蟾蜍灵对大鼠肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质分泌的影响

目的:探讨蟾蜍灵(bufalin)对脂多糖(LPS)诱导的大鼠肾小球系膜细胞(GMC)增殖及细胞外基质(ECM)分泌的影响.方法:体外培养大鼠肾小球系膜细胞,分为对照组、LPS刺激组(LPS5mg/L)和蟾蜍灵干预组(LPS5mg/L和蟾蜍灵1×10-8mol/L),应用台盼蓝拒染法检测蟾蜍灵对GMC的细胞毒性作用,通过MTT、流式细胞技术检测GMC增殖变化,RT-PCR检测转化生长因子-β1(TGF-β1)的mRNA的表达,ELISA法检测GMC培养上清中纤维连接蛋白(FN)及TGF-β1的表达.结果:MTT结果显示蟾蜍灵浓度在1×10-8mol/L及以上时呈剂量依赖性抑制GMC增殖(P<0.01).细胞周期分析显示蟾蜍灵组S期细胞比例较脂多糖组降低(P<0.01).蟾蜍灵干预组与脂多糖组相比TGF-β1的mRNA相对表达量减少(P<0.05),FN,TGF-β1蛋白分泌量减少(P<0.01).结论:蟾蜍灵对LPS作用后肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质分泌具有抑制作用.     

蟾蜍灵对脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡的影响

目的:探讨蟾蜍灵(bufalin)对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)凋亡的影响.方法:体外培养大鼠肾小球系膜细胞.分为对照组、LPS刺激组和蟾蜍灵干预组,应用台盼蓝拒染法检测蟾蜍灵对GMC的细胞毒性作用,应用透射电镜观察系膜细胞超微结构的变化,采用逆转录PCR检测Bax和Bcl-2基因mRNA的表达.Western blot法检测Bax和Bcl-2的蛋白表达.结果:透射电镜观察蟾蜍灵干预组可见凋亡早期形态学改变.逆转录PCR和Western blot结果显示蟾蜍灵组较脂多糖组Bax表达增多,Bcl-2表达减少,差异均具有统计学意义(P＜0.01),蟾蜍灵干预后,Bax较Bcl-2表达过量.结论:蟾蜍灵可能通过调节Bax和Bcl-2的相对表达量而诱导脂多糖作用后肾小球系膜细胞发生凋亡.     

蟾蜍灵对高糖诱导大鼠系膜细胞过表达纤维连接蛋白和结缔组织生长因子的影响

目的:观察不同浓度蟾蜍灵对高糖诱导的大鼠系膜细胞(MC)过表达FN及CTGF的影响,拟探讨其防治糖尿病肾病的可能作用?方法:体外培养MC,将细胞分为5组:正常对照组?高糖组?高糖 + 低浓度蟾蜍灵(5 × 10-9 mol/L)组?高糖 + 中浓度蟾蜍灵(5 × 10-8 mol/L)?高糖+高浓度蟾蜍灵组(5 × 10-7 mol/L)?以台盘兰拒染法检测蟾蜍灵对MC的毒性作用,48 h后,采用RT-PCR法和Western-blot法检测各组MC中FN?CTGF mRNA和CTGF蛋白的表达及其变化?结果:蟾蜍灵在5 × 10-9 ~5 × 10-7 mol/L浓度间对MC无明显细胞毒作用?48 h后,与对照组相比,高糖组CTGF mRNA和蛋白以及FN mRNA表达均显著增加(P < 0.05);高?中?低浓度蟾蜍灵干预能显著降低高糖诱导的上述指标表达,且呈浓度依赖效应(P < 0.05)?结论:蟾蜍灵能部分抑制高糖诱导的MC过表达FN,呈浓度依赖效应,其作用可能部分是通过降低促纤维化因子CTGF合成而实现,提示蟾蜍灵在DN纤维化防治领域具有进一步研究的价值?     

蟾蜍灵对PDGF—BB诱导的系膜细胞纤溶系统的影响

目的观察蟾蜍灵对血小板源性生长因子（plate derived growth factor-BB,PDGF-BB）诱导的系膜细胞（mesangial cell,MC）PAI-1、u—PA、t—PA的表达影响,探讨其对系膜细胞纤溶酶原／纤溶酶系统的作用。方法PDGF（20ng/ml）刺激体外培养的系膜细胞12h后,加入0．08μM蟾蜍灵干预12h,用ELISA法检测细胞上清培养液中PAI-1的表达量;RT-PCR法测定PAI-1、u—PA、t—PA基因表达变化。结果PDGF—BB可诱导MC中PAI-1的mRNA表达上调,并且表达增加,u—PA、t—PAmRNA转录下调;0．08μM蟾蜍灵可下调PDGF诱导的系膜细胞的PAI-1mRNA,上调μ-PA、t-PAmR-NA的转录,并抑制PAI—1的表达。0．08μM蟾蜍灵对正常系膜细胞无明显影响（P〉0．05）。结论蟾蜍灵可通过促进细胞外基质降解来抑制PDGF—BB诱导的肾小球硬化。     

细胞外信号调节激酶抑制剂协同蟾蜍灵诱导K562细胞凋亡

目的 观察细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERK )抑制剂PD98059与蟾蜍灵(bufalin)协同诱导K562细胞凋亡作用并探讨其分子机制.方法 采用台盼蓝拒染法测定细胞增殖活力;采用形态学观察和流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot方法检测bcl-2蛋白表达.结果 25～100 μmol/L 的PD98059与蟾蜍灵单独或联合应用可抑制K562细胞增殖,并诱导细胞凋亡,在此过程中下调bcl-2蛋白表达,且二者具有协同作用.结论 PD98059协同蟾蜍灵诱导K562细胞凋亡,其机制可能与下调bcl-2蛋白表达有关.     

蟾蜍灵对小鼠足细胞阿霉素模型nephrin和p38表达的影响

目的:探讨蟾蜍灵(bufalin)对阿霉素损伤足细胞nephrin和p38表达的影响。方法:体外培养正常足细胞并进行分组:对照组、蟾蜍灵组、阿霉素诱导组和阿霉素诱导+蟾蜍灵组。制备阿霉素损伤足细胞模型,蟾蜍灵按一定梯度浓度范围干预足细胞,MTT法确定其作用于足细胞的安全、有效剂量。倒置显微镜观察足细胞形态,实时荧光定量PCR检测足细胞nephrin和p38基因相对表达水平。结果:MTT法提示蟾蜍灵浓度10-8mol/L,足细胞成活率在90%以上。阿霉素诱导组、阿霉素诱导+蟾蜍灵组、蟾蜍灵组,倒置显微镜下观察足细胞形态与对照组相比无明显改变。实时荧光定量PCR检测足细胞nephrin mRNA相对表达,蟾蜍灵组较对照组无明显变化,阿霉素诱导组nephrin mRNA表达与对照组相比显著下降(P<0.05),阿霉素+蟾蜍灵组nephrin mRNA表达仍下降,但与阿霉素组比较明显升高(P<0.05)。实时荧光定量PCR检测p38 mRNA表达,各组较对照组表达均升高(P<0.05),阿霉素诱导组升高最显著,阿霉素诱导+蟾蜍灵组较阿霉素诱导组表达明显降低(P<0.05)。结论:蟾蜍灵可能通过调控足细胞nephrin的表达减缓阿霉素对足细胞的损害,此调节过程可能与足细胞p38的表达变化有关。     

大黄素抑制系膜细胞增生与周期素激酶抑制剂p27的关系

目的:探讨周期素激酶抑制剂p27在大黄素抑制肾系膜细胞(mesangial cell,MC)增生中的作用.方法:蛋白印迹(western 杂交)方法测定MC裂解液p27蛋白水平,3H胸腺嘧啶核苷(3HTdR)测定MC增生的情况,观察不同浓度大黄素(50 mg/L、100 mg/L )对肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)刺激的MC中p27水平及增生程度的影响. 结果: TNF-α (20万U/L)使无血清培养24 h的MC中p27水平降低,同时使3HTdR掺入增加;大黄素提高TNF-α刺激的 MC中p27水平,同时使3HTdR掺入减少.大黄素的上述作用随剂量的增大而增强. 结论: 大黄素可能通过提高p27水平抑制 TNF-α诱导的MC增生.     

血红素加氧酶-1在大鼠肾小球系膜细胞增殖中的作用

目的系膜细胞增殖是多种肾疾病的共同表现,血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)可减轻多种疾病的肾损害,文中拟观察不同状态下大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)HO-1的表达,探讨其在系膜细胞增殖中的作用。方法大鼠系膜细胞分为对照组、蟾蜍灵刺激组、血小板衍化生长因子-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)刺激组、蟾蜍灵+PDGF-BB刺激组,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测各组细胞HO-1 mRNA的表达,采用Western blot技术检测细胞HO-1蛋白的表达。结果与对照组相比,PDGF-BB刺激组细胞HO-1 mRNA的表达明显减少(P<0.05),蟾蜍灵干预后可抑制PDGF-BB引起的系膜细胞HO-1 mRNA的表达下调(P<0.05),而蟾蜍灵对正常系膜细胞HO-1 mRNA的表达无影响(P<0.05)。Western blot结果显示各组细胞HO-1蛋白的表达与HO-1 mRNA的表达变化趋势一致。结论 PDGF-BB可能通过诱导大鼠系膜细胞HO-1的表达减少引起系膜细胞增殖,蟾蜍灵可抑制此作用,对系膜细胞损伤起保护作用。     

细胞周期调节负控蛋白P27在肾小球系膜细胞增殖中的调控作用

目的探讨lL-13,ET-1,甲基强的松龙及肝素钠对肾小球系膜细胞膜表达细胞周期负控p27的变化.方法不同浓度IL-13(10ng/ml,100ng/ml),ET-1(10-7mol/L),甲基强的松龙0.5μg/ml,肝素钠100mg/L和200mg/L,作用于培养的系膜细胞.流式细胞仪检测p27表达水平.结果IL-13 10 ng/ml组和100ng/ml浓度组p27表达为(46.74±3.25)和(23.8±2.56),与对照组比较有明显差异(P＜0.001,P＜0.05),两浓度组之间有显著差异(P＜0.01).ET-1刺激14h和18h后p27的表达分别为(14.76±1.49)和(12.18±1.30),与对照组比较均有明显差异(P＜0.05,P＜0.05).甲基强的松龙48h及72 h p27表达为(9.9±1.01)和(9.12±0.93),与对照组比较明显降低,P＜0.001.肝素钠100mg/L和200 mg/L浓度p27的表达分别为(26.94±1.23)和(28.04±0.99),较对照组明显升高(P＜0.05),不同浓度组间比较无明显差异.结论肾小球系膜细胞受不同因素作用后细胞周期调节负控蛋白p27表达水平不同.p27在调节系膜细胞增殖过程中起重要作用.     

反义细胞周期D1蛋白抑制肾小球系膜细胞增殖研究

目的探讨细胞周期蛋白（Ｃｙｃｌｉｎ）Ｄ１在肾小球系膜细胞增殖机制中的作用。方法应用免疫组织化学方法检测ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白在系膜细胞内表达;建立了表达ＣｙｃｌｉｎＤ１反义ＲＮＡ的逆转录病毒载体基因转移系统;利用ＭＴＴ法、流式细胞术对基因转录的系膜细胞的增殖状况进行观察。结果（１）体外培养的系膜细胞核内存在ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白;（２）外源基因经逆转录病毒载体高效转导系膜细胞,并高效表达反义ＲＮＡ;（３）反义ＣｙｃｌｉｎＤ１转导后的系膜细胞对内皮素１刺激的增殖反应不明显,而正常细胞（１８小时０２５９±００８０,６小时０１００±０００７）和空载体转导细胞（１８小时０２７８±００２０,６小时００９７±０００８）有显著效应（Ｐ＜００１）;（４）反义ＣｙｃｌｉｎＤ１抑制细胞从Ｇ１期进入Ｓ期。结论ＣｙｃｌｉｎＤ１是肾小球系膜细胞周期Ｇ１期进展的关键调控蛋白,反义ＣｙｃｌｉｎＤ１基因转导系膜细胞能明显抑制内皮素１的促增殖作用。     

p21在翼状胬肉中的表达

目的研究p21在翼状胬肉中的表达,探讨其与翼状胬肉临床病理特征的关系。方法采用免疫组织化学S-P法,检测p21在62例翼状胬肉和20例正常结膜中的表达情况,并分析其与翼状胬肉临床病理特征的关系。结果 62例翼状胬肉组织及20例正常结膜中p21的阳性表达率分别为40.3%(25/62)、70.0%(14/20),差异有统计学意义(P<0.05);p21的表达与临床分期、类型关系密切(P<0.05),与其他临床病理指标无关(均P>0.05)。结论 p21在翼状胬肉中呈低表达,其阳性表达率随临床分期、类型进展而降低。     

外源性Rb基因导入对U937细胞周期和p21基因表达的影响

目的 利用RLb基因重组腺病毒载体(AdCMV-RLb)，将外源性RLb基因导入U937细胞，研究其对细胞周期、细胞凋亡及原癌基因p21表达的影响。方法 AdCMV-Rb导入U937细胞后，用流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡率及Rb蛋白和p21蛋白的表达；RT-PCR检测原癌基因p21的表达。结果 AdCMV-Rb可以高效导入U937细胞，RLb基因导入使U937细胞主要阻滞在G1期，细胞凋亡率在RLb基因导入24h后无明显改变，48h后凋亡率增高；Rb蛋白和p21蛋白表达增强；RT-PCR结果显示Rb基因的导入可以上调p21基因的表达。结论 外源性Rb基因的导入可以上调原癌基因p21的表达，使得U937细胞周期阻滞在G1期。     

肾康注射液对肾小球系膜细胞增殖及自分泌FN的效应

目的：探讨肾康注射液（SKI）阻抑肾小球硬化（GS），防治慢性肾功能衰竭（CR）的部分作用机制，为SKI临床应用提供依据。方法：采用血清药理学实验法，观察SKI对体外培养人肾小球系膜细胞（GMC）增殖及其自分泌纤维连接蛋白（FN）水平的影响，结果：SKI及其含药血清对GMC增殖，自分泌FN有明显抑制作用（P＜0．01，P＜0．05），呈剂量或SKI血药浓度与效应依赖性；但随刺激时间延长，其作用存在差异，即对增殖的抑制效应：SKI呈递增趋势，而SKI含药血清则呈递减趋势，对FN水平的抑制效应则相反。结论：SKI经机体代谢，药理效应的不一致性，提示SKI含药血清可能出现提高FN降低解酶活性的新物质，或存在降解FN的某种活性成分。     

miR-519d靶向CDKN1A/p21调控宫颈癌细胞增殖的初步研究

目的探讨miR-519d对人宫颈癌细胞中CDKN1A/p21基因的靶向调控作用以及对细胞增殖、周期的影响。方法通过荧光定量PCR技术检测miR-519d抑制物对其活性的调控作用。在宫颈癌He La和Si Ha细胞中下调miR-519d表达,利用MTT法检测细胞增殖能力,通过流式细胞术检测细胞周期的分布情况。将miR-519d mimic转染He La和Si Ha细胞,用荧光定量PCR、Western Blot分别检测p21 m RNA和蛋白水平的表达。利用双荧光素酶报告基因系统确认miR-519d与p21的靶向关系。结果 miR-519d抑制物能有效下调宫颈癌He La和Si Ha细胞内miR-519d的表达。MTT实验和细胞周期分析结果提示,下调细胞内miR-519d的表达能够显著降低细胞增殖活力,并使细胞周期阻滞于G1期。进一步通过双荧光素酶报告基因系统鉴定miR-519d能够结合p21 m RNA3′UTR有效抑制其表达。q RT-PCR和Western blot检测结果表明,过表达miR-519d能在m RNA和蛋白水平上抑制p21的表达。结论 p21是miR-519d的直接靶基因,miR-519d可能通过靶向p21调控宫颈癌细胞增殖。     

抑癌蛋白p21和p53表达与胃癌细胞增殖的关系

为探讨抑癌蛋白ｐ２１和ｐ５３的表达与胃癌恶性生长的关系，选择８８例手术切除的胃癌和胃溃疡蜡块标本，用免疫组织化学方法检测上述标本中ｐ２１，ｐ５３和ＰＣＮＡ的表达。结果表明：胃癌组织中ｐ５３的突变蛋白表达率约为４０％，ｐ２１蛋白在胃粘液腺癌和低分化及未分化型腺癌表达明显低下，ＰＣＮＡ在胃腺癌中的表达水平高。提示胃癌细胞ｐ２１蛋白水平（低）和ｐ５３的突变与胃癌的发病有一定的关系，而与胃癌细胞恶性增长的关系不明显