猪旋毛虫不同发育时期虫体49ku ES抗原基因的克隆与序列分析

根据GenBank中已登录的猪旋毛虫49kuES抗原基因序列设计了1对引物，用SDS裂解液配合蛋白酶K方法从猪旋毛虫不同发育时期（成囊前期幼虫、肌幼虫、成虫）虫体中提取总RNA，用RT-PCR方法扩增49kuES抗原基因，将目的基因定向克隆入pMD18-T载体，转化大肠埃希氏菌TG1。用PCR、限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ进行单、双酶切鉴定，阳性质粒的测序结果表明，成功克隆了猪旋毛虫不同发育时期虫体49kuES抗原基因。序列分析结果显示：49kuES抗原基因大小为948bp，基因的保守性很强，序列同源性比较高，不同发育时期之间的差异很小。     

旋毛虫新生幼虫p46 000抗原基因的克隆及序列分析

应用旋毛虫感染猪血清，对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行了免疫筛选。对阳性克隆pBK-cMV-WN10的序列分析结果表明。cDNA全长为1352bp。含有1个1218bp的完整的开放阅读框架(ORF)，编码的多肽由406个氨基酸残基组成，其相对分子质量理论推导值为45900，等电点为5．43，N末端的信号肽及糖基化位点(NCS)表明其可能为分泌性糖蛋白，氨基酸序列19～156与158～295为重复区域，相似性为74％．C末端有1个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域，但旋毛虫p46000抗原与其他线虫的半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白结构有很大差异，可能已经失去半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白的功能。PCR结果显示。从旋毛虫新生幼虫、肌幼虫、3日龄成虫和5日龄成虫cDNA中均扩增出此基因，表明此基因在旋毛虫各个时期均有表达。     

2个旋毛虫新生幼虫期特异性相似cDNA的克隆及序列分析

利用旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA探针 ,从新生幼虫 c DNA文库中筛选出 2个相似的旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA克隆 ,分别命名为 N5和 N10 ,N5长度为 12 5 0 bp,N10长度为 12 33bp。 NCBI Blast检索表明 ,2个c DNA全长序列均为旋毛虫新基因序列。DNASIS分析表明 ,N5与 N10的开放阅读框架分别为 10 14、10 17bp,编码338、339个氨基酸 ,推导的成熟蛋白氨基酸序列均为 32 1个氨基酸残基 ,相对分子质量推导值分别为 35 30 0和 354 0 0。 2个氨基酸序列中 N端均包含有一信号肽序列 ,可能为分泌性蛋白。NCBI Blast及 Inter Proscan检索表明 ,以上2个氨基酸序列均含有 型核酸酶的功能结构域 ,均编码 型核酸酶 (DNase ) ,且与已报道的旋毛虫包囊形成相关蛋白 P4 3(经鉴定也为 DNase )同源性最高。目前已有的试验结果证实 ,P4 3并未直接参与包囊的形成 ,而是一种与P4 3蛋白同源性非常高的蛋白参与了旋毛虫包囊的形成。由于 N5与 N10为旋毛虫新生幼虫期特异性表达基因 ,也就是在旋毛虫包囊形成的时期表达 ,而且与 P4 3具有较高的同源性 ,并均编码 DNase 蛋白 ,因此 N5、N10具有参与旋毛虫包囊形成的潜在可能     

旋毛虫P53ES抗原基因的克隆及真核表达

应用RT-PCR方法扩增旋毛虫ES抗原P53基因,构建P53基因绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-P53,利用脂质体法将其转染哺乳动物细胞COS-7.于转染24 h后在荧光显微镜下观察到发绿色荧光的转染细胞;同时通过westen blot分析证实了P53基因表达产物的抗原性.结果表明,P53基因在COS-7细胞中表达获得了表达,而且其融合蛋白具有免疫原性.     

家蝇幼虫天蚕素基因的克隆与序列分析

1972年瑞典斯德哥尔摩大学Boman HG等用大肠杆菌注射惜古比天蚕蛹,从人工诱导的天蚕免疫血淋巴中发现了抗菌物质,并提纯得到了抗菌肽,并对它们进行了氮基酸序列测序分析,确定了抗菌肽的一级结构,命名为天蚕素（Cecropins）。随后研究表明,天蚕素族抗菌肽主要存在于鳞翅目昆虫,也存在于其它目昆虫体内．如双翅目的果蝇（Drosophila melanogaster）、麻蝇（Sarcophaga peregrina）、     

旋毛虫肌幼虫分泌性蛋白P49基因的克隆与表达

通过设计、合成引物，以旋毛虫RNA为模板，用RT—PCR法扩增出旋毛虫P49序列，并进行了序列测定。将P49基因亚克隆至表达载体pET—28b中，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，经IPTG诱导表达，作SDS—PAGE及Western blot分析。结果表明，PCR法扩增出P49序列，其大小约为960bp，将构建的重组质粒pGEM—P49进行序列测定表明其与Genbank中的P49序列具有高度的同源性。成功构建了重组表达载体pET—P49；SDS—PAGR及Western blot分析表明，表达产物分子量约为38kDa，约占菌体总蛋白的7％左右，且能被感染旋毛虫猪阳性血清所识别。     

旋毛虫丝氨酸蛋白酶基因的克隆与分析

以旋毛虫感染猪血清为抗体探针,对旋毛虫3日龄成虫cDNA文库进行免疫筛选,将获得的阳性克隆进行测序,用分子生物学软件对所得cDNA序列进行了分析。序列分析结果显示,阳性克隆Zh68cDNA全长为1372bp,含有1个1287bp的完整的开放阅读框架,编码由429个氨基酸组成的多肽,理论分子质量为47．5ku,等电点为8．45。SMART分析表明,1～18位氨基酸为信号肽序列,37～277位氨基酸为典型的丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶类结构域,其中His88、Asp142、Ser233为催化中心的3个主要氨基酸残基,78～80位氨基酸为N-糖基化位点（NCS）,另外还有6个保守的Cys形成二硫键。BLASTn同源性分析表明,与其他生物丝氨酸蛋白酶的基因序列无明显的同源性,为1个新的cDNA分子。BLASTp蛋白质同源性分析表明,与丝氨酸蛋白酶的同源性为30％左右。Southern—blot杂交表明,此基因在旋毛虫基因组中属于多基因家族,具有基因多态性。cDNA的PCR结果表明,此基因在旋毛虫肌幼虫、新生幼虫及成虫期均有表达。     

旋毛虫新生幼虫WN1抗原基因的克隆及表达

应用旋毛虫人工感染猪血清对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行免疫筛选，对阳性克隆WN1序列进行生物信息学分析。结果表明，WN1 cDNA全长为474bp，含有1个354bp的完整的开放阅读框架(ORF)，编码的多肽由117个氨基酸残基组成，其相对分子质量理论推导值为13200，等电点为4．25，N-末端的信号肽表明其可能为分泌性蛋白。GenBank数据库检索结果显示，此序列为一个新基因的全长cDNA。经PCR扩增WN1基因，将其克隆到原核表达载体pET28a，重组质粒经鉴定后，转化大肠杆菌BL21 star(DE3)并诱导表达出相对分子质量为15000的重组蛋白，与理论设计完全相符。     

蜜蜂囊状幼虫病RNA依赖的RNA聚合酶部分基因的克隆和序列分析

蜜蜂的囊状幼虫病是中华蜜蜂常见且危害严重的疾病,病原为一小正链RNA病毒。本试验通过囊状幼虫病的部分基因的克隆及序列分析,发现该序列与广东的囊状幼虫病毒有较高的同源性,但也存在着个别的碱基差异,可能是一种新型的变异囊状幼虫病毒。     

马动脉炎病毒大囊膜蛋白和膜蛋白基因的克隆与序列分析

参考GenBank收录的马动脉炎病毒(EAV)读码框大囊膜蛋白基因oRF5、膜蛋白基因ORF6的核苷酸序列，分别设计了2对引物，对EAV的这两种主要结构蛋白基因进行了RT—PCR；将扩增产物克隆于pUC18通用载体，对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序，证实克隆片段的可靠和准确性。测序结果，ORF5目的片段包含768bp，编码255个氨基酸组成的多肽；ORF6目的片段包含489bp，编码162个氨基酸组成的多肽。与EAVNC-002532标准毒株比较，ORF5、ORF6核苷酸的同源性分别为99．1％和99．4％；推导氨基酸的同源性分剐为96．99／6和98．29／6。     

本地毛形线虫49 ku排泄分泌蛋白基因的克隆及序列分析

为了获得本地毛形线虫(Trichinella nativa)49 ku ES蛋白的结构基因,用Trizol提取T.nativa肌幼虫的总RNA,用RT-PCR方法扩增出了编码T.nativa49 ku排泄分泌蛋白的结构基因。将PCR产物与T载体连接并经过大肠埃希菌增殖后送检测序。序列测定表明,目的基因TNPG长度为951bp,核苷酸序列同已发表的T.spiralis相应的序列P49同源性为98.63%,所推导的氨基酸序列同源性为99.05%。为T.nativa49 ku ES蛋白结构基因的进一步研究打下基础。     

本地毛形线虫49 Ku ES蛋白结构基因的分子克隆及原核表达

提取Trichinella nativa(T.nativa)肌幼虫的总RNA,用RT-PCR方法扩增出了编码T.nativa 49 Ku ES蛋白的结构基因。基因克隆后测序,序列测定结果表明:目的基因TNPG长度为951 bp,核苷酸序列同已发表的Trichinella spiralis(T.spiralis)相应的序列P49同源性为97.68%,所推导的氨基酸序列同源性为95.24%。将目的基因TNPG插入到原核表达载体pET-30a的BamHⅠ酶切位点处,并转化到感受态表达菌中进行诱导表达。结果显示TNPG在原核表达菌BL-21中获得了高效表达,表达产物为40.8 Ku的融合蛋白,表达量达到菌体总蛋白的22.8%。通过Western blot分析,表达产物可以被小鼠T.nativa和T.spiralis阳性血清以及它们的中国地理株的小鼠血清特异性识别。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4ORF6基因的克隆与序列分析

将猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）病毒BJ－4株在HS．2H细胞上增殖，经超速离心浓缩病毒。用TRIXOL LS试剂提取病毒基因组RNA后，用RT－PCR方法特异性扩增PRRS病毒BJ－4的ORF6基因片段；经Sma Ⅰ酶切鉴定正确后，将PCR产物克隆到pGEM-Teasy载体上，经Amp/IPTG/X-Gal平板筛选、酶切鉴定和质粒PCR鉴定，初步获得含ORF6基因的阳性重组质粒pGEM-T-ORF6。对重组质粒进行序列测定，并同美洲代表株VR2332和欧洲代表株LV进行比较，结果表明，BJ－4 ORF6与VR2332的ORF6差异较小，核苷酸和氨基酸同源性均为99．43％；而与LV株的差异性较大，核苷酸同源性为70．6％，氨基酸同源性77．4％。     

不同时期旋毛虫抗原对肥大细胞的作用

观察旋毛虫不同时期抗原对肥大细胞释放组胺和β-氨基己糖苷酶的影响。用质量浓度为1、5、25、50、100μg/L的肌幼虫抗原、成虫抗原、新生幼虫抗原分别与2.5×104的肥大细胞37℃条件下作用10min。采用荧光检测系统检测在上清液面及下层颗粒组分中的组胺水平,计算组胺释放率;加入20μL相同质量浓度的旋毛虫不同时期抗原分别与50μL 5mol/L对硝基酚-N-乙酰-β-D-葡糖胺和肥大细胞37℃孵育2h,酶标仪测定D值,计算β-氨基己糖苷酶释放率。结果显示,25μg/L肌幼虫抗原刺激肥大细胞释放组胺率最高,50μg/L最低;成虫抗原50μg/L最高,1μg/L最低,但均高于阴性对照组(P<0.05);而新生幼虫刺激肥大细胞不释放组胺,旋毛虫各期抗原不刺激肥大细胞释放β-氨基己糖苷酶。结果表明,肥大细胞在抗寄生虫感染的最初阶段扮演重要角色。     

盐生植物小花碱茅K+通道PtAKT1基因片段的克隆及序列分析

为研究小花碱茅(Puainellia tenuiflora)K⁺/Na⁺选择吸收分子机制,根据已报道的其他植物AKT1基因的保守序列设计一对简并性引物,以小花碱茅根部总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆出AKT1基因,以期为小花碱茅AKT1全长基因的克隆、表达调控及其作物改良的研究奠定基础。序列分析结果表明:该基因长度大约为1019 bp,编码339个氨基酸;所得序列与GenBank中注册的高等植物AKT1基因序列的同源性均在85%以上,与其他AKT1的氨基酸序列同源性达73%以上。     

本地毛形线虫HSP70基因的克隆与序列分析

根据GenBank中已发表的布氏旋毛虫HSP70基因序列设计了1对引物，用Trizol法从本地毛形线虫肌幼虫虫体中提取总RNA，用RT-PCR方法扩增了HSP70基因，将目的基因克隆至pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α。重组质粒用PCR、限制性内切酶BarnHⅠ和HindⅢ进行单、双酶切鉴定。测序结果表明，成功克隆了本地毛形线虫HSP70基因。序列分析表明，HSP70基因比较保守，不同物种之间氨基酸的同源性在40％～80％。与布氏旋毛虫HSP70序列相比，CDS区多出9个碱基，但核苷酸序列和氨基酸同源性分别为98%和94％，存在1个糖基化位点和1个潜在的信号肽位点。