RAPD技术用于结核病交叉感染的鉴别

目的：调查RAPD技术用于结核菌株DNA指纹鉴定的效果。方法：采用多重PCR方法对一组2例母女同时发病的肺结核患者和一组2例先后发病的兄妹肺结核患者的病原菌进行了菌种鉴定。采用RAPD技术对它们的基因组DNA进行指纹多态性分析。结果：4株病原菌均为结核分支杆菌。经RAPD分型，其中母女组2菌株的DNA指纹图谱完全相同，兄妹组2菌株的DNA指纹图谱有所不同。证明母女组所染病原菌的同源性很好，很可能为同一感染源，母女之间交叉感染的可能性很大；兄妹组病原菌的同源性较差，为非交叉感染。结论：RAPD技术适用于结核分支杆菌流行病学调查，特别是交叉感染的鉴别。     

广东省结核病流行菌株研究

目的：从分子流行病学的角度探讨广东省结核分支杆菌菌株流行的分布。方法：构建广东省74株临床分离的以RFLP为基础的结核分支杆菌的IS6110 DNA指纹图谱技术，确诊结核分支杆菌菌株的流行分布。结果：24．3％（18／74）的结核菌株的IS6110 DNA指纹相似值在1－0．65之间，鉴定结果为它们均是“北京家族”结核分支杆菌菌株。结论：广东省结核菌株流行主要存在着遗传关系接近，在基因水平上相关程度较高的“北京家族”结核分支杆菌菌株，且该家族菌株正以一定的比例在我省流行。     

随机扩增DNA指纹分型分析耐利福平结核分支杆菌的传播

目的 对临床分离菌株进行鉴定,分析耐利福平结核分支杆菌是人群中传播。方法 采用一对随机引物（P15′－CCGGGGCGGTTC,P2,5′－CCGCCGACCGAC）,对从重庆地区肺结核病人痰标本中分离到的100株耐利福平结核发支杆菌的DNA进行随机PCR扩增,根据扩增产物的DNA电泳指纹进行分型。结果 100株耐利福平结核分枝杆菌的DNA指纹可分为6种类型,以Ⅱ、Ⅰ和Ⅲ型为主,它们分别占40％、31％和25％;这3型菌株有1／4是从初治结核病人的痰标本中分离,而地20－39岁年龄段则有1／3是从初治结核病人的痰标本中分离。结论 随机护增DNA指纹是一种简便、敏感、重复性好的菌株分型方法,可用于耐药性结核病流行监测。重庆地区结核病的流行很可能与耐利福平结核分支杆菌的传播有关。     

固原地区结核分子流行病学的特点

目的　探讨宁夏固原地区结核分子流行病学的特点。方法　提取结核分枝杆菌基因组DNA ,经限制性内切酶PvuⅡ切割、琼脂糖凝胶电泳和Southern转印后 ,用荧光标记的IS6 110DNA序列中 2 45bp探针杂交 ,以核酸化学发光试剂盒探测荧光信号 ,比较各菌株指纹的IS6 110拷贝数和带型 ,分析流行菌株的特点。结果　固原地区流行结核分枝杆菌临床分离株DNA指纹图谱带型相似 ,IS6 110拷贝数较多。结论　固原地区流行的结核分枝杆菌多态性程度较低 ,在基因上具较近的亲缘关系。     

福建宁德市少数民族地区结核病分子流行病学研究

目的 了解福建省宁德市少数民族地区结核分枝杆菌的基因型特征。方法采用基于IS6110的PCR分型方法,对宁德市少数民族地区的73株结核分支杆菌进行检测,用Gel—Pro analyzer4．0软件和NTSYSpc2．10e软件对DNA指纹图谱进行聚类分析。结果根据IS6110-PCR指纹图谱,73株结核分支杆菌共分为两个主要类型,其中Ⅰ型48株占65．8％,Ⅱ型（北京基因型）25株占34．2％。汉、畲两族病例菌株指纹均为Ⅰ、Ⅱ型,但在两型中的分布差异有显著性（P〈0．01）,畲族以Ⅰ型居多,占78．9％。Ⅰ、Ⅱ型菌株耐药率分别为39．6％（19／48）、28．0％（7／25）。结论宁德市少数民族地区结核分支杆菌北京基因型呈一般水平的流行,汉、畲两族之间结核病存在近期传播关系,但畲族人群病例以Ⅰ型（非北京基因型）流行为主,且耐药率较高。     

部队军人及其驻地人群结核菌分离株分子标记分析

目的：探讨部队军人与驻地地方人群之间结核病的传播关系。方法：应用结核分支杆菌DNA插入序列IS6110作为引物，扩增结核分支杆菌参考株H37RV DNA，以同位素^32P-dCTP标记纯化的245bp扩增片段作探针，应用Southern免疫转印技术，与预先用限制性内切酶PvuⅡ消化的结核分支杆菌DNA杂交，得到限制性片段长度多态性图谱，结合患者的一般流行病学资料进行分析。结果：146株从部队和地方分离到的结核分支杆菌分离株，拷贝数在5以上的有138株，将这部分菌株按IS6110指纹特征分型可分为14个类型，部队和驻地患者分离株均以3个型别为主。且部队和地方分离菌株在各型中的分布无统计学差异。而耐药菌株指纹特征在三个主要型别中的分布与敏感菌株有显著性差异。结论：部队结核病与驻地地方结核病在传播中有密切的关系。提示部队结核病防治应与驻地地方结核病防治措施紧密结合。     

2000年中国结核病流行病学抽样调查菌株分子流行病学特征

目的　从分子流行病学角度探讨中国结核分枝杆菌的分布特征。方法　样本的获得采用全国范围等比例分层整群随机抽样 ;构建以IS6 110RFLPDNA指纹方法和以DR为基础的SpoligotypingDNA指纹方法 ;采用Gelcompare4 1软件对DNA指纹图谱进行数字化 ,比较其相似性 ;同时应用该软件行聚类 (cluster)分析 ;用 χ2 检验比较不同组别病人的分离菌株成簇率 (clustering)的差别 ,利用公式 1和 2计算影响结核病近期传播的危险因素 (OR值 )。结果　共获得 4 0 2株可进行DNA指纹分析的结核分枝杆菌 ;其中 5 0 75 % (2 0 4 / 4 0 2 )为“北京基因型”菌株 ;发现 3簇指纹图谱相同的菌株 ,其中 1簇对应的病人来源于同一家庭 ;分组统计显示 :男性组与女性组、年龄≥ 4 0岁组与<4 0岁组成簇率之间差异有显著性 (P <0 0 5 ) ,近期传播的危险因素男性为OR1:2 0 4 95 %CI(1 0 7～ 3 96 ) ,OR2 :4 96 95 %CI(2 77～ 9 0 0 ) ;<4 0岁为OR1:1 6 895 %CI(1 0 1～ 2 80 ) ,OR2 :1 30 95 %CI(0 2～ 0 4 4 ) ,其他各组之间差异无显著性 (P >0 0 5 )。结论　北京基因型结核分枝杆菌在中国呈较高水平的流行 ;男性和年长 (≥ 4 0岁 )可能为结核病近期传播的危险因素。利用结核分枝杆菌的DNA指纹图谱 ,可以实现结核分枝杆菌传染源     

结核分枝杆菌ERIC—PCR分型技术的建立

目的建立结核分枝杆菌ERIC—PCR分子生物学分型技术，并应用于临床分离菌株的流行病学调查。方法以肠杆菌科基因间重复序列（Enterbacterial repetitive interemc consensus，ERIC）为引物，对临床分离的结核分枝杆菌DNA进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后得到指纹图并进行分析。结果122株临床分离株产生42种不同的指纹图，密切接触者指纹图相同或相似，指纹图谱与患者年龄、菌株的耐药性及耐药种类有关。结论ERIC—PCR是结核分枝杆菌分子流行病学调查的有效技术。     

应用聚合酶链反应-膜芯片技术快速鉴定分支杆菌菌种

目的建立一种简便、快速、灵敏、特异的分支杆菌菌种鉴定方法。方法通过 1 6SrDNA聚合酶链反应 单链构象多态性 (polymerasechainreaction singlestrandedconformationpolymorphism ,PCR SSCP)分析鉴定 1 4 0株分支杆菌临床分离株 ;设计与合成用于鉴定分支杆菌菌种的 1 6SrDNA寡核苷酸探针 ,制作膜芯片 ,与待测菌株生物素标记的 1 6SrDNA基因PCR产物进行反向斑点杂交。结果 1 4 0株分支杆菌临床分离株中 ,经 1 6SrDNAPCR SSCP初步鉴定 ,1 33株为结核分支杆菌复合群 ,7株为非结核分支杆菌。经膜芯片杂交分析 ,1 33株结核分支杆菌分离株鉴定为结核分支杆菌复合群 ;7株非结核分支杆菌中 ,1株鉴定为戈登分支杆菌 ,1株为土分支杆菌 ,1株为偶发分支杆菌 ,1株为胞内分支杆菌 ,另 3株与分析探针杂交阴性。分析 2 8种分支杆菌标准菌株和 9种非分支杆菌菌株 ,结果显示寡核苷酸探针是特异的。结论 1 6SrDNAPCR 膜芯片技术灵敏度高、特异性强、简便、快速 ,可用于鉴定分支杆菌菌种     

淋球菌RAPD分型的引物筛选与应用

目的为了研究不同淋球菌菌株的基因多态性,了解不同菌株之间的亲缘关系,选择适当的随机引物。方法以淋球菌基因组DNA为模板,对淋球菌进行RAPD扩增,选择多态性好、重复性好、稳定性强的随机引物,并用S38号引物对不同淋球菌基因组DNA进行指纹图谱区分。结果从Sagon公司50条RAPD随机引物中筛选出8条扩增效果良好的引物,经RAPD扩增出的淋球菌指纹图谱间有明显不同的DNA多态性,可对不同菌株进行聚类分析。结论利用RAPD技术对淋球菌进行随机引物的筛选,可为今后淋球菌的分子流行病学研究奠定基础。     

结核病临床标本中结核分支杆菌利福平耐药基因型的快速测定

目的：建立快速测定结核临床标本中结核分支杆菌RFP耐药性的方法，探讨其应用价值。方法：应用PCR－SSCP银染色法和EB染色法对58株结核分支杆菌临床分离株和17例临床标本的rpoB基因进行分析。结果：PCR－SSCP分析结核分支杆菌rpoB基因的敏感性为1～10PgDNA；通过SSCP图谱分析可特异检测结核分支杆菌的rpoB基因突变。32株RFP耐药株中30株（93．8％）发生rpoB基因突变，呈现四种类型的异常SSCP图谱；26株RFP敏感株中1株（3，8％）有rpoB突变。2例涂片阳性培养阳性结核性疾标本有rpoB基因突变，与常规药敏试验相符；5例涂片阳性培养阴性和10例涂阴培阴的结核性标本均未发现rpoB基因突变。结论：大部分结核分支杆菌RFP耐药性产生是由于其rpoB基因突变所致，采用PCR－SSCP方法可快速测定结核病临床标本中结核分支杆菌RFP耐药基因型。     

肺炎克雷伯菌随机扩增多态性DNA的分子流行病学研究

目的采用随机扩增多态性DNA（RAPD）基因分型方法监测肺炎克雷伯菌医院感染。方法对临床分离的36株肺炎克雷伯菌进行RAPD基因分型,并通过指纹图谱比较与分析,确证医院感染爆发。结果36株肺炎克雷伯菌共分得33型,肺炎克雷伯菌医院感染局部流行共1起。结论RAPD可对肺炎克雷伯菌进行分子流行病学调查。     

RAPD技术在武汉地区结核分枝杆菌指纹分型中的应用

目的探讨武汉地区结核病的分子流行病学规律。方法采用DNA随机扩增多态性(RAPD)指纹分型法,对武汉市129例肺结核患者的结核分枝杆菌进行基因指纹分型。结果129株中以Ⅰ型菌株(46株,35．7％)、Ⅱ型菌株(32株,24．8％)、Ⅲ型菌株(26株,20．2％)为主。初治与复治者的RAPD指纹类型的分布有显著性差异(P＜0．05)。所检菌株耐药与否,在RAPD指纹类型中分布也有显著性差异(P＜0．05)。耐药菌株中主要以耐链霉素为主(81．2％)。结论RAPD指纹分型是一种较好的分型方法。武汉地区结核病主要由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型菌株引起,但耐药病例主要由Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型菌株引起。     

霍乱弧菌毒力强弱及菌株同源性的快速检测

目的建立一套快速检测霍乱弧菌毒力强弱及不同菌株同源性的实验方法。方法设计4对引物进行多重PCR检测菌株毒力基因特征;采用随机扩增多态性DNA(RAPD)结合SPSS软件分析不同菌株的同源性。结果通过多重PCR同时检测菌株CtxA、TcpA、Ace、Zot4种主要的毒力基因,并快速判定其毒力强弱;RAPD产生的指纹图谱条带清晰、数目较多、片段大小分布均匀,结合SPSS软件分析可判断菌株间的同源性关系。结论多重PCR和RAPD结合SPSS软件分析可在4h内完成对霍乱弧菌毒力强弱及不同菌株间同源性的检测,有助于在疫情处理中判断病菌来源和及时采取适当的处理措施。     

多重耐药鲍曼不动杆菌的基因分型及感染治疗分析

目的:建立鲍曼不动杆菌随机扩增DNA多态性(RAPD)分型方法,用于鉴定临床分离菌株,了解其流行病学特点,总结治疗经验.方法:从某外科普通病房分离出13株鲍曼不动杆菌,进行抗生素敏感性实验的同时对其中10株菌株提取DNA后进行RAPD分型,结合临床抗菌药物治疗效果进行分析.结果:抗生素敏感实验结果表明13株鲍曼不动杆菌均为仅对泰能、倍能等少数抗生素敏感的多重耐药菌株.其中10株进行RAPD基因分型的菌株可分为3种类型,其中8株为A型,1株为B型,1株为C型.结论:RAPD分型方法分型率高、简便、快速.应加强普通病房的消毒隔离措施,防止交叉感染.     

结核病的基因研究及应用

结核病分子流行病学研究始于 1984年[1 ] 。 1985年Ｍｕｌｌｉｓ创建了聚合酶链反应 (ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ,ＰＣＲ)技术。1989年Ｈａｎｃｅ等首先将该技术应用于检测分支杆菌 ,1990年我国引进该项技术 ,从而开辟了以ＰＣＲ为代表的分子生物学技术检测结核分支杆菌阶段[2 ] 及ＤＮＡ指纹技术。ＤＮＡ指纹的基本方法———标准的ＰＦＬＰ分析法 ,由Ｅｍｂｄｅｎ等[3 ] 1993年推荐 ,已在国际上得到广泛认同并采用。这一技术使全球范围内结核分支杆菌菌株水平鉴定的比较成为可能 ,我国于1999年首次报道[4] 。随着分…     

生物信息学技术在结核分支杆菌ESAT-6重组抗原研究中的应用

目的 应用生物信息学分析软件预测分析结核分支杆菌ESAT-6基因及相关蛋白的特性.方法 应用NCBI、Expasy等在线生物信息学网站及DNAstar、Rasmol等软件包分析ESAT-6并进行同源比对;预测二级、三级结构,以及预测主要抗原表位等.结果 结核分支杆菌重组抗原ESAT-6与已发表氨基酸序列同源性为90%.预测该蛋白分子质量约为9885.7Da,PI为4.6,4个抗原表位,其结构域位于56-87位.结论 生物信息学技术在结核分支杆菌ESAT-6重组抗原研究中有一定的理论和应用价值.     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因多态性分型研究

目的研究耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的基因多态性分型特征，为控制感染提供分子流行病学依据。方法利用一条10bp随机引物，建立随机引物多态性（RAPD）分析方法，并利用这一方法对44株MRSA进行基因分型的研究。结果44株MRSA中有30株产生RAPD指纹图谱，经电泳得到2．8条片段，可分为5个型，其中Ⅲ型菌株占50％。结论通过RAPD分型研究，可了解MRSA的基因型流行特征，为控制感染提供分子流行病学依据。     

结核分支杆菌耐乙胺丁醇分离株embB基因测序分析

目的：探讨结核分支杆菌对乙胺丁醇(EMB)产生耐药性的分子机制，建立直接快速检测结核分支杆菌EMB药物敏感性的实验方法。方法：采用PCR扩增技术对10株耐乙胺丁醇结核分支杆菌进行PCR扩增，扩增产物经纯化后，直接在ABI377型全自动测序仪上进行DNA测序分析。结果：10株EMB耐药株的embB基因测序有7株(70％)发现点突变，其中Met(ATG)→Lle(ATA)2例，Met(ATG)→Lle(ATC)1例，Met(ATG)→Lle(ATT)2例，Met(ATG)→Val(GTG)2例，另外3株EMB耐药株的embB基因测序未发现突变位点。结论：embB306位氨基酸Met被置换是结核分支杆菌对乙胺丁醇产生耐药性的重要机制，测序分析可确认耐药基因的突变位点，是快速检测耐乙胺丁醇结核菌的有效方法。     

应用PCR—SSCP检测结核分支杆菌链霉素耐药基因的研究

结核病耐药问题十分严重，传统的药敏实验需1～2月。Sm是一线抗结核药物，结核分支杆菌耐Sm最常见的分子机制是由于核糖体S12蛋白编码基因（rpsL）突变。该文应用PCR－SSCP分析了62个结核分支杆菌临床分离株的rpsL基因，以H37Rv标准菌株为对照，13个药物敏感菌株中12个rpsL基因未见SSCP异常；37个耐Sm株中，31个（83．8％）有rpsL基因泳动异常；12个耐其它抗结核药物林中，仅1个单链DNA泳动异常。因此，PCR－SSCP有希望成为简便、快速地检测结核分支杆菌耐药突变株的方法，弥补常规药敏试验的不足，指导临床治疗。