琼脂糖凝胶电泳及其应用于人血清β脂蛋白的分离和分型

1.本文用自制琼脂糖进行人血清蛋白质和脂蛋白电泳及免疫电泳均获得较理想的结果。2.用酒精处理透析膜做为琼脂糖凝胶的载膜透明无色不吸附油红“O”染料,获得了较理想的载膜,便于长期保存和分析,极适宜于光密度描绘和测定各种脂蛋白组分和百分含量。3.在清蛋白的存在下以自制琼脂糖进行电泳获得了清晰透明整齐,分辨力强的电泳图谱,可将人血清脂蛋白分为五种主要的脂蛋白,乳糜微粒,β脂蛋白,前β_2脂蛋白,前β_1脂蛋白和α脂蛋白五种,以及两种不经常出现的脂蛋白,极慢速的前β_3脂蛋白和前α脂蛋白。4.根据前β脂蛋白的出现与否,泳动的速度,出现的多少,染色的深浅以及乳糜微粒存在与否可将高脂蛋白血清电泳图谱分为八种不同的类型:即Ⅰ,Ⅱ_1,Ⅱ_2,Ⅱ_3,Ⅱ_4,Ⅲ,Ⅳ,及Ⅴ八种。5.自制琼脂糖电泳重复性较好,光密度测定同一标本获得了满意的结果。     

琼脂糖凝胶电泳分离纯化和制备质粒DNA

分离纯化质粒DNA,在遗传工程和质粒的 分子遗传学研究中是重要的一环。分离和制备 质粒DNA的方法很多,有：澳化乙锭密度梯度 祛^[2-5]、两相法^[6]、酸酚法^[7][碱变性法^[8]p、甲基化 白蛋白（MAK）柱层析法^[9]硝酸纤维素法^[10]、电 泳法^[11]等,这些方法都各有所长。根据质粒的超 卷曲结构、开环结构和线状结构的不同,各个质 粒分子量大小的不同,以及质粒DNA与RNA 和染色体DNA在电泳中迁移率的不同,在我 们实验室的条件下,研制了一种琼脂糖凝胶电 泳分离纯化和制备质粒DNA装置。运用这种 装置,纯化制备了以下质粒： pBR322, pASI, pUB110、F}lac+proA+B+, pVA517A, pVA517B, pVA517C, pVA517D, pVA517E, pVA517F, pVA517G和pVA517H。并且对它们进行了电 镜观察,对其中纯化过的pBR322和pASI质粒 进行了转化实验,证明它们有生物活性。同时, 应用这种装置,可以一次分离具有不同分子量 大小的几种质粒,回收率约为85多。结果表明, 这种装置结构简单,操作方便,是纯化制备质粒 DNA的一种可用工具。     

脂蛋白的研究 Ⅰ.人血清β脂蛋白的大量分离的新方法及其某些性质的研究

(1)本文利用大分子D.S.与β脂蛋白复合物的性质对血清β脂蛋白的大量分离及其某些性质进行了研究。(2)自制D.S.可以在中性pH与人血清β脂蛋白形成不溶的复合分子。该复合分子可以溶解于12%NaCl溶液中,并可用纯化学的方法分离,释放自由β脂蛋白。(3)该脂蛋白溶液经纸上电泳、琼脂凝胶电泳及琼脂免疫电泳的鉴定均证实为纯净的β脂蛋白,只有一种免疫性,不再含有可觉察出的D.S.。经超速离心分析,主要含有S,2—6的低密度脂蛋白及少量S_f值较高的β脂蛋白。(4)新鲜的β脂蛋白为草黄色液体,平均浓度为1克/100毫升,在可见光400—500mμ波长有三个明显的吸收峰,在紫外光275mμ波长有一吸收峰。于2℃冰箱保存二周或在4℃浓缩均不致产生沉淀。(5)本文对D.S.-β脂蛋白复合分子的性质进行了初步研究,并对其结合方式作了简单的讨论。(6)本文提供了一个简单、温和、不用长时间超速离心而可大量分离和浓缩血清β脂蛋白的化学方法。     

一种琼脂糖凝胶电泳分离质粒DNA的方法

分子无性繁殖已成为扩增特定 DNA 片段的广为使用的技术,而细菌质粒是很多无性繁殖工作中所选用的载体。近年来分离载体的方法,大多是根据载体 DNA 的共价闭合环状(CCC—DNA)性质及其对变性的抗性.在氯化铯—溴化乙锭梯度中,CCC—DNA 密度大,比线状 DNA 沉降快,所以用密度梯度超离心方法可获得高纯度的 CCC—DNA。但超离心方法在时间上、材料上都不够经济,在     

超速离心分离血清脂蛋白简易法

本方法介绍在没有Abbe折光仪调血清密度情况下,根据d=m/V公式(d=密度,m=质量,V=体积)摸索出用称量法以溴化钾调血清密度,即在试管里加一定体积血清,然后由少至多逐步加KBr,每加完一次搅匀,用微量加样器吸一定体积经KBr调过密度     

人红细胞酸性磷酸醋酶和醋酶D琼脂糖凝胶电泳法

红细胞酸性磷酸醋酶(EAP）和醋酶 D(EsD）在遗传上是两种重要的多态性酶类〔1］0 研究表明,对于中国人群来说,这两种同工酶类 有着较高的个体识Oil能力（discriminating power, 简称DP值）,其中EAP的DP值为0.51, EsD 的DP值为0.61 E2.31。在为骨髓移植提供遗传标 记证明‘习、群体遗传学、法医学等研究中,是经 常被选用的同土酶。它的遗传表型测定方法有 Hopkison163最初采用的淀粉凝胶电泳法,Grunbaum1s] 报道过的醋酸纤维素膜电泳法,以及sorensen[ 9,和Koster[7)等人选用的琼脂糖凝胶电泳 法。这些方法中,淀粉凝胶电泳法分辨力虽好, 但费时且繁琐。醋酸纤维素膜电泳分型方法简 单、快速,然而采用国产醋酸纤维素膜的分离效 果总不理想。为此,我们参照Rodamlbl方法,应 用国产琼脂糖,建立了EsD的高压琼脂糖电泳 分析方法。同时还设计了EAP同工酶的琼脂 糖凝胶电泳法,所获酶谱清晰,分型准确,较 Sorensen的方法I9]更满意。现将具体方法介绍 如下。     

RNA甲醛琼脂糖凝胶电泳的优化及探讨

目的:优化RNA甲醛琼脂糖凝胶电泳条件。方法:对实验器材进行彻底的RNase灭活处理;在原有电泳过程的基础上,增加预电泳、缓冲液液面的处理和制胶过程中未加入溴化乙锭等优化过程。结果:优化后的电泳不仅能验证总RNA的完整性,而且能鉴定RNA的分子大小。结论:优化的RNA甲醛琼脂糖凝胶电泳法操作简单、省时、快速,RNA条带清晰、定位准确、无弥散及非特异条带。     

RNA甲醛琼脂糖凝胶电泳的优化及探讨

目的：优化RNA甲醛琼脂糖凝胶电泳条件。方法：对实验器材进行彻底的RNase灭活处理;在原有电泳过程的基础上,增加预电泳、缓冲液液面的处理和制胶过程中未加入溴化乙锭等优化过程。结果：优化后的电泳不仅能验证总RNA的完整性,而且能鉴定RNA的分子大小。结论：优化的RNA甲醛琼脂糖凝胶电泳法操作简单、省时、快速,RNA条带清晰、定位准确、无弥散及非特异条带。     

枯草芽孢杆菌基因片段的琼脂糖凝胶电泳分离I．色氨酸C基因片段的分离

限制性核酸内切酶EcoRl酶切枯草芽孢杆菌(Bactllus subtlis) SR 22的 DNA,用琼脂糖凝胶电泳分离了色氨酸C基因(trpC)的片段,位于凝肢柱的10—11厘米处。冷冻挤压回收该段的DNA,荧电光分光光度计直接测定回收液中DNA的含量。电泳后比电泳前trpC 转化活性提高了37.7倍。这一段DNA的平均分子量为5.1×106,trpC片段的纯度为9.3％。     

AST同工酶的琼脂糖凝胶电泳NBT显色法

分布于细胞内线粒体及细胞质中的天门冬氨酸氨基转移酶(AST·EC·2·6·1·1)是人血清中含有的两种同工酶,分别称为AST-m和AST-c同工酶.AST-c电泳迁移率介于血清α-球蛋白与β-球蛋白之间.AST-m电泳迁移率相似于γ-球蛋白,琼脂糖凝胶电泳固蓝B染色法对m-AST检出率较低.用NBT显色法则可得到较好效果.     

影响琼脂糖凝胶电泳条带扭曲程度的因素

在不同的电压与载样量下,分别使用溴化乙锭（EB）与新型核酸染料GoldViewna II及GoldView对凝胶中的DNA进行染色,观察电泳条带扭曲程度,了解电压、载样量与核酸染料对琼脂糖凝胶电泳条带扭曲程度的影响.使用GoldViewna II染色,当电压≥10V/cm时,DNA条带的扭曲程度随载样量增大而加剧;当DNA载样量≥10ng时,DNA条带的扭曲程度随电压升高而加剧. 使用EB染色,仅当载样量≥50ng时,条带出现轻微扭曲,扭曲程度与电压无明显关系.结果表明使用GoldView染色,当电压不超过20V/cm或载样量不超过100ng时,DNA条带不扭曲.在琼脂糖凝胶电泳中,若要避免DNA条带扭曲干扰实验结果,使用GoldViewna II染色,若DNA载样量≥10ng,应控制电压≤5V/cm;使用EB染色,载样量应≤50ng;使用GoldView染色,可以使用20V/cm的电压缩短实验时间.     

琼脂糖凝胶电泳中DNA回收方法的比较

实验采用直接切取琼脂糖凝胶,进行Lambda DNA/EcoRI HindIII Marker的回收,将其与试剂盒回收进行比较,并对比切下的凝胶立即回收和在-20℃冰冻数小时回收的效果,结果表明实验采用的方法与试剂盒的比较产量相当,且重复性好,达到了分子生物学实验的要求.尤其实验方法在大片段的回收(21226bp)平均回收率是43.5956%与试剂盒的回收率:38.9761%相比有明显的优势,非常适合大多数实验室使用.     

一种改进的甲醛—琼脂糖凝胶电泳

构建ｃＤＮＡ文库,进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析以及ＲＴ－ＰＣＲ等分子生物学研究,都需要纯度高、完整性好的ＲＮＡ。鉴定ＲＮＡ的完整性通常需要进行甲醛－琼脂糖凝胶电泳。然而,传统的甲醛－琼脂糖凝胶电泳操作步骤繁杂［１］,本文提出一种改进的甲醛－琼脂糖凝胶电泳,不仅简化了操作,而且效果很好。我们以向日葵总ＲＮＡ和ｃＤＮＡ甲醛－琼脂糖凝胶电泳为例,对这一方法进行介绍。１ 材料与方法１．１ 总ＲＮＡ的提取及ｍＲＮＡ的分离：取向日葵花蕾１ｇ,按照改进的异硫氰酸胍法提取向日葵总ＲＮＡ［２］。利用磁珠法分离ｍＲ－…     

人血清脂蛋白的超速离心分离 Ⅱ.人血清极低密度脂蛋白和低密度脂蛋白性质的鉴定

本文对硫酸右旋糖酐粗制的VLDL和LDL混合液,再以区带超离心分离提纯的VLDL和LDL的样品,进行纯度鉴定、理化性质、免疫活性和化学组成的分析。琼脂糖和聚丙烯酰胺电泳结果证明,经脂质和蛋白染色均呈现一条带;免疫双扩散和免疫电泳只呈现一条沉淀弧;超速离心分析LDL 只有一个单一面尖锐的峰,上浮速率为6.75,与直接由人血清分离者无明显差异。证实本实验方法所得VLDL 和LDL 为较纯的制品,但从VLDL 和LDL 各管的琼脂糖电泳行为、电子显微镜中的分子颗粒大小以及VLDL 在分析超速离心中的上浮速率均提示:二者有亚类的存在,特别是VLDL。VLDL 和LDL 的化学组成分析说明LDL 与文献上报道数据一致,但VLDL 有一定差异。本方法为大量制备纯净的VLDL 和LDL 提供了一个有效的方法。     

人血清脂蛋白的超速离心分离——Ⅱ.人血清极低密度脂蛋白和低密度脂蛋白性质的鉴定

本文对硫酸右旋糖酐粗制的VLDL和LDL混合液,再以区带超离心分离提纯的VLDL和LDL的样品,进行纯度鉴定、理化性质、免疫活性和化学组成的分析。琼脂糖和聚丙烯酰胺电泳结果证明,经脂质和蛋白染色均呈现一条带;免疫双扩散和免疫电泳只呈现一条沉淀弧;超速离心分析LDL只有一个单一面尖锐的峰,上浮速率为6.75,与直接由人血清分离者无明显差异。证实本实验方法所得VLDL和LDL为较纯的制品,但从VLDL和LDL各管的琼脂糖电泳行为、电子显微镜中的分子颗粒大小以及VLDL在分析超速离心中的上浮速率均提示:二者有亚类的存在,特别是VLDL。VLDL和LDL的化学组成分析说明LDL与文献上报道数据一致,但VLDL有一定差异。本方法为大量制备纯净的VLDL和LDL提供了一个有效的方法。     

我国高β脂蛋白血症的分型及其与冠心病发病的关系的探讨

本文对正常、冠心病及心肌梗塞病人共247例的血清进行了琼脂糖电泳和胆固醇、甘油三酯及β脂蛋白的含量测定。主要根据βLP 电泳图象的类型,必要时参考血清脂质含量将247例被检人员分为Ⅱ-1、Ⅱ_2、Ⅱ_3、Ⅱ_4、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ七种不同的类型。按其在每种类型中分布多少排列次序如下:Ⅱ_4>Ⅱ_3>Ⅳ>Ⅱ-1>Ⅱ_2>Ⅲ>Ⅴ。以Ⅱ_4最多,88例,Ⅴ型最少,仅2例。247例中118例有高脂蛋白血症。他们在各型中的分布情况亦以Ⅱ_4型为最多,Ⅴ型最少。排列次序与上述情况类似;为Ⅱ_4>Ⅳ>Ⅱ_3>Ⅱ_2>Ⅱ-1>Ⅱ>Ⅴ型。118例高脂蛋白血症者中67例有冠心病,34例有高血压,20人有 MI。冠心病的分 布以Ⅱ_4,Ⅳ及Ⅱ_3型较多,Ⅱ_1型中最少,Ⅲ、Ⅴ型中无,但以本型计则发病率以Ⅱ_2、Ⅱ_1和Ⅱ_3较多,Ⅱ_4及Ⅳ型中较少,MI 多集中于Ⅳ、Ⅱ_4及Ⅱ_3型中。说明Ⅱ及Ⅳ型与冠心病的关系较为密切。此外,还观察了104例冠心病和42例高血压在各型中的分布,发现二者均较集中地分布于Ⅱ_4Ⅳ及Ⅱ_3型中。比较了它们在高 Tg、高 Ch 及高脂蛋白血症中的发生率。发现冠心病和高血压与高脂蛋白血症的关系比高 Ch 及高 Tg 血症更为密切。以上结果均说明Ⅱ、Ⅳ型与冠心病、高血压有密切关系,因此对该二型高脂蛋白血症的早期发现和治疗对冠心病的防治看重要意义