天祝白牦牛SRY基因克隆与原核表达

从天祝白牦牛的基因组DNA中扩增了SRY（Sex-determining Region on the Y Chromosome，SRY）基因编码区序列，将其克隆至pGEM-T easy载体并送至生物公司测序，天祝白牦牛SRY基因编码区长687 bp，编码229个氨基酸；对牦牛和奶牛的SRY基因编码区进行序列比对，发现存在2个碱基的变异，造成1个氨基酸的变异；将牦牛SRY基因编码区连接至pET-28a(+)载体，成功构建了表达载体pET-28a/SRY；把表达载体pET-28a/SRY转入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中，在合适的条件下诱导该大肠杆菌，SRY蛋白得到了大量表达；对表达产物进行了Western-blot检测，进一步确定牦牛SRY蛋白得到表达。     

奶山羊短链脂肪酸受体基因(GPR43)编码区(CDS)的克隆及表达分析

GPR43是G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)家族成员之一,在脂代谢中具有潜在的调控作用。本实验旨在克隆奶山羊(Capra hircus)短链脂肪酸受体基因GPR43编码区(coding sequence,CDS)并分析其组织表达谱。根据GenBank上已登录的牛(Bos taurus)GPR43基因(NM_001163784)序列设计引物,利用RT-PCR方法克隆奶山羊GPR43基因的编码区(coding sequence,CDS)(GenBank登录号:HM623658),测序结果分析表明,该基因CDS区长度为987 bp,共编码329个氨基酸。序列同源性分析表明,奶山羊GPR43的核苷酸和氨基酸序列与牛、人(Homo sapiens)、鼠(Mus musculus)的相似性较高,且与牛的相似性高达90%以上。蛋白结构预测发现,奶山羊GPR43蛋白具有7个跨膜螺旋,且C端存在较强的疏水区域,N端则表现出较强的亲水性。实时定量PCR分析表明,在干奶期奶山羊的10个组织中,GPR43基因在脾脏中表达量最高,小肠、肝脏、脂肪次之,肺脏、肌肉和肾脏表达相对最少,而乳腺中也有少量的表达,表明其具有明显的组织表达特异性。泌乳期奶山羊GPR43基因的表达显著高于干奶期,表明该基因在奶山羊泌乳组织中具有一定的调控作用。研究结果为进一步揭示GPR43在奶山羊乳腺组织的功能提供参考资料。     

早酥梨病程相关基因非表达子1基因（NPR1）克隆及原核表达

本研究以成年早酥梨(Pyrus bretschneideri cv.Zaosu)叶片为材料,通过RT-PCR克隆早酥梨病程相关基因非表达子1基因(NPR1)并获得其全长序列1771 bp,开放阅读框为1761 bp,编码586个氨基酸(GenBank登录号:FJ769372).利用NCBI/Blastp和ClustalX软件进行相似性分析表明,目的基因编码蛋白质序列与日本梨(p.pyrifolia)、秋子梨(P.ussuriensis)、苹果(Malus xdomestica)、烟草(Nicotiana tabacum)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的NPR1蛋白相似性分别为99%、98%、98%、67%和59%.将其连接pGEX-4T-1原核表达载体并转化大肠杆菌(EScherichia coli)BL21,经IPTG诱导表达获得大小约为91 kD的目的融合蛋白,融合蛋白主要以包涵体形式表达,表达量约占总蛋白17%.     

猪NDUFS7基因的染色体定位、克隆和表达谱分析

利用辐射杂种克隆板对猪NDUFS7( NADH dehydrogenase(ubiquinone)Fe-S protein7)基因进行了染色体定位,克隆了该基因的完整CDS序列,用相关软件进行了基因结构和功能的预测,并用半定量RT-PCR技术分析了NDUFS7基因在猪的11种组织以及在33、65和90d胚胎和成年猪骨骼肌中的相对表达水平。结果表明,将NDUFS7基因定位于猪的2号染色体2q21-q24,与标记SW395紧密连锁。该基因的CDS全长648bp,编码215个氨基酸,预测编码的产物具有一个高度保守且与能量生成有关的NouB结构域和3个激酶的磷酸化位点。同时,半定量RT-PCR结果显示,NDUFS7基因在猪的11种组织中均有表达,但表达量有差异;在65和90d胚胎骨骼肌中的表达量较高,而在33d胚胎和成年猪骨骼肌中的表达量相对较低。     

睾丸特异蛋白Y基因(TSPY)对奶牛早期胚胎性别的鉴定

为方便性别鉴定方法在现场应用,利用睾丸特异蛋白基因(TSPY)建立了奶牛早期胚胎的非电泳性别鉴定方法.设计并合成了TSPY雄性特异和雌、雄共有基因引物,并利用已知性别的奶牛血液DNA为模板,初步建立了性别鉴定的PCR反应体系和非电泳的性别鉴定方法.灵敏度试验结果显示,雄性特异引物和共有基因引物对在模板10～60 Pg时,其性别鉴定的准确率为100%,提示TSPY基因具备鉴定胚胎性别的可能;同时采用非电泳法和环介导的等温扩增(LAMP)法鉴定6枚胚胎的性别,两者结果完全一致;用非电泳法检测TSPY基因鉴定了43枚胚胎的性别,对其中鉴定为雌性的21枚胚胎分别移植给自然发情后6～8天的受体,结果9头出生的犊牛均为母牛.结果表明.TSPY基因是一个很好的雄性特异标记,非电泳检测TSPY基因对奶牛早期胚胎性别的鉴定结果准确可靠.     

鸽子GR基因cDNA克隆与表达分析

糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)是保守的核受体超家族中的一员,属于核转录因子,GR对维持机体稳态起着重要作用,同时在动物繁殖代谢过程中扮演着重要的角色.本研究旨在克隆鸽子(Columba livia domestica) GR基因的cDNA全长并分析其组织表达谱.参照鸡(Gallus gallus domesticus)的GR基因序列设计引物,利用RT-PCR和RACE技术,克隆得到了鸽子的GR基因的cDNA序列.测序结果表明,鸽子GR基因包含有2313bp的全长CDS序列,102bp的5'UTR序列,以及18 bp的3'UTR序列,共编码770个氨基酸(GenBank登录号:NM001037826.1).通过序列同源性分析发现,鸽子GR氨基酸序列与鸡的同源性为94％,与短吻鳄(Alligator mississippienses)的同源性为85％,与人(Homo sapiens)的同源性为75％.通过与鸡、鳄鱼和人的氨基酸序列比对分析发现,鸽子的GR氨基酸序列中有一个非常保守的DNA结合区(DNA binding domain,DBD)和一个保守性较高的激素识别区(hormone recognition domain, LBD),此外还包括一个GR特异区域.利用qRT-PCR技术发现在鸽子不同组织中均有表达,表达量由高到低依次为睾丸、胰、肺、卵巢、腹部脂肪、肝、心、骨骼肌、肾、脾、输卵管、胃、下丘脑、大脑、肠和嗉囊.睾丸中表达量显著高于其他组织(P＜0.05),其次为胰腺和肺(P＜0.05),在嗉囊中的表达量显著低于其他各组(P＜0.05).本研究获得鸽子GR基因cDNA全长、组织表达规律,为进一步研究鸽子GR基因的功能提供了基础资料.     

口蹄疫病毒3AB基因的克隆与原核表达

根据口蹄疫流行毒株设计一对包含3AB部分基因编码区的特异性引物,扩增出3AB基因550 bp的特异带,并将纯化的扩增产物克隆到pM D 18-T载体上。再用设计的酶切位点将3AB基因分别连接到两种原核表达载体上,构建了重组质粒pETCK S-3AB及pET 28a-3AB,转入BL 21菌中进行原核表达。SDS-PAGE电泳表明,3AB基因在两种表达系统中均高效表达。对表达的蛋白通过包涵体及切胶纯化的方法进行纯化,获得了高纯度的3AB蛋白。     

猪骨骼肌NDUFS7基因的克隆、染色体定位和表达谱分析

摘要：本研究用辐射杂种克隆板对猪的NDUFS7基因进行了染色体的物理定位，克隆了该基因的完整CDS序列，用相关软件进行了基因结构和功能的预测，并用半定量RT-PCR技术分析了NDUFS7基因在猪的11种组织以及在33天、65天、90天胚胎和成年猪的骨骼肌中的表达情况。分析结果首次将NDUFS7基因定位于猪的2号染色体２q21-q24， 与标记 SW395紧密连锁。该基因的CDS全长648bp，编码215个氨基酸，预测编码的产物具有一个高度保守的与能量生成有关的NouB结构域和３个酶的磷酸化位点。同时，RT-PCR结果显示，NDUFS7基因在猪的11种组织中均有表达，但表达量有差异；在不同发育阶段的骨骼肌中，65天和90天胚胎时的表达量较高，而33天胚胎和成年猪的表达量相对较低。     

小鼠干扰素应答基因(Ifrg15)的克隆、原核表达及其融合蛋白的亲和纯化

为研究一个可能的干扰素应答基因(interferon responsive gene 15,Ifrg15)所编码蛋白质的生物学功能,对昆明小鼠(Mus musculus)基因组DNA进行PCR扩增获得Ifrg15(393 bp),并将其克隆到pGEM-T载体,经测序鉴定后用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切下Ifrgl5基因片段并和双酶切后的表达载体pET-41(c)进行连接,然后转化入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞.对重组克隆用IPTG诱导融合蛋白的表达,并进行分离纯化.结果表明,本实验在E.coli BL21(DE3)菌株中成功地高效表达、并在变性亲和层析条件下成功纯化了GST&6xHis-Ifrg15融合蛋白.     

Overlap PCR克隆黄牛脂肪特异性磷脂酶A2基因(AdPLA)及其原核表达

脂肪特异性磷脂酶A2基因(adipose-specific phospholipase A2,A dPLA)在脂肪组织甘油三酯水解过程中发挥着重要的调节作用,为了构建黄牛AdPLA基因原核表达系统,本研究通过Overlap PCR方法从黄牛(Bos taurus)基因组DNA中得到了AdPLA基因编码区全长,将其克隆到pGM-T载体上,阳性克隆经测序表明,与NCBI公布的序列(GenBank No.NM_001075280)完全一致.阳性质粒经BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切后,将其定向重组到pET28a(+)原核表达载体上,转化感受态大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)中,用IPTG诱导融合蛋白表达.SDS-PAGE电泳表明,融合蛋白His-AdPLA在大肠杆菌中表达,证明成功构建了AdPLA基因原核表达系统,为进一步研究黄牛AdPLA基因的功能和AdPLA蛋白产品开发提供了依据.     

猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF)基因的克隆与原核表达

通过RT-PCR方法,从经ConA刺激的猪外周血淋巴细胞中扩增出猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF）编码区的cDNA并将其克隆至pMD-19T载体,序列测定表明pGM-CSF基因的长度为435 bp,编码144个氨基酸。通过PCR方法获得缺失其N端17个氨基酸残基信号肽序列的成熟pGM-CSF蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a（+）,构建重组表达质粒pET-GM并转入大肠杆菌(Escherichia coli )BL21（DE3）中进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,表达的重组蛋白分子量约31 kD,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30.4% 。采用Ni2+-NTA亲和层析柱对经稀释复性的重组蛋白进行纯化,并采用MTT法以TF-1细胞检测纯化产物的生物学活性。结果表明,重组蛋白可有效刺激TF-1细胞增殖,其活性达到3.43×105 IU/mg。     

天祝白牦牛HSP60基因的克隆及其在下丘脑-垂体-睾丸中的表达定位研究

热休克蛋白60(HSP60)不仅在细胞保护方面发挥作用,也参与雄性动物生殖生理的调控。为研究HSP60基因序列特性及其在天祝白牦牛下丘脑-垂体-睾丸轴(HPT-axis)上的表达情况,探寻其在白牦牛睾丸发育、精子发生过程中的作用机制,本研究采用RT-PCR和RACE技术获得白牦牛HSP60基因全长cDNA序列,采用生物信息学方法分析HSP60蛋白的理化性质、结构及不同物种之间的同源性等,并利用qPCR、Western blotting、免疫组化法分析HSP60在白牦牛下丘脑-垂体-睾丸轴中的表达及定位。结果表明,白牦牛HSP60基因cDNA全长为2 300 bp,开放阅读框为1 722 bp,编码572个氨基酸;其理论分子量为60.977k Da、等电点为5.69,编码的蛋白为非跨膜可溶性蛋白。氨基酸序列比对结果显示,白牦牛HSP60氨基酸序列与牛、瘤牛、绵羊、藏羚羊、骆驼、白犀牛、兔和黑猩猩的氨基酸序列同源性高、进化水平相近。HSP60基因及蛋白在白牦牛的下丘脑、垂体及睾丸组织中均有表达,其中下丘脑及垂体组织表达量显著高于睾丸,下丘脑和垂体之间差异不显著。免疫组化结果显示,HSP60蛋白定位表达于白牦牛下丘脑组织的室旁核大细胞、室旁核小细胞和神经角演网、垂体组织的腺细胞、睾丸组织的精原细胞、精母细胞、支持细胞和间质细胞,而精子细胞中表达较弱。通过对健康成年白牦牛HSP60在下丘脑-垂体-睾丸轴的表达与定位检测,推断HSP60参与雄性白牦牛生殖轴调控,并参与睾丸发育与精子发生。本研究结果为进一步研究HSP60对雄性生殖调控奠定了基础。     

茶树β-葡萄糖苷酶cDNA克隆和原核表达

摘要：对与萜烯类香气前体及与抗病虫害有密切关系的茶树(Camellia sinensis ) β-葡萄糖苷酶cDNA进行克隆和原核表达。结果表明，该酶cDNA全长序列为1 475 bp(GenBank登录号为AF537127)，与其它植物同源性为40%～60%。α-螺旋构象14.33%、β-折叠构象25.43%，存在多个氨基酸功能结构域。利用pET-32a表达载体构建的重组质粒，转化到大肠杆菌(Escherichia coli )菌株BL21zztrxB（DE3）中，诱导产生63 kD的融合蛋白，表达产物具有正常的生物学活性，能催化葡萄糖苷键的水解反应；诱导表达结果显示，主要在细胞质中以可溶性蛋白形式进行表达。     

玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因的克隆与表达

玉米大斑病菌（Setosphearia turcica）属半知菌亚门丝状真菌，是严重威胁玉米生产的重要植物病原真菌。本研究克隆了玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因Stgb-1。Stgb-1基因全长1296bp，由5个外显子和4个内含子组成；开放阅读框（ORF）为1056bp，编码351个氨基酸，蛋白质计算分子量为39.081kDa。STGB1蛋白推导氨基酸序列与Cochliobolus heterostrophus（100%）、Cryphonectria parasitica（80%）、Aspergillus fumigatus（81%）等丝状真菌的G蛋白β亚基编码基因均具有较高的同源性。同时，利用RACE技术和Genomic Walking技术获得了Stgb-1基因3’-末端cDNA和DNA的3’端侧翼序列，BlastN结果表明其cDNA 3’-UTR为136bp，poly(A)由9个A构成。此外，构建了pET28a-Stgb-1原核表达载体，SDS-PAGE检测和Western blot鉴定结果表明，目的蛋白在E.coli BL21菌株中已成功实现了诱导表达，为进一步研究蛋白结构与功能的关系奠定了基础。     

九龙牦牛脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因(A-FABP)的克隆及其表达谱

根据普通牛(Bos tarus)脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因(A-FABP)序列设计PCR引物,用成年九龙牦牛(B.grunniens)脂肪组织总RNA,经RT-PCR扩增获得了399 bp的A-FABP基因序列(GenBank登陆号:EU815937.1),该序列与普通牛A-FABP基因的同源性高达98.7%,有4个氨基酸发生突变,并导致等电点的变化.利用半定量RT-PCR分析了九龙牦牛A-FABP基因的mRNA表达特性,结果除肺以外,在脂肪、骨骼肌、心、肝、肾和脾中均检测到A-FABP基因的表达,并且在脂肪组织中表达量极显著高于其他组织(P<0.01),在肝和肌肉中亦有较高表达.A-FABP基因在背最长肌中的表达0.5和9岁以上九龙牦牛显著高于3.5和5.5岁九龙牦牛(P<0.05),并且其表达与背最长肌的肌肉脂肪含量存在显著相关性.