃等重建食管，手术创伤大，术后吻合口瘘、狭窄、坏死、反流等并发症多，并且以牺牲部分消化道功能为代价。应用人工材料行食管重建，又面临着人工材料与宿主组织相容性差、上皮化不理想、免疫及炎性反应等诸多问题。因此，人们一直在努力寻求更加适宜的食管替代物。“组织工程”（tissue engineering）的发展为解决这一问题带来新的希望。应用组织工程的方法再造组织与器官所用的各类细胞统称为种子细胞，是组织工程的基本要素。组织工程食管的种子细胞主要来源为自体、同种异体及异种组织的细胞等，只有获得足够数量并保持特定生物学活性的种子细胞，才能保证组织构建的成功。     

兔膀胱移行上皮细胞构建组织工程尿道的初步研究

目的 探索以膀胱移行上皮细胞为种子细胞构建组织工程尿道的可行性。方法 取兔膀胱移行上皮细胞，体外培养传代后作为种子细胞与自制胶原膜体外联合培养并行裸鼠体内移植，通过对复合物扫描电镜、HE染色及角蛋白免疫组化检测，了解细胞在材料上的生长情况。结果 2h后移行上皮细胞在胶原膜上贴附生长，复合物移植体内20d后，移行上皮细胞分化成层，层厚1～5层。结论 该方法获取的膀胱移行上皮细胞是构建组织工程尿道的良好种子细胞，与胶原膜构建的复合物在体内形成了尿道类似物，有望成为替代尿道的组织工程材料。     

去细胞猪主动脉瓣构建组织工程瓣实验研究

目的 观察未经戊二醛处理的去细胞猪主动脉瓣组织相容性和可降解性，并探讨基构建组织工程瓣可行性。方法 应用体外种植犬主动脉壁间质细胞和内皮细胞的去细胞猪主动脉瓣叶种植于犬腹主动脉内，观察其形态学和免疫组织化学变化。结果 （1）皮下埋藏实验显示瓣叶轻度炎症反应，10wk埋茂物完全降解吸收；（2）体外细胞种植后7d，见瓣叶表面有单层种子细胞覆盖；（3）体内，即腹主动脉内移植瓣叶，支架逐渐吸收，为新生细胞综合和分泌的纤维结缔组织所取代，至10wk末瓣叶完全重塑，在新构成的瓣叶中可检测到Ⅰ，Ⅲ型胶原、弹力纤维和粘多糖，间质细胞部分呈α－平滑肌肌动蛋白阳性表达，内皮细胞覆盖于瓣叶表面，Ⅷ因子染色为阳性。结论 去细胞猪主动脉瓣体外初步构建的组织工程瓣，移植入犬腹主动脉内经10wk观察，已初步形成具有活细胞的瓣叶组织，并提示组织相容性优于人工合成材料。     

体外构建组织工程心脏瓣膜动物实验初步研究

目的探讨应用去细胞猪主动脉支架(decellularized porcine aortic valve scaffold，APAVS)与兔骨髓干细胞(rabbit bone marrow stromal cells，RBMSCs)体外构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法采用去垢剂-核酸酶消化法处理，去除猪主动脉瓣细胞成分，并做去细胞前后的形态学检查和生物力学测定；在去细胞支架上种植兔骨髓干细胞，行形态学检查和免疫组化测定。结果光镜及电镜证实，猪主动脉瓣膜中的细胞成分可完全去除，获得完整无细胞的纤维网状支架；瓣叶去细胞前后的断裂强度和断裂伸长率无明显变化；种植的RBMSCs可在ACPAV表面形成一层连续的细胞层。结论种植RBMSCs于ACPAV上，可体外构造组织工程人工心脏瓣膜。     

人工食管移植重建犬颈部食管的方法研究

目的 建立并改进犬颈段人工食管重建的动物模型.方法 实验动物麻醉后,切除4 cm颈段食管,将可降解人工食管以"套入法"吻合于食管缺损,同时行胃造瘘术,术后2周禁食,经胃造瘘管予胃肠营养,2周后进流质.结果 所有实验动物均存活,未发生吻合口痿及食管狭窄.结论 使用"套入法"进行食管吻合并延长术后禁食时间可有效减少吻合口瘘的发生.术后早期经胃造瘘胃肠高营养是经济、安全、有效的营养支持方法.     

应用胶原蛋白构建组织工程皮肤的实验研究

目的 探讨以胶原蛋白为支架构建组织工程皮肤的体外培养理想方法.方法 体外分离、培养、鉴定角朊细胞和成纤维细胞;利用本室自制胶原蛋白,制备胶原凝胶和胶原海绵两种组织工程支架;在成功构建人工真皮的基础上,种植角朊细胞,构建人工复合皮肤,并进行组织学及免疫组化检查.结果 制备的胶原海绵孔径平均100～150μm,孔隙率89%,组织相容性良好;两种皮肤替代物免疫组化染色显示Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白(FN)和层粘连蛋白(Laminin)阳性,HE染色可见均具有表皮和真皮双层结构,厚度约3mm,在形态结构上与正常皮肤相似.结论 培养的人角朊细胞和成纤维细胞种植于胶原蛋白支架上气-液界面培养可构建出具有类似天然皮肤结构的组织工程皮肤.     

人工生物可降解支架聚乳酸-聚乙醇酸种植人食管上皮细胞的实验研究

目的研究人食管上皮细胞在聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)三维支架上的贴附和生长情况,利用组织工程技术培养工程化人工食管.方法制作PLGA三维细胞支架;分离培养成人食管上皮细胞,体外扩增后种植到PLGA支架上.在体外和裸鼠体内分别培养食管上皮细胞-支架复合物,分期终止培养,进行组织学染色、扫描电镜、细胞角蛋白免疫组织化学检测.结果体外培养发现,人食管上皮细胞在支架材料上贴附生长良好,长期培养仍保持食管上皮细胞特性,裸鼠体内培养4周后可形成食管黏膜样组织.结论 PLGA支架适合食管上皮细胞黏附生长,可作为食管组织工程的细胞载体.利用组织工程的方法可获得适于移植的工程化人工い食管.     

人正常食管黏膜上皮细胞的纯化分离和传代培养

目的:探讨新的食管黏膜细胞的培养方法,以便能够获得大量细胞.方法:采用中性蛋白酶(Dispase)和胰酶先后消化从食管黏膜上分离上皮细胞,比较细胞在无血清培养基(K-SFM)和含100 ml/L胎牛血清的培养基中的细胞生长曲线和贴壁性;采用细胞角蛋白14、13(CK14,CK13)和波形丝蛋白抗体三者共同鉴定细胞.结果:细胞倍增时间在KSFM中为(51.5±11.5)h(n=3),而在含100 ml/L血清培养基中不能计算;在K-SFM中,贴壁细胞明显为高(P＜0.01);CK14阳性细胞百分率K-SFM组在不同时段均高,但两组内均随生长时间增加而减少;CK13阳性细胞则恰与其相反;两组中均未见波形丝蛋白阳性表达.结论:Dispase消化分离细胞,K-SFM作为培养基是食管鳞状上皮可靠的新培养方法.     

脱氧胆酸诱导正常人食管黏膜上皮细胞凋亡及其机制探讨

目的 观察脱氧胆酸(deoxycholate,DC)能否诱导体外培养的人正常食管黏膜上皮细胞凋亡,并探讨其机制。方法 采用无血清的角朊细胞培养基体外培养人正常食管黏膜上皮细胞;通过流式细胞仪(FCM)观察DC干预的细胞经碘化丙啶(PI)单染色后凋亡细胞百分比;AnnexinV-FITC结合PI双染色观察早期凋亡细胞比率;TUNEL试验凝胶DNA梯度电泳确定凋亡的发生。通过FCM分析干预细胞激活的Caspase3变化,免疫印迹法观察Fas蛋白、Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。结果 4种凋亡检测方法确定DC可诱导体外培养的食管黏膜上皮细胞凋亡,并成浓度时间正相关性变化。500μmol/LDC干预30min,含激活状态Caspase-3的细胞达21.3%,明显高于对照组的1.5%(P<0.01)。免疫印记法示细胞经DC干预前后Fas受体蛋白均为阴性表达,但Bcl-2蛋白表达水平下降,而Bax蛋白则上升。结论 DC可诱导人正常食管黏膜上皮细胞凋亡;此过程与Fas-L/Fas凋亡信号系统无关;而存在Caspase-3激活、Bcl-2减少和Bax增加,即与线粒体凋亡调节途径密切相关。     

脱氧胆酸诱导正常人食管黏膜上皮细胞凋亡及其机制探讨

目的观察脱氧胆酸（deoxycholate,DC）能否诱导体外培养的人正常食管黏膜上皮细胞凋亡,并探讨其机制.方法采用无血清的角朊细胞培养基体外培养人正常食管黏膜上皮细胞;通过流式细胞仪（FCM）观察DC干预的细胞经碘化丙啶（PI）单染色后凋亡细胞百分比;Annexin V-FITC结合PI双染色观察早期凋亡细胞比率;TUNEL试验凝胶DNA梯度电泳确定凋亡的发生.通过FCM分析干预细胞激活的Caspase 3变化,免疫印迹法观察Fas蛋白、Bcl-2和Bax蛋白的表达情况.结果4种凋亡检测方法确定DC可诱导体外培养的食管黏膜上皮细胞凋亡,并成浓度时间正相关性变化.500lμmol/L DC干预30 min,含激活状态Caspase-3的细胞达21.3%,明显高于对照组的1.5%（P＜0.01）.免疫印记法示细胞经DC干预前后Fas受体蛋白均为阴性表达,但Bcl-2蛋白表达水平下降,而Bax蛋白则上升.结论DC可诱导人正常食管黏膜上皮细胞凋亡;此过程与Fas-L/Fas凋亡信号系统无关;而存在Caspase-3激活、Bcl-2减少和Bax增加,即与线粒体凋亡调节途径密切相关.     

鼓膜上皮细胞和成纤维细胞的培养与鉴定

目的:探讨如何以简便快速的方法获得可以用于组织工程鼓膜构建的高纯度的鼓膜上皮细胞和成纤维细胞.方法:分离新生豚鼠的鼓膜组织,利用本实验建立的两步组织块培养法获得纯化的鼓膜上皮细胞和成纤维细胞,倒置显微镜观察细胞生长状态,免疫组织化学染色鉴定细胞来源.结果:用该方法可以获得纯化的鼓膜上皮细胞和成纤维细胞,细胞产量大,纯度高,鼓膜上皮细胞细胞具有典型的铺路石样形态,成纤维细胞呈梭形生长.结论:本实验所建立的两步组织块培养法可以获得大量高纯度的鼓膜上皮细胞和成纤维细胞以用于组织工程鼓膜的构建.     

胶原-壳聚糖和角膜基质细胞复合膜的构建及其生物相容性

目的：探讨以胶原-壳聚糖为生物支架构建角膜基质细胞复合膜及其生物相容性。方法：兔和人角膜基质细胞分离培养后种植到胶原-壳聚糖共混膜上,构建成复合膜后移植到异体大耳白兔角膜基质囊袋中,术后1、2和4周时分别于活体进行前节OCT、Cs-4检查和离体组织学及免疫组化检测,观察复合膜中角膜基质细胞生长状态、生物支架对正常角膜细胞的影响及生物膜的降解情况。结果：活体前节OCT、Cs-4检查和离体组织学及免疫组化观察结果显示,兔和人角膜基质细胞在胶原-壳聚糖共混膜上生长良好,移植后复合膜逐渐发生降解,角膜组织未发生坏死和溶解,角膜上皮、基质和内皮细胞形态结构正常。结论：胶原-壳聚糖可作为角膜基质构建的生物支架,角膜共焦显微镜及前节OCT作为新的手段可活体观察构建后的角膜基质生物学活性。     

兔膀胱移行上皮种子细胞的培养及扩增

目的 对膀胱移行上皮细胞进行原代及传代培养，探讨用于膀胱组织工程研究的移行上皮种子细胞的培养方法。方法 采用组织块培养法，将获取的移行上皮组织小块在添加附加成分的无血清F12培养基进行培养，观察培养细胞的形态及生长增殖情况，并对传代培养的细胞进行免疫组化染色鉴定。结果 原代移行上皮组织培养约9-10d时细胞可达90％的汇合，传代培养的移行上皮细胞生长稳定期较长，细胞至5—6代时生长状态仍然良好。免疫组化染色显示培养细胞为移行上皮细胞。结论 采用组织块培养法能成功地原代培养兔膀胱移行上皮细胞，在添加附加成分的F12培养基中移行上皮细胞能够稳定地传代培养，表明该法可为膀胱组织工程的研究提供一定数量活性良好的移行上皮细胞。     

兔口腔黏膜上皮细胞羊膜种植及生物学特性研究

目的研究羊膜作为载体种植兔口腔黏膜上皮细胞的可行性及生物学特征，探索眼表重建良好和来源丰富的移植材料和方法。方法将兔口腔黏膜上皮细胞种植于去上皮羊膜基底膜进行体外培养扩增。倒置显微镜观察细胞在羊膜上的动态生长过程，将培养获得的复合上皮片作常规病理切片HE染色和透射电镜观察。采用AE5单克隆抗体鉴定培养组织中有无角蛋白3表达。结果免口腔黏膜上皮细胞在去上皮羊膜基底膜面能黏附生长并增殖，体外培养3周左右即可在羊膜上汇合成片并分层。形成的复合组织由羊膜基底膜和较扁平的2～3层上皮细胞组成，基底层细胞与羊膜之间有半桥粒连接，细胞之间可见桥粒连接，细胞表达角蛋白3。结论兔口腔黏膜上皮细胞在去上皮羊膜上体外培养扩增能获得类似于角膜上皮的复层组织，为解决眼表重建供体来源不足的现状带来了新的希望。