外周血MSCs的分离培养及对G-CSF的动员反应

目的建市多种种属外用血间充质干细胞（MSCs）的分离培养方法，探讨其对粒细胞集落刺激因子（G—CSF）的动员反应。方法用percoll（1．131g/mL）分离多种种属外周血单个核细胞，进行贴壁培养MSCs。以G-CSF作为动员剂，培养骨髓和外周血来源的MSCs，计数动员前后的成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）。结果对多种种属进行外周血MSCs分离培养，成功率不同。在本实验条件下．可以稳定的直接分离培养出大鼠外周血的MSCs。G—CSF动员后，骨髓来源MSCs的CFU-F数昔显著高于对照组（P〈0．01）；外周血来源MSCs的CFU-F数量也显著高于对照组（P〈0．01），接近4倍。结论不同种属外周血MSCs分离培养难易不同，其直接原因是生理条什下外周血中存在的MSCs量少导致的。G—CSF可以有效地动员大鼠骨髓和外周血MSCs。     

从G-CSF动员的外周血细胞悬液培养的成纤维细胞样细胞的特性分析

目的： 研究从G-CSF动员的外周血细胞（PBC）悬液培养的成纤维细胞样（F-L）细胞的特性。 方法： 取PBC中贴壁细胞分4组培养：①RPMI-1640组；②L-DMEM组；③粒细胞集落刺激因子（G-CSF）组；④白细胞介素-3（IL-3）组。流式细胞仪分析各组培养的F-L细胞特性。 结果： 培养2-3周后，4组均能收获到F-L细胞，细胞贴壁生长，但不融合，不能连续传代培养，③④组细胞数量明显多于①②组，4组F-L细胞表型相似：CD33+、CD11c+、CD64+、CD14+、CD45+、HLA-DR+、CD86+、CD34-、CD38-、CD3-、CD19-、CD56-、CD29-、CD44-、CD105-；与单核细胞（PB-M）表型差异仅CD38表达不同而与间质干细胞（MSC）或树突状细胞（DC）表型明显不同。 结论： 从PBC培养的F-L细胞为巨噬细胞，不是MSC或DC；G-CSF、IL-3能提高F-L细胞培养数量，不改变PB-M向巨噬细胞分化的分化方向。     

粒细胞集落刺激因子动员对供者外周血细胞树突状细胞亚群的影响

目的：研究粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员对外周血单个核细胞（PBMNC）中树突状细胞（DC）亚群及其功能的影响。方法：以CD34^-Lin^- HLA-DR⁺细胞群设门4色荧光分析方法检测25例无关供者G-CSF动员前、后外周血细胞DC亚群；ELISA检测其血清相关细胞因子IL-12p40、IL-10、IFN-γ、IL-4活性，并分析DC₁/DC₂（CD11c⁺CD123^- /CD11c^-CD123⁺）比值与CD34⁺细胞含量的相关性。结果：G-CSF动员后, 供者PBMNC 的DC₁/DC₂比值显著低于动员前（P<0.05）；DC₁/DC₂与CD34⁺细胞含量呈负相关（r=-0.438, P<0.05），CD34⁺细胞/MNC≥0.4%时， DC₁/DC₂倒置；而血清相关细胞因子IL-12p40、IL-10、IFN-γ、IL-4水平无显著改变（P>0.05）； DC₂ HLA-DR表达上调而CD83不表达。结论： G-CSF动员后，供者外周血CD34⁺细胞数量增加的同时，DC₂数量也增加，这些DC₂尽管HLA-DR表达上调，但仍处前体细胞状态，不直接分泌或调节Th2细胞分泌免疫抑制因子。     

HGF及G-CSF诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞

目的 探讨肝细胞生长因子(HGF)以及粒细胞集落刺激因子(G-CSF)可否诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)分化为肝样细胞.方法 以贴壁法分离、培养大鼠BM-MSCs,流式细胞术鉴定表面标志.实验分为:对照组(10％ FBS),0.1μmol/L G-CSF干预组,20 ng/mL HGF干预组,HGF联合G-CSF共同干预组(0.1μmol/LG-CSF+ 20 ng/mL HGF),诱导后第7天、14天和21天提取细胞总RNA以及总蛋白后进行RT-PCR和Western blot检测白蛋白(ALB)和甲胎蛋白(AFP)基因mRNA转录和蛋白水平.结果 20 ng/mL HGF干预组和HGF联合G-CSF共同干预组P3代BM-MSCs诱导后细胞形态似肝样细胞.BM-MSCs表面标志物:CD34-PE 0.3％,CD45-FITC0.1％,CD90-FITC 99.6％,CD105-PE 99.8％.20 ng/mL HGF干预组和HGF联合G-CSF共同干预组检测到白蛋白(ALB)和甲胎蛋白(AFP)基因mRNA转录水平及蛋白水平表达.在第7、14、21天,随时间增加ALB表达量递增、而AFP表达量递减,且同一时间两组表达量均有差异(P＜0.05).结论 HGF能诱导大鼠BM-MSCs分化为肝样细胞,G-CSF对HGF诱导大鼠BM-MSCs分化为肝样细胞有协同作用.     

下肢缺血及G-CSF促进小鼠外周血内皮祖细胞动员

目的：观察下肢缺血以及腹腔注射粒细胞集落刺激因子（G-CSF）对小鼠外周血内皮祖细胞（EPCs）的影响。 方法： 建立小鼠下肢缺血模型，双色荧光标记流式细胞技术检测缺血状态下外周血内皮祖细胞的变化，同时给予G-CSF后观察对EPCs的影响。 结果： 下肢缺血后，外周血中反映EPCs变化的CD34和VEGFR2双荧光阳性细胞比例轻度增加，在缺血基础上同时给予G-CSF，上述变化更明显。 结论： 下肢缺血刺激可以使外周血内皮祖细胞数量增加，G-CSF通过骨髓动员可增强这种效应。     

胚胎干细胞诱导发育为树突状细胞的研究

目的：探讨胚胎干细胞（ESC）诱导分化为树突状细胞（DC）的实验方法，实现体外大规模扩增高纯度DC用于临床免疫治疗。方法：E14小鼠胚胎干细胞系在GM-CSF与IL-3联合作用下经胚胎体（EB）诱导分化为DC。不成熟DC （im-DC）流式细胞仪检测CD11c、CD80、CD86、MHC II-DR表达。用磷酸脂多糖（LPS）促进DC的成熟，收获细胞后观察细胞形态及摄片并做扫描电镜检查，分析细胞表型并与不成熟DC细胞表型做对比，异体淋巴细胞增殖实验行功能检测。结果：ES细胞来源DC呈典型DC形态学表现。im-DC CD11c、CD80、CD86、MHC-II表达低,m-DC CD11c、CD80、CD86、MHC-II的表达均较前明显升高。功能检测发现，ES细胞来源的DC具有强烈的激发同种异体淋巴细胞增殖的作用，证实ES细胞来源的DC具备正常的免疫学功能。结论：使用GM-CSF联合IL-3能成功诱导E14胚胎干细胞发育为DC。故ES细胞可作为DC来源的一条新途径，对于体外大规模制备DC用于免疫过继治疗提供了一个较好的方法。     

G-CSF动员自体造血干细胞在大鼠MCAO/R模型分化为神经元样细胞

探讨G-GSF动员自体HSCs在大鼠MCAO／R模型中分化为神经元样细胞的研究。采用大鼠大脑中动脉栓塞／再灌注(MCAO／R)模型,应用粒细胞集落刺激因子(G-GSF),促进骨髓造血干细胞(HSCs)分裂增殖并向靶区“归巢”,达到动员目的。观察大鼠神经病学评分,HE染色和免疫组化法观察病理改变及CD34、巢蛋白(Nestin)阳性细胞的表达。模型大鼠脑缺血／再灌注后24h时,大量淋巴、单核细胞浸润,脑缺血区少量Nestin细胞表达,无CD34细胞表达。模型动员组48h后,脑缺血区尤其是皮层缺血区大量CD34及Nestin阳性细胞表达,72h后CD34^ 细胞消失,但仍存在大量Nestin阳性细胞,且胞突增长;模型未动员组各时段未发现CD34^ 细胞,且Nestin阳性细胞明显少于动员组。结论：应用G-GSF可动员大鼠自体HSCs并向脑缺血区迁移,并可以分化为神经元前体细胞。     

粒细胞集落刺激因子动员外周血干细胞富集致肺损伤1例

背景：使用粒细胞集落刺激因子动员外周血干细胞后导致急性肺损伤仅有零星报道,机制尚不清楚。 目的：探讨应用重组人粒细胞集落刺激因子动员外周血干细胞富集导致肺损伤的临床表现、机制。 方法：报告1例粒细胞集落刺激因子动员外周血干细胞时导致咯血和影像学肺部结节状、片状阴影,并复习相关文献。 结果与结论：粒细胞集落刺激因子可能会导致肺损伤,机制可能和中性粒细胞在肺部聚集、黏附、释放炎症递质有关。     

人外周血及脐血树突状细胞的体外分离培养

取正常人外周血或脐血,经淋巴细胞分离液分离,取中间白膜层,培养板中进行粘附,粘附细胞加培养液和细胞因子（外周血加GM－CSF和IL－4,脐血加GM－CSF和TNF－α）培养,对其形态、表型和功能分别进行鉴定和测定。结果表明约经过1周左右培养,悬浮细胞表现为典型的DC形态,带有毛刺样凸起,经DC单克隆抗体染色后用流式细胞仪测定脐血72％为DC,外周血93％为DC,并且可以刺激同种异体淋巴细胞的增殖反应。所以通过这样的不同细胞因子组合可以从人外周血和脐血中诱导培养出大量的DC细胞,为其进一步的研究奠定了基础。     

G-CSF对外周血树突状细胞亚群比例的影响

目的 :了解G CSF对小鼠外周血树突状细胞 (DC)亚群比例的影响。方法 :以不同剂量 (0、5 .0、10 .0或 15 .0 μg)的G CSF ,分别皮下注射于BALB/c小鼠 ,连续 6d ,每天 1次。第 6天分离外周血DC ,用流式细胞仪检测DC1(CD11c+ CD8a-)和DC2 (CD11c+ CD8a+ )的比例并计算其绝对值。结果 :经不同剂量的G CSF刺激后 ,外周血DC1的绝对值无显著变化 ,而DC2的绝对值增加 5倍 (9.6× 10 6/Lvs 5 5 .1× 10 6/L ,P <0 .0 1) ,DC1/DC2比值降低 (4.2vs 0 .7,P <0 .0 1)。结论 :G CSF在体内可提高外周血DC2的绝对数 ,对DC1的数无明显影响 ,从而使DC1/DC2的比例倒置     

粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞治疗大鼠急性心肌梗塞

目的:探讨G-CSF动员的骨髓来源干细胞对急性心肌梗塞动物模型的治疗作用与对缺血濒死心肌的保护作用。方法:用异丙肾上腺素(ISO)复制急性心肌梗塞大鼠动物模型,于3h后用G-CSF动员骨髓干细胞释放和迁移至心肌梗塞部位,并分别于24h、48h和2周后杀死大鼠,取出心脏,检测心肌的病理变化情况。结果:用ISO后24h对照组可见散在心肌梗塞灶,坏死区周围有多量以中性粒细胞为主的炎症细胞浸润,而治疗组大鼠心肌坏死程度较对照组轻,浸润的细胞以单个核细胞为主;48h后对照组心肌梗塞灶进一步扩大,呈散在片状分布,而治疗组心肌梗塞灶扩大不明显,呈散在灶性分布,并可见成堆或散在分布的淋巴细胞样细胞;2周后,治疗组未见明显心肌梗塞后疤痕组织,可见新生的心肌细胞生长。结论:G-CSF对缺血濒死心肌有保护作用,用G-CSF动员骨髓来源的干细胞进行"自我移植",可用于急性心肌梗塞的治疗。     

骨髓间质干细胞输注对外周血干细胞移植造血恢复的影响

目的:观察骨髓间质干细胞 (MSCs)输注对外周血干细胞移植 (PBSCT)后造血恢复的影响。方法:去脾小鼠经粒细胞集落刺激因子动员后收获外周血单个核细胞 (PBMC)和扩增培养的骨髓间质干细胞 (MSCs),移植给经放 /化疗预处理的BALB/c小鼠,数量分别为10⁶PBMC(PBSCT组)、10⁴MSCs和10⁶ PBMC(实验1组)、10⁶ MSCs和10⁶ PBMC(实验 2组),观察受体鼠 4周的生存率、骨髓有核细胞 (BMNC)、粒细胞巨噬细胞集落形成单位 (CFU-GM)、成纤维细胞集落形成单位 (CFU-F)、外周血白细胞 (WBC)计数等指标。结果:实验 2组的生存率、BMNC、CFU-GM、CFU-F显著高于PBSCT组,WBC计数恢复较PBSCT组快 (P <0.05);实验1组和PBSCT组比较,WBC计算恢复快,CFU-F产率高 (P <0.05)。结论:骨髓间质干细胞输注有促进外周血干细胞移植造血恢复的作用。     

A combination of stem cell factor and granulocyte colony-stimulating factor enhances the growth of human progenitor B cells supported by murine stromal cell line MS-5

We have developed a long-term culture system using the murine bone marrow stromal cells MS-5 to support the growth of progenitor B cells with CD34^–, CD10⁺, CD19⁺, and cytoplasmic μ chain (Cμ)-negative surface phenotype from human CD34⁺ cells purified from umbilical cord blood (CB). When 10³ CB CD34⁺ cells/well were seeded on MS-5 stromal cells at the beginning of culture in the absence of exogenously added cytokines, progenitor B cells first appeared after 14 days, and the maximal cell production was achieved during the 6th week of culture. Intriguingly, the addition of recombinant human stem cell factor (rhSCF) and granulocyte colony-stimulating factor (rhG-CSF), but not rhIL-7, strikingly enhanced the growth of progenitor B cells from CB CD34⁺ population cultured on MS-5 stromal cells. The culture of progenitor B cells could be maintained until the 6th week of culture when some cells were revealed to have a Cμ⁺ phenotype, and a small number of cells had immunoglobulin μ chain on their cell surface in the presence of both rhSCF and rhG-CSF. When CD34⁺ cells were cultured physically separated from the stromal layer by membrane, supportive effects of MS-5 stromal cells for the growth of progenitor B cells were not observed. These results suggest that the present culture system could generate progenitor B cells to proliferate from CB CD34⁺ cells, that some of these progenitor B cells could differentiate into immature B cells in conjunction with rhSCF and rhG-CSF, and that a species-cross-reactive membrane-bound factor(s), which stimulates early human B lymphopoiesis, may exist in MS-5 stromal cells. Further studies are required to investigate the mechanism how rhG-CSF acts on progenitor B cells to allow their proliferation and differentiation.     

干细胞因子与粒细胞集落刺激因子预处理对大鼠骨髓间质干细胞增殖分化的影响

目的：探讨干细胞因子（SCF）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）促进骨髓间质干细胞（MSCs）增殖及促进其向心肌细胞分化的作用。方法：将SD大鼠随机分成对照组、SCF组、G-CSF组和SCF＋G-CSF联合处理组。流式细胞仪检测第4代MSCs细胞周期。用DAPI（25 mg/L）标记的P4MSCs与心肌细胞共培养。在共培养的第1 d至第5 d用免疫荧光技术分别检测心肌特异性肌节肌球蛋白重链（MHC）、肌钙蛋白T（TnT）的表达，统计向心肌样细胞分化的MSCs百分率。结果：（1）SCF和G-CSF联合应用能明显诱导MSCs进入S期，单因子SCF组和G-CSF组与对照组相比，也明显促进MSCs由G₀/G₁期进入S期（P<0.01）。（2）MSCs与心肌细胞共培养后，SCF和G-CSF联合组MSCs表达心肌特异性蛋白MHC及TnT的阳性百分率均显著高于对照组（P<0.01），单细胞因子组MSCs的心肌特异性蛋白MHC及TnT的阳性表达亦高于对照组（P<0.01）。结论： SCF和G-CSF对MSCs具有促增殖、促分化的作用。     

正常人外周血有核细胞膜表面G-CSFR的定量测定

目的:定量测定正常人外周血有核细胞膜表面G-CSFR的表达密度。方法:以荧光定量试剂盒作参照,利用荧光标记的抗G-CSFR单克隆抗体结合流式细胞技术测定22例健康人的外周血标本。结果:测定结果显示,中性粒细胞G-CSFR表达密度为(2 943±417)(antibodies bound per cell,ABC),单核细胞为(3 755±2 575)ABC,淋巴细胞为(996±369)ABC,CD3+T淋巴细胞为(2 787±946)ABC,CD19+B淋巴细胞为(10 112±6 345)ABC。中性粒细胞、单核细胞与T淋巴细胞间G-CSFR表达密度无统计学差异,淋巴细胞与其他细胞间及B淋巴细胞与其他细胞间G-CSFR表达密度存在统计学差异(P<0.05)。结论:研究描述了外周血有核细胞G-CSFR表达特点,将为今后同类研究提供参考。同时所用测定方法能够敏感、真实、客观地反映出各类细胞G-CSFR表达情况和规律,同传统的利用放免法相比,更为安全、便捷。     

Effects of granulocyte colony-stimulating factor on the kinetics of inflammatory cells in the peripheral blood and pulmonary lesions during the development of bleomycin-induced lung injury in rats

We evaluated the effects of granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) on the kinetics of inflammatory cells during the development of inflammation in bleomycin (BLM)-induced lung injury. G-CSF (100 microg/kg/day, s.c.) was administered to rats treated with or without BLM (2 mg/200 microl, intratracheally) for up to 14 days (Day 14) immediately after BLM treatment. In the BLM + G-CSF group, the lung injury score increased on Days 1 and 14, and the score of lung fibrosis on Day 14, respectively. Except for neutrophils, there were no effects of G-CSF on the number of inflammatory cells both in the peripheral blood and in the lung in both BLM-treated and -untreated rats at the acute inflammatory phase. In the G-CSF-treated groups, the number of neutrophil counts in the peripheral blood drastically increased on Day 1, temporally decreased on Day 3, and increased again on Days 7 and 14. The number of neutrophils in the lung markedly increased on Day 1 and then remained at a plateau level until Day 14. The neutrophil alkaline phosphatase score in the lung commenced to increase on Day 1, reached the maximal level on Day 7, and then remained at a plateau level until Day 14. Correlations between the numbers of neutrophils in the lung and the peripheral blood or the lung lesion score were only observed on Day 14. These findings suggest that the exacerbating effect of G-CSF on the lung injury coincided with the increase in the number of alkaline phosphatase-positive neutrophils infiltrating in the pulmonary lesion at the acute inflammatory phase and it lasted to the fibrogenic phase. The exacerbating effect of G-CSF on the severe BLM-induced lung injury seems to be related not only to the pulmonary accumulation of activated neutrophils but also to the severity of lung injury caused by the direct effects of BLM.     

Dendritic cell immunotherapy for autoimmune diabetes

Dendritic cells (DC) play important roles in the initiation of immune responses and maintenance of self-tolerance. We have been studying the role of DC in the pathogenesis of type 1 diabetes and exploring the ability of specific DC subsets to prevent diabetes in non-obse diabetic (NOD) mice. DC subeets that prevent diabetes in this model have a mature phenotype and induce the production of regulatory Th2 cells. We review here recent advances in this area and highlight the importance of optimizing culture conditions and purification methods in the isolation of therapeutic DC.