SARS病毒M蛋白编码基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：克隆SARS冠状病毒膜蛋白M胞外区编码序列，并将其置于大肠杆菌作融合表达。方法：从GenBank获得SARS病毒BJ01株膜蛋白M编码基因序列，人工合成其氨基端129-base-pair(bp)双向单链DNA序列，在5’和3’端分别引入BamHⅠ、Ⅰ酶切位点，退火后形成双链DNA，常规法将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中，构建含M蛋白编码基因的重组原核表达质粒。重组质粒经酶切鉴定，核酸序列测定和分析后转化大肠杆菌(E．co如)BL21感受态细胞，以异丙基硫代一B—D一半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果：核酸序列测定与分析的结果表明，克隆的129bp基因序列与基因数据库中所登记的BJ01毒株序列呈现100％同源性。IPTG诱导后的菌体，经SDs-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，显示有一个大小为30．1ku的融合表达蛋白产生。结论：M蛋白氨基端胞外区129bp编码基因在E.coli中获得正确表达。     

日本血吸虫精氨酸酶编码基因cDNA的分离和序列分析

【目的】分离和鉴定日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,S .j)新基因。【方法】应用免疫学方法筛选S .jcDNA文库获得阳性克隆 ;通过PCR直接序列测定技术 ,表达序列标签 (EST)同源性检索对阳性克隆插入片段进行鉴定 ;采用亚克隆技术及生物信息学等技术 ,对获得的日本血吸虫精氨酸酶编码基因序列进行结构与功能的分析。【结果】获得了一个含10 6 1bp外源插入片段的阳性克隆 ,其cDNA序列含有一个 840bp的阅读框 ,编码 2 79个氨基酸 ,属精氨酸酶家族 ,与国际蛋白质库中的酵母、蛙、人和大鼠精氨酸酶序列的同源性分别为 44 % ,5 0 % ,5 1% ,5 3%和 5 4%。【结论】获得了编码日本血吸虫精氨酸酶编码基因全长cDNA ,为日本血吸虫精氨酸酶基因功能的研究奠定了基础。     

采用定位基因缺失突变技术在大肠杆菌中高效表达肿瘤坏死因子

肿瘤坏死因子α(TNFα)为157个氨基酸组成的细胞因子,在克隆的全长cDNA的5′端有480bp的非编码区,包括76个氨基酸信号肽编码区。作者采用寡核苷酸指导下的定仁基因缺失突变法,删除了这一非编码区及信号肽序列,并在成熟TNFα分子第一个氨基酸密码前插入TNFα全基因的Ncol-PstⅠ片段,插入     

ID4基因启动子克隆及表达调控载体的构建

目的深入研究ID4基因的表达调控机制。方法在NCBI人类基因组数据库中截取并下载ID4基因转录起始位点上游5′侧翼区约2242bp及下游5′非翻译区212bp的基因组序列,设计PCR扩增引物,采用分段扩增法,从健康人外周血中扩增获得2条长度分别为1829bp和784bp的产物片段,插入用于表达调控研究的pGL3Basic荧光素酶报告载体,实现连接,经测序鉴定。以此为基础进行亚克隆,分别获得5条5′端不等、3′端平齐的片段,插入pGL3Basic载体。结果获得了6条长度依次差别约为400bp的ID4启动子克隆,分别构建了调控荧光素酶报告基因的真核表达载体。结论成功克隆了人ID4基因启动子并构建了表达调控载体,为研究ID4启动子活性及表达调控奠定了基础。     

大鼠神经元Arnt2基因cDNA序列的分析

目的 克隆并分析神经元凋亡差异表达5号EST全长cDNA。方法 以大鼠大脑Marathon Ready cDNA为模板，采用SMART RACE技术克隆神经元凋亡差异表达5号EST全长cDNA，产物亚克隆刘pGEM-T easy质粒载体后进行序列测定以及同源性分析。结果 经过3次5’RACE扩增，得到的5号EST cDNA长度为5663bp，其中包含1个2136bp的完整的开放读码框序列，与已知大鼠基因芳香烃受体核转位因子2（Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator2，Arnt2）完全同源：该cDNA 3’瑞非编码区长达3323bp，包含3个AATAAA加尾信号和1个由12个腺嘌呤核苷酸组成的polyA序列。结论 5号EST目标基因为大鼠基因Arnt2，该基因3’端完整的非编码区cDNA序列为首次报道。神经元凋亡差异表达基因Arnt2的克隆鉴定为深入研究小脑颗粒神经元低钾性凋亡机制奠定了基础。     

恶性疟原虫肝期抗原1基因3′端的克隆及序列分析

【目的】克隆并测定恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)肝期抗原 1基因 (LSA 1) 3′端序列 ,比较FCC1/HN株与国外分离株LSA 13′端序列的差异。【方法】应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增LSA 13′端序列 ,用T A克隆法将其克隆入pMD18 T载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR扩增鉴定后 ,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用DNASTAR软件进行不同分离株LSA 13′端序列的同源性分析。【结果】PCR扩增得到特异的FCC1/HNLSA 13′端序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的 pT LSA 1重组质粒。测序表明 ,所克隆的LSA 13′端大小为 795bp ,编码 2 6 4个氨基酸。序列分析表明 ,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的NF5 4、T9/ 96、KEN、PNG及BRA株LSA 13′端编码的氨基酸序列只在 3个位点存在不同。【结论】克隆了恶性疟原虫FCC1/HNLSA 13′端片段。序列测定及同源性分析表明 ,FCC1/HNLSA 13′端序列与其它分离株有高度的同源性。     

大黄鱼凝血酶原类似基因的克隆及其表达分析

采用快速末端cDNA扩增法,首次从大黄鱼中克隆到全长为2 023 bp的凝血酶原类似基因cDNA,编码为617个氨基酸,其中包括80 bp的5′末端非编码区及89 bp包含poly(A)尾的3′末端非编码区。预测1～15位的氨基酸处存在1个信号肽。推导的氨基酸序列与哺乳动物及其他鱼类进行同源性比较,发现其与红鳍东方鲀有73%同源性,而与哺乳动物的同源性为50%～65%。凝血酶原类似基因虽然在大黄鱼的各个组织中组成型表达,但是在减毒鳗弧菌免疫的大黄鱼的脾脏和肾脏中表达明显上调,这表明凝血酶可能参与大黄鱼对细菌侵染的免疫应答。     

人源性肝细胞生长刺激因子cDNA克隆和序列分析

目的 :阐明人源性肝细胞生长因子 (HDSSF)的本质 ,为进一步基因克隆奠定基础。方法 :以简并PCR扩增获取目的基因片断 ;杂交筛选人胎肝cDNA文库 ;末段终止法进行HDSSF核苷酸序列分析。结果 :简并PCR扩增出接近HDSSF分子量 6 0 0bp片断 ;人胎肝cDNA文库经初筛和复筛获得含有目的基因的单克隆噬斑 ;测定了HDSSF基因序列 ,其cDNA链为 74 8bp ,含有 5 94bp的完整开放读码框架和 5′及 3′末端非编码区序列。序列分析显示HDSSF应为一含有 1 98个氨基酸残基的新的促肝细胞生长物质。结论 :本研究成功获得目的基因HDSSF克隆 ,人HDSSF克隆成功为开展人源性HDSSF的重组产品研制奠定了基础     

日本血吸虫精氨酸编码基因CDNA的分离和序列分析

【目的】分离和鉴定日本血吸虫(Schistosomajaponicum,S.j)新基因。【方法】应用免疫学方法筛选S.jcDNA文库获得阳性克隆;通过PCR直接序列测定技术,表达序列标签（EST）同源性检索对阳性克隆插入片段进行鉴定;采用亚克隆技术及生物信息学等技术,对获得的日本血吸虫精氨酸酶编码基因序列进行结构与功能的分析。【结果】获得了一个含1061bp外源插入片段的阳性克隆,其cDNA序列含有一个840bp的阅读框,编码279个氨基酸,属精氨酸酶家族,与国际蛋白质库中的酵母、蛙、人和大鼠精氨酸酶序列的同源性分别为44%,50%,51%,53%和54%。【结论】获得了编码日本血吸虫精氨酸酶编码基因全长cDNA,为日本血吸虫精氨酸酶基因功能的研究奠定了基础。     

p53凋亡刺激蛋白基因5′端非编码区CpG岛高甲基化与其mRNA表达的改变

目的了解ASPP1和ASPP2基因5′端非编码区CpG岛在野生型p53肿瘤细胞中的甲基化状况及其与mRNA异常表达的关系.方法用RT-PCR方法测定mRNA表达,甲基化特异的PCR方法测定DNA甲基化.结果肿瘤细胞中ASPP1和ASPP2 mRNA表达减少,同时ASPP基因的5′端非编码区出现异常高甲基化.结论 ASPP基因的异常高甲基化可能是引起ASPP mRNA表达降低的影响因素之一.     

日本血吸虫精氨酸酶编码基因cDNA的分离和序列分析

目的：分离和鉴定日本血吸虫（Schistosoma japonicum,S.j)新基因。方法：应用免疫学方法筛选S.j.cDNA库获得阳性克隆;通过PCR直接序列测定技术,表达序列标答（EST）同源性检索对阳性克隆插入片段进行鉴定／采用亚克隆技术及生物信息学等技术,对获的日本血吸虫精氨酸酶编码基因序列进行结构与功能的分析。结果：获得了一个含1061bp外源插入片段的阳性克隆,其cDNA序列含有一个804bp的阅读框,编码279个氨基酸,属精氨酶家族,与国际蛋白质库中的酵母、蛙、人和大鼠精氨酸酶序列的同源性分别为44％,50％,51％,53％和54％,结论获得了编码日本血吸虫精氨酸酶编码基因全长cDNA,为日本血吸虫精氨酸酶基因功能的研究奠定了.     

hfgl2凝血酶原酶基因5′端调控序列的克隆及生物信息学分析

目的扩增人纤维蛋白原样蛋白2(hfgl2)凝血酶原酶基因5′端调控序列,构建荧光素酶报告基因表达载体,对hfgl2基因5′侧翼启动子序列进行生物信息学分析,预测可能的调控区域及顺式作用元件。方法用聚合酶链反应(PCR)法从人外周血单个核细胞基因组DNA中扩增hfgl2凝血酶原酶基因5′端调控序列,PCR产物酶切后克隆至pGL3-Basic载体,重组质粒行酶切及测序鉴定,使用在线分析软件对5′端调控序列中的转录因子结合位点及启动子序列进行预测。结果扩增了长度为1 567bp的hfgl2凝血酶原酶基因5′端序列,酶切及测序鉴定证实构建的pGL3-hfgl2质粒插入片段正确无误,分析显示该基因序列共含有138个、31种顺式作用元件。结论构建hfgl2基因近端启动子转录调控序列荧光素酶报告基因的表达载体为研究hfgl2的转录调控奠定了基础。     

HIV-1gag基因p24编码区的变异性分析

目的　了解我国HIV感染者p2 4蛋白编码区的基因变异情况。 方法　收集我国河南及上海地区 2 8份已经证实的HIV - 1感染患者的血浆标本并抽提出RNA ;采用逆转录和Nested PCR的方法扩增所需的目的基因 ,使用DNA测序仪直接测序 ;应用CLUSTALW、PHYLIP等软件包对序列进行比对及进化树分析。结果　2 8份gag样本中 2 5份为B亚型 ,3份为A亚型。与共享序列相比 ,2 5例B亚型的 p2 4编码区中发生核苷酸改变的位点比例为 0 .4 %～ 4 .8% ,平均为 1.4 % ,其中A→G占 2 0 .5 % ,G→A占 17.3% ;3例A亚型发生核苷酸改变的位点比例平均为 0 .2 4 %。在所有变异位点中均未发现G→A的高度突变。B亚型和A亚型内的基因离散率平均为 2 .9%和 0 .5 8% ,A亚型与B亚型之间的基因离散率平均为 11.1%。 2 5例B亚型根据基因序列所推测的p2 4蛋白发生氨基酸改变的比例为 0 .4 %～ 5 .2 % ,平均为 2 .2 %。进化树分析表明在我国河南地区HIV感染B亚型多为与泰国株相近的B’亚型。结论　HIV 1p2 4编码区仍相对保守 ,选择无变异发生的区域有助于免疫治疗及疫苗研制等方面的研究     

人vigilin基因全长编码区的分段克隆及鉴定

目的 为了探讨全长VIGILIN、VIGILIN的N端、VIGILIN的C端以及不同KH组合的功能,采取5分段扩增的策略克隆全长vigilin基因.方法 根据vigilin基因全长编码区内的限制性核酸内切酶位点,将vigilin基因全长编码区分为5段.从意外死亡健康成人肝组织中提取总RNA,RT-PCR分段扩增目的 基因,克隆至pUC118载体,测序,并亚克隆至pUC118载体,对接头部位测序.结果 获得8个大小不同的人vigilin基因编码区片段和全长编码区.重组全长vigilin质粒pC118/vigilin(12 345)经测序,与GenBank上登陆的人vigilin cDNA(NM:005336)序列完全一致.结论 用分段克隆的方法成功获得了人vigilin基因的全长编码区.     

肺炎克雷伯菌TEM-1编码基因的克隆测序及基因定位

目的 以我院临床分离的一株肺炎克雷伯菌99—799株为研究对象，对其所产β-内酰胺酶编码基因的序列、亚型及基因定位进行研究。方法 采用聚合酶链反应(PCR)，用β-内酰胺酶通用引物、blaTEM扩增获得β-内酰胺酶编码基因的片段，克隆入pUCm—T载体，以双脱氧链终止法测定核苷酸序列，再通过GenBank进行同源性检测确定其亚型和基因所在位置。结果 肺炎克雷伯菌99—799株所含β-内酰胺酶基因型为TEM型，与TEM-1编码基因序列完全相同，且同时位于细菌150 bp和80bp的大、小质粒上。结论 重庆地区临床分离肺炎克雷伯菌有TEM—1-β内酰胺酶基因亚型的存在.     

人源性肝细胞生长刺激因子cDNA克隆和序列分析

目的：阐明人源性肝细胞生长因子(HDSSF)的本质，为进一步基因克隆奠定基础。方法：以简并PCR扩增获取目的基因片断；杂交筛选人胎肝cDNA文库；末段终止法进行HDSSF核苷酸序列分析。结果：简并PCR扩增出接近HDSSF分子量600bp片断；人胎肝cDNA文库经初筛和复筛获得含有目的基因的单克隆噬斑；测定了HDSSF基因序列，其cDNA链为748bp，含有594bp的完整开放读码框架和5′及3′末端非编码区序列。序列分析显示HDSSF应为一含有198个氨基酸残基的新的促肝细胞生长物质。结论：本研究成功获得目的基因HDSSF克降．人HDSSF克隆成功为开展人源性HDSSF的重组产品研制奠定了基础。     

恶性疟虫肝期抗原1基因3′端的克隆及序列分析

目的：克隆并测定恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）肝期抗原1基因（LSA－1）3′端序列,比较FCC1／HN株与国外分离株LSA－1,3′端序列的差异。方法：应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增LSA－1,3′端序列,用T－A克隆法将其克隆入pMD18－5载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR扩增鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用DNASTAR软件进行不同分离株LSA－1,3′端序列的同源性分析。结果：PCR扩增得到特异的FCC1／HN LSA－1,3′端序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的pT－LSA－1重组质粒。测序表明,所克隆的LSA－1,3′端大小为795bp,编码264个氨基酸。序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1／HN株国外的NF54、T9／96、KEN、PNG及BRA株LSA－1,3′端编码的氨基酸序列只在3个位点存在不同。结论：克隆了恶性疟原虫FCC1／HN LSA－1,3′端片段。序列测定及同源性分析表明,FCC1／HNLSA－1,3′端序列与其它分离株有高度的同源性。     

人存活素基因编码区的克隆和序列分析

目的：克隆人存活素(survivin)基因编码区cDNA并进行序列分析。方法：以人骨肉瘤细胞系MG63的mRNA为模板，采用RT-PCR方法得到人存活素的编码区cDNA，克隆至载体pUC19中，酶切鉴定后进行序列分析。结果：获得人存活素编码区基因和重组质粒pUC19-SURVIVIN，DNA序列分析证实所获得的存活素基因编码区cDNA序列和文献报道一致。结论：采用基因克隆的方法获得人存活素基因，为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

对比分析5'-UTR和NS5b区序列确定广东地区HCV基因亚型

［摘要］ 目的 对比丙型肝炎病毒（HCV）不同区段系统进化分析法基因分型的差异,探讨广东地区丙型肝炎患者的HCV基因亚型分布。方法 RT-PCR分别扩增HCV5'-UTR（71nt-311nt）共241bp和NS5b区（8249nt-8650nt）共402bp的片段。序列分析后进行系统进化分析以确定病毒基因型及亚型。结果 HCV NS5b区段分型74例,其中1b亚型51例,2a亚型10例,6a亚型8例,3a亚型2例,3b亚型2例,1a亚型1例;5'UTR区分型74例,其中1型45例,2型11例,6a亚型10例,3a亚型3例,3b亚型5例;两区段共同分型49例,47例基因型一致,2例不同。结论 对比分析HCV不同区段基因序列,可深化对HCV基因型和亚型的了解。初步表明广东地区慢性丙型肝炎患者HCV基因亚型分布以1b为主;其次为2a、6a,两者比例相当;3b、3a也占有一定比例。 ［关键词］丙型肝炎病毒;基因型;5'-非编码区;NS5b区;系统进化分析     

犬MC2R基因5''-UTR、3''-UTR序列测定、分析及其 5''侧翼启动区序列分析

目的 分离犬MC2R基因CDS部分序列和该基因5'、3'非翻译区,并对5'、3'非翻译区和5'侧翼的启动区进行分析.方法 本研究采用反转录PCR(RT-PCR)和RNA连接酶介导的RACE (RLM-RACE)技术和BLAST分析软件.结果 得到了5'、3'非翻译区和部分CDS片段的序列,他们的大小分别为168 bp、1 366 bp和987 bp,并预测了大约1 500 bp的5'侧翼的启动区域.结论 对它们进行分析显示,该基因至少由两个外显子(exon1和 exon2)组成,exon1 和exon2的一部分编码5'非翻译区(5'-UTR),exon2其余的部分编码整个编码区.其启动区有inr, SF-1, SP1, CRE, PPRE, AP-1等多个顺式作用元件,这些为犬MC2R表达调控研究提供研究奠定基础.