肉制品中牛源性成分多重实时荧光PCR检测 方法的建立及初步应用

目的建立肉制品中牛源性成分的荧光PCR检测方法。方法根据牛特异性线粒体DNA片段,设计合成两对引物,以生、熟牛肉及超市牛肉加工品为材料,建立肉制品中牛源性成分的多重实时荧光PCR检测方法,并用该法与国标法同时对市售的25份肉制品同时进行检测,通过对其他种类的肉源DNA进行扩增验证方法的特异性;对含有不同比例牛肉成分的DNA样本进行检测确定检出限。结果该方法可成功检测出肉制品中的牛源性成分。在25份肉制品检测中,与国标法检测结果一致。该法的特异性为100%,灵敏度检测线为1%。结论本研究成功建立牛源性肉制品的检测方法,该方法快速简便,且具有较高的特异性和灵敏度,可用于市售肉制品中牛源性成分的鉴定。     

肉及肉制品动物源成分联合检测方法建立及应用

目的建立肉及肉制品中6种动物源成分的联合检测方法,并对西安市场的肉制品掺假情况进行调查分析。方法设计猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅6种动物源成分的特异性引物,建立实时荧光PCR联合检测方法,对该方法的特异性和灵敏度进行验证,并用此方法检测西安市场上的肉制品。结果本研究建立的肉制品联合检测方法的特异性为100%,灵敏度可达1%,其检测50份样本,与标注成分不符的共有19份,占总样本的38%。结论成功建立了6种动物源成分的实时荧光PCR联合检测方法,可应用于肉和肉制品的掺假检测。     

基于荧光定量PCR鉴定冷鲜肉制品中羊源性成分及其含量

建立一种快速、准确鉴定羊肉制品中羊源性成分并且量化羊肉成分含量的方法。以羊线粒体细胞色素b基因为靶基因,设计出具有特异性引物。选择真核生物核糖体16S rDNA为内参基因,采用实时荧光相对定量法。羊肉质量百分比的对数值与之对应的循环阈值差值ΔCt呈良好线性关系。标准曲线回归公式为y=-3.4057x-0.3112,R2=0.9916,扩增效率达E达96.62%。本试验中羊源性DNA检测限可达16 pg/μL,回收率在93.07%~106.20%。抽取8份市售羊肉制品进行检测,有3份含量低于50%。本试验中建立的实时荧光PCR检测方法操作方便、特异性强、灵敏度高,所得数据可靠,为肉制品羊源性成分检测提供了参考方法。     

肉制品中鸵鸟源性成分的实时荧光PCR检测

通过实时荧光PCR技术检测肉制品中鸵鸟源性成分。根据鸵鸟线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(COX1)序列,用Primer Express和DNAMAN软件设计特异性的引物和Taq Man探针,并用阳性样本进行验证。结果表明,引物和探针对鸵鸟源性成分的特异性良好,与常见物种DNA无非目标扩增,该方法的检测灵敏度达0.27 pg/反应,适用于鸵鸟源性成分的鉴定,从而建立了肉制品中鸵鸟源性成分的实时荧光PCR鉴定方法 。     

交叉引物等温扩增检测猪肉源性成分

肉制品掺假现象已成为我国食品行业重点关注的问题。本研究使用交叉引物恒温扩增技术(Cross priming amplification,CPA)和核酸试纸条检测相结合的方法快速检测肉制品中猪肉成分。对猪线粒体的D-loop基因序列设计特异性的引物和探针,通过优化引物浓度及反应条件,确立最佳反应体系。实验结果表明,CPA扩增系统对猪源性成分的检测特异性良好,对单猪源性成分的检出限为1 ng/μL,对混合肉制品中猪源性成分的检出比例为10%(相当于10 ng/μL)。同时核酸试纸条可以快速检测CPA扩增产物,结果与凝胶电泳系统检测保持一致。本研究建立的CPA-核酸试纸条检测方法是一种特异、高效的肉制品中猪肉成分检测方法,可以为肉制品质量控制提供有效的新手段。     

应用通用引物量化检测鲜肉及其制品中羊源性成分

分别以牛、羊、猪、鸡、鸭、马线粒体细胞色素b基因为研究对象,设计羊源性成分特异性引物和探针,同时结合实时荧光定量PCR技术,引入16SrDNA内参基因校正羊种属特异性基因测定方法,建立快速、高通量的鲜肉及鲜肉制品中羊源性成分确证方法,实现科学准确的食品掺假量化判定技术体系。通过特异性、通用性及模拟混合样品的检测,对所建立方法进行验证。结果表明:建立的羊源性成分含量测定方法具有良好的特异性和通用性,且通过标准曲线的构建,呈现良好的线性关系均达0.996以上;通过羊种属特异性基因与16SrDNA内参基因Quantity值及校正系数,可以计算出样品中所含羊源性成份的质量百分比含量,经模拟混合样品的检测,回收率平均值到达96.25%,说明量化研究结果具有较高的准确性。     

SN/T 2980-2011在动物源性成分检测中的适用性分析

目的 探讨行业标准SN/T 2980-2011《动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分三重实时荧光PCR检测方法》在动物源性成分检测中的适用性。方法 基于中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2980-2011和国家标准GB/T 25165-2010《明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法》对鲜肉组织及加工肉制品进行动物源性成分检测实验, 建立依托上述标准的动物源性成分检测能力。结果 SN/T 2980-2011中牛源性成分检测特异性不佳, 山羊源性成分检测特异性良好, 绵羊探针仅适用于单通道实时荧光PCR检测; GB/T 25165-2010中的牛、羊源性成分检测均展示出良好的特异性。结论 建议SN/T 2980-2011行业标准的起草单位及起草人重新设计适用于三重实时荧光PCR的牛、绵羊引物及探针,既要保证引物和探针的特异性也要保证适用性。     

基于TaqMan实时荧光PCR检测鲜肉及加工肉制品中的驴源性成分

根据出入境检验检疫行业标准SN/T 3730.4—2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第4部分：驴 成分检测 实时荧光PCR法》合成引物和探针,利用TaqMan实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）技术检测鲜肉及加工肉制品中的驴源性成分。首先对13 种不同动物鲜肉组织的DNA进行驴源性成分特异 性检测,然后对驴源性DNA模板原液进行梯度稀释,检测方法灵敏度,最后在加工肉制品中检测方法的适用性。 结果表明：本研究建立的方法特异性强,除驴肉外,牛、羊、猪、马、骆驼、鹿、狗、兔、鸡、鸭、鸽子、鹌鹑 12 种动物鲜肉组织均无特异性扩增;方法的灵敏度较高,驴组分DNA的检出限可达100 fg/μL,灵敏度可达0.01%; 方法的适用性较广,可以用于加工肉制品中驴源性成分的检测。     

一种基于实时荧光聚合酶链式反应的肉及肉制品中猪源性成分含量测定

为了建立一种基于实时荧光聚合酶链式反应的肉及肉制品猪源性成分含量测定方法,分别以猪线粒体DNA的NADH4基因和16S rRNA基因为靶位点设计猪特异性引物、探针和通用引物、探针,建立猪源性成分含量测定方法,通过特异性、灵敏性、线性、准确度及市售肉制品检测,对该方法体系进行检验和评价.结果表明:建立的猪源性成分含量实时荧光聚合酶链式反应测定方法体系具有良好的特异性及灵敏性,最低可检测到0.4pg/μL纯猪肉DNA;无论是猪特异性体系还是通用体系都呈现良好的线性关系(R2均达到0.999以上)和较宽的线性范围;通过含猪源性成分的模拟混合肉样检测,样品猪源性成分含量的回收率平均值为122.27％,说明该方法具有较高的准确度;通过市售肉制品检测表明该方法可以用来检测实际样品(包括生鲜样品和熟肉样品)中猪源性成分含量.     

重组酶介导等温扩增技术快速检测牛肉及 牛肉制品中的牛源性成分

目的建立重组酶介导等温扩增技术快速检测牛肉及牛肉制品中牛源性成分的方法。方法应用重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),根据牛源性线粒体细胞色素b(Cytb)基因序列设计筛选了一对可用于扩增的引物,建立基于重组酶介导的等温扩增技术检测方法,并对该方法进行扩增温度、特异性和灵敏性验证。结果 40℃等温扩增条件下,所设计的引物的特异性为100%,该检测方法的灵敏性可达0.1 ng/μL。结论本研究成功建立了牛源性肉制品的等温扩增方法,该方法快速简便,具有较高的特异性和灵敏性,适用于市售生鲜肉制品及加工肉制品中牛源性成分的鉴定。     

荧光定量PCR方法鉴别肉制品中羊源性成分

根据羊线粒体DNA细胞色素b基因序列,设计特异性引物和Taqman探针。通过反应条件的优化筛选,构建标准曲线,建立灵敏、可靠的肉制品中羊源性成分的实时荧光PCR鉴别方法。结果表明,所设计的引物可有效地进行肉制品中羊肉成分的鉴别,特异性强,灵敏度高达16pg/μL;标准曲线扩增效率达98.561%,R2=1,符合《实时荧光定量国际化标准-MIQE指南》要求;本研究建立的方法检测结果与国标GB/T 20190-2006方法结果符合率达100%,且不需电泳、酶切和测序等步骤。通过对市售肉制品样本的鉴别验证了方法的实用价值,为肉制品质量的有效控制提供了新的途径。     

双重PCR检测食品中的动物源性成分

建立了一种检测肉制品中动物源性成分的双重PCR技术,针对五种不同动物线粒体DNA中所含有的特异性基因分别设计引物,同时对脊椎动物所共有的保守基因进行引物设计,并将其作为体系中的内参照.用此技术可同时检测出肉制品中5种动物源性成分,检测灵敏度达到1%,能够适应市场化检测的需要.     

肉制品中羊源性成分的定性和定量检测

通过检测肉制品中DNA的来源进行动物源性检测是打击鲜肉及加工肉制品制假掺假的重要技术手段。依据GB/T 25165—2010《明胶中牛、羊、猪源性成分定性检测方法 实时荧光PCR法》合成用于TaqMan 实时荧光聚合酶链式反应的引物和探针,利用鲜肉及加工肉制品进行羊源性成分定性和定量检测方法研究。首先利用12 种不同动物鲜肉组织的DNA检测方法的特异性,然后以羊源DNA梯度稀释液为模板进行灵敏度实验,最后在加工肉制品中检测方法的适用性和定量检测能力。结果表明：此方法具有羊源性成分检测特异性,对其他动物来源的鲜肉DNA均无扩增信号,可以检出羊肉和猪肉混合样品中0.1%的羊肉;方法灵敏度高,可以检出10 pg的羊源DNA;方法适用性广,可以对加工肉制品（羊肉干）进行羊源性成分的定性和定量检测。     

荧光定量PCR方法检测肉制品中鳄鱼源性成分

针对鳄鱼色素细胞b基因序列设计特异性引物,建立一种快速、特异、灵敏的鳄鱼源性成分检测方法。以常见羊肉、牛肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鱼肉、虾肉为参考动物物种作特异性检测,并经检出限和灵敏度实验验证其可行性。结果表明：该方法能够有效对鳄鱼源性成分进行快速检测,具有较强的特异性,鳄鱼组分DNA的检出限可达0.001 ng/μL,灵敏度可达0.01 %。通过加工肉制品的检测验证,该方法拥有特异性强、灵敏度高的特点,可以用于加工肉制品中鳄鱼源性成分的检测。     

基于LAMP法快速检测羊肉及其制品中的猪、鸭和羊源性成分

目的建立肉制品中猪、鸭和羊源性成分的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,对市售羊肉片、羊肉卷、羊肉串进行猪、鸭和羊源性成分检测分析。方法针对猪、鸭和羊线粒体Cytb基因分别设计2条外引物、2条内引物和2条环引物,优化LAMP反应条件,对猪、鸭和羊源性成分进行特异性和灵敏度试验,对羊肉制品进行上述动物源性成分监测。结果在0.2μmol/L外引物(F3和B3)、1.6μmol/L内引物(FIP和BIP)、0.8μmol/L环引物(FLP和BLP)、1 mol/L甜菜碱、6 mmol/L Mg SO4、1.6 mmol/L d NTP等参数的优化条件下,LAMP法对肉制品中猪、鸭和羊源性成分的检测灵敏度达0.5%。SYTO-9荧光染料的荧光实时检测结果与SYBR Green I染料肉眼观察结果一致。调查发现,该批市售羊肉及制品中存在掺假现象,掺假率为34.5%。结论 LAMP法具有操作简便、特异性强、灵敏度高、检测结果准确的特点,能有效地对肉制品中的猪、鸭和羊源性成分进行检测,可作为羊肉制品掺假的一种快速检测方法。     

食用植物油中动物源性成分PCR检测方法的建立

本文建立了应用PCR技术快速鉴别食用植物油中动物源性成分的方法。以食用植物油中掺入的动物源性基因为靶标,自行设计16S rRNA基因通用引物,同时选用动物物种特异性引物进行PCR扩增,分别得到相应的目的片段。通过三对16S rRNA基因通用引物,建立了从食用植物油中快速检测是否含有动物源性成分的方法;利用所选的动物物种特异性引物,进一步建立了从食用植物油中鉴定猪、牛、羊、鸡、鱼5种动物源性成分的方法,此方法能检测出含有0.1%(m/m)动物源性成分的植物油。     

微滴式数字PCR与实时荧光PCR检测羊肉制品中羊源和猪源性成分方法的比较

参考外文文献中羊肉和猪肉的特异性引物及TaqMan探针,分别建立一种定量检测羊肉制品中羊源和猪源性成分的微滴式数字PCR方法,并将该方法与标准SN／T 2051－2008中实时荧光PCR方法做对比来检测3份羊肉制品中的羊源和猪源性成分。结果表明,实时荧光PCR方法检测5号、9号、23号样品中的羊源性成分的Ct值分别是14?424／19?214、18?345／20?147、17?321／20?542;猪源性成分的 Ct 值分别是18?923／34?483、20?121／28?963、20?352／33?851;微滴式数字PCR方法检测5号、9号、23号样品中的羊源和猪源性成分的DNA拷贝数分别为236／0 copies／μL、421／0?3copies／μL、402／0?11copies／μL。表明两种方法均能检出3份样品中均含有羊源和猪源性成分,而微滴式数字PCR方法能够对DNA模板定量分析。结论：在肉种成分真伪鉴定上,微滴式数字PCR方法较实时荧光PCR方法更科学、准确。     

基于Cyt-B基因鉴定肉制品中鸭源性成分的研究

基于Cyt-B基因设计特异性引物,建立高效快速检测肉制品中鸭源性成分的方法。选取Cyt-B基因作为检测靶标,应用生物信息学技术设计各物种特异性引物,建立聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)体系检测肉制品中鸭源性成分,并将鸭特异性基因片段进行克隆和测序分析。该检测体系可以对鸭肉含量为1pg的肉制品实现稳定检测,灵敏度髙,特异性好。测序分析结果显示克隆的特异性基因序列与Genbank中相同物种(序列ID:EU755253.1)的核苷酸同源性达100%。该文建立的基于Cyt-B基因的PCR检测方法,可实现对肉制品中鸭源性成分高效快速的检测,既为肉类产品DNA鉴定试剂盒的研发提供试验基础,也有望对肉制品的市场监管和相关执法提供有力的技术保障。     

食品中鸡源性成分实时荧光PCR检测方法的建立

目的：建立基于实时荧光聚合酶链式反应技术的食品中鸡源性成分快速检测方法。方法：以鸡线粒体细胞 色素b为目的基因,设计特异性引物和探针,通过特异性、灵敏性实验及模拟混合肉样和市售肉制品检测,对该体 系进行验证。结果：该鸡源荧光聚合酶链式反应检测体系具有很好的特异性及灵敏性,可检测3.5 pg/μL鸡源DNA 的存在;经含鸡源成分的模拟混合肉样检测,证实体系抗干扰能力强;并且通过市售食品检测表明体系可用于定性 加工食品中的鸡源成分。结论：所建立的鸡源引物探针体系具有特异性好、灵敏度高、快速高效等优点,可用于对 食品中鸡源性成分的掺假鉴别。     

羊乳制品中动植物源性成分多重RT-PCR方法研究

羊乳制品因其营养丰富的特点受到消费者的青睐,但也容易成为乳制品掺假的主要目标。通过合成羊源性、牛源性、植物源性成分特异性的引物和探针,建立羊-牛-植物3种源性成分的双重和三重实时荧光PCR检测体系,并设计相应的特异性试验保证检测体系的准确性。本检测体系对羊源性、牛源性、植物源性成分的检测灵敏度可达0.1 ng/μL;羊乳中掺入牛乳的检测限可达到0.1%(体积分数);羊乳中掺入纯豆奶的检测限可达到0.5%(体积分数)。本研究建立的多重实时荧光PCR检测方法可实现准确快速、高特异性、高灵敏度检测羊乳制品中掺假掺杂的动植物源性成分。