新生大鼠肌源性干细胞的原代培养和鉴定

目的 探讨骨骼肌源性干细胞体外培养、鉴定的方法.方法 采用I型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离大鼠骨骼肌源性干细胞,经差速贴壁法纯化后,培养液中培养.倒置显微镜观察细胞形态,生长曲线分析肌源性干细胞的增殖能力,结蛋白细胞免疫荧光方法鉴定肌源性干细胞.结果 经过两步消化和差速贴壁后, 成功培养出高纯度的肌源性干细胞,细胞免疫荧光结果为desmin( ).结论 通过体外原代培养获得高纯度肌源性干细胞,结蛋白细胞免疫荧光可以对其早期鉴定,为组织工程的临床应用提供种子细胞.     

新生小鼠肌源性干细胞的生物学特性及表型研究

目的通过体外新生小鼠肌源性干细胞(MDSCs)的培养,观察鼠肌源干细胞的生物学特性及表型。方法采用胶原酶Ⅺ和胰蛋白酶分步消化肌肉,后采用差速贴壁分离技术纯化获得MDSCs。用倒置显微镜观察细胞形态,测定生长曲线,分析MDSCs的增殖能力,采用Sca-1、CD34和Desmin免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定,初步确定细胞表型。结果经过两步消化和差速贴壁后,成功培养出高纯度的肌源性干细胞,该细胞呈Sca-1、CD34和Desmin阳性。结论可通过体外原代培养获得高纯度的肌源性干细胞,细胞具有良好的增殖能力,是适用于组织工程和基因治疗研究的一种新型种子细胞。     

体外扩增大鼠肌源性干细胞的安全性研究

目的:研究经体外扩增的大鼠肌源性干细胞的安全性,为将来肌源性干细胞移植治疗压力性尿失禁的临床应用提供参考。方法:分离培养出大鼠肌源性干细胞,在体外传代培养,对传至第10代(PP6-10)的细胞进行刀豆球蛋白A(ConA)凝聚实验、双层软琼脂培养实验初步分析细胞表面结构和生长特性是否发生恶变;采用免疫细胞化学的方法检测PP6-10的端粒酶活性以及c-myc,p53,c-fos肿瘤相关基因的表达情况;采用裸鼠皮下致瘤实验观察其是否具备致瘤性。结果:体外培养至第10代以内的大鼠肌源性干细胞在培养瓶底分布均匀,贴壁后多为纺锤形或梭形,与原代培养的肌源性干细胞形态相比无明显改变;在不同浓度的ConA溶液中,PP6-10均未产生凝聚反应;将PP6-10置于双层软琼脂中培养12d,未见细胞克隆形成,培养至20d,细胞数量明显减少;通过免疫细胞化学方法检测PP6-10中的c-myc,p53和c-fos等肿瘤相关基因的表达结果均为阴性,PP6-10中的端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达结果呈弱阳性;将不同浓度的PP6-10接种于裸鼠皮下,观察4个月后接种部位没有肿块形成,病检其接种部位以及肝脏、肺脏均无异常表现。结论:大鼠肌源性干细胞体外培养至第10代后没有发生突变,不具备体内致瘤性,初步证实了体外传至第10代的大鼠肌源性干细胞的安全性。     

成年大鼠肌源性干细胞的培养和鉴定

目的探讨成年大鼠肌源性干细胞分离及纯化方法。方法采用消化法分离肌源性干细胞,然后用密度梯度离心法和差速贴壁法纯化干细胞;结蛋白(desmin)、CD34、CD45、Sca1免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定。结果成功培养出高纯度的肌源性干细胞,免疫细胞化学染色结果为desmin( ),CD34( ),CD45(-),Sca1( )。结论可通过体外原代培养获得高纯度肌源性干细胞,为组织工程的临床应用提供种子细胞。     

OECs无血清上清液体外诱导UB-MSCs向神经细胞分化

目的:观察大鼠嗅鞘细胞无血清上清液诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化的作用。方法:采用差速贴壁联合阿糖胞苷抑制法获得较高纯度的嗅鞘细胞,在最佳状态细胞无血清培养后取上清液。收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,采用差速贴壁法纯化间充质干细胞,传第三代后用上述收集的嗅鞘细胞无血清上清液诱导,观察诱导分化过程,免疫组化鉴定分化结果。结果:用差速贴壁和阿糖胞苷抑制法可获得纯度高达95%的嗅鞘细胞,使用无血清嗅鞘细胞上清液培养脐血间充质干细胞后,发现能诱导脐血间充质干细胞向神经细胞形态分化,胞体呈椭圆形,伸出长突起。诱导7天后相差显微镜下可观察到神经干细胞、神经元和胶质细胞形态的细胞,与NSE、GFAP细胞免疫组化结果一致。结论:大鼠嗅鞘细胞无血清上清液有明显诱导脐血间充质干细胞分化为神经细胞的作用。     

大鼠腓肠肌肌源细胞的培养与鉴定

目的寻求大鼠肌源细胞体外大量培养及鉴定的方法,为临床直接使用自体肌源细胞注射治疗肌组织损伤疾病奠定实验基础。方法利用胶原酶和胰蛋白酶消化3周龄大鼠腓肠肌,应用选择性培养基抑制非肌源细胞生长,采取改良的差速贴壁法纯化肌源细胞,通过形态观察、免疫组化及RT-PCR进行鉴定。结果使用F-10培养基获得了大量高纯度的大鼠肌源细胞;倒置显微镜下可观察到聚集成团和散在分布的两种形态的肌源细胞;免疫组化显示肌源细胞Desm in阳性率约90%,聚集成团的为CD34＋,大部分单个存在的为CD34-;RT-PCR显示传代细胞中均有Desm in基因的表达。结论此培养方法可在体外获得大量大鼠肌源细胞,有助于基因工程及组织工程等领域的研究。     

大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养生长和成肌特性

目的建立大鼠骨骼肌卫星细胞分离和纯化方法,并观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖和成肌特性。方法采用改良两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得高纯度的骨骼肌卫星细胞。免疫组化染色鉴定体外培养的骨骼肌卫星细胞;MTT法检测体外培养骨骼肌卫星细胞的生长情况;倒置显微镜观察不同培养条件下骨骼肌卫星细胞的分化特性。结果获取的骨骼肌卫星细胞纯度高,细胞中肌源性标志中间丝蛋白desm in呈强阳性表达。体外培养时,骨骼肌卫星细胞有1~2 d的潜伏期,5~6 d进入平台期。细胞汇合至60%~70%或降低培养基血清浓度时,开始相互融合形成肌管细胞。结论酶两步消化法和差速贴壁技术是一种简便易行、获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞的方法。骨骼肌卫星细胞体外培养时无需特殊诱导即可相互融合,形成具有骨骼肌收缩特性的肌管细胞。     

大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养生长和成肌特性

目的 建立大鼠骨骼肌卫星细胞分离和纯化方法,并观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖和成肌特性.方法 采用改良两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得高纯度的骨骼肌卫星细胞.免疫组化染色鉴定体外培养的骨骼肌卫星细胞;MIT法检测体外培养骨骼肌卫星细胞的生长情况;倒置显微镜观察不同培养条件下骨骼肌卫星细胞的分化特性.结果 获取的骨骼肌卫星细胞纯度高,细胞中肌源性标志中间丝蛋白desmin呈强阳性表达.体外培养时,骨骼肌卫星细胞有1～2 d的潜伏期,5～6 d进入平台期.细胞汇合至60%～70%或降低培养基血清浓度时,开始相互融合形成肌管细胞.结论 酶两步消化法和差速贴壁技术是一种简便易行、获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞的方法.骨骼肌卫星细胞体外培养时无需特殊诱导即可相互融合,形成具有骨骼肌收缩特性的肌管细胞.     

成年大鼠骨骼肌卫星细胞原代培养及鉴定

目的：探讨骨骼肌卫星细胞体外培养，鉴定的方法。方法：采用I型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离大鼠骨骼肌卫星细胞，经差速贴壁法纯化后，在培养液中进行培养，观察不同血清浓度下，卫星细胞生长融合的情况，倒置显微镜观察细胞形态，利用结蛋白免疫细胞化学染色方法鉴定肌卫星细胞。结果：细胞经过两步消化和差速贴壁后，纯度在90%以上，在生长培基中，细胞分裂增生；在融合培基中，细胞发生融合，形成肌管。结论：成年大鼠肌卫星细胞在不同的培养条件下可增生或分化，结蛋白免疫细胞化学染色可以早期鉴定骨骼肌卫星细胞。     

大鼠表皮基底层干细胞体外分离与培养

目的建立简单、可靠的大鼠表皮基底层干细胞体外分离培养方法。方法取新生大鼠背部皮肤,采用胰酶两步消化法获得单细胞悬液,Ⅳ型胶原差速贴壁法富集干细胞,将慢黏附细胞作为对照组细胞,均以角质形成细胞无血清培养基培养。以β1-整合素和角蛋白19(K19)双重荧光染色鉴定细胞表型,克隆形成实验检测细胞体外增殖能力。结果分离培养的细胞为多角形、呈铺路石样排列,倍增时间约为24h,细胞形态和生长规律符合基底层干细胞的特征。免疫荧光鉴定显示细胞共表达β1-整合素和K19,基底层干细胞克隆形成能力显著强于对照细胞。结论两步消化联合Ⅳ型胶原差速贴壁法获取基底层干细胞简易可行,培养的细胞活力好、表型可靠。     

体外诱导成体大鼠骨骼肌组织来源的干细胞向神经干细胞的转化

目的研究成体Sprague-Dawley(SD)大鼠骨骼肌来源的干细胞(MDSCs)体外诱导向神经干细胞(NSCs)分化的可行性。方法通过酶消化和连续贴壁的方法体外分离成年SD大鼠腓肠肌中的MDSCs。当传代至4-6代时,加入神经干细胞的特殊培养基Neurobasal-A和细胞因子进行诱导分化。用免疫细胞化学、Western blot以及realtime-PCR方法进行鉴定。结果MDSCs在神经干细胞特殊培养基中培养7~10 d后可形成类似神经球的细胞聚集物。运用免疫细胞化学、Western blot以及realtime-PCR检测发现MDSCs的标记蛋白结蛋白(desmin)表达下调,NSCs的特异性抗原神经巢蛋白(Nestin)开始表达。结论在神经干细胞的特殊培养基培养7~10 d后,MDSCs能够向神经干细胞转化。这种现象提示MDSCs有可能作为治疗神经系统疾病尤其是神经退行性疾病的一种新的干细胞来源。     

绿色荧光蛋白腺病毒表达载体在肌源性干细胞移植修复脊髓损伤实验中的应用

目的:观察绿色荧光蛋白腺病毒表达载体在肌源性干细胞移植修复脊髓损伤实验中的应用。方法:40只成年SD大鼠随机分为移植组(n=20)和对照组(n=20),均进行脊髓半切损伤。伤后9d,移植组于伤处移植体外转染GFP基因的大鼠MDSCs,而对照组仅注射等量PBS,于移植后1、2、3、4周用BBB评分方法测大鼠的运动功能,同时进行损伤脊髓取材、快速冰冻切片进行荧光显微镜观察。结果:移植后1周两组动物运动功能恢复无明显差异;移植后2、3、4周与对照组比较,移植组显著提高运动功能;荧光显微镜观察经绿色荧光蛋白基因标记的肌源性干细胞在损伤脊髓组织局部生长良好,并且有沿着脊髓神经束向头尾两侧迁移的趋势。结论:携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒表达载体的细胞标记方法是安全可靠、简便有效的生物示踪标记方法,可以用于标记细胞移植实验研究。     

bFGF转染自体骨骼肌卫星细胞对梗死心肌结构的影响

目的观察碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）转染自体骨骼肌干细胞缺血心肌内移植对心肌结构及骨骼肌卫星细胞转归的影响。方法取大白兔大腿肌，分离卫星细胞后培养、转染并用4’，6-二乙酰基-2-苯基吲哚（DAPI）标记。建立急性心肌梗死动物模型。将bFGF转染的卫星细胞注射在梗死灶周边心外膜下。4周后取出心脏，对缺血心肌结构及卫星细胞转归情况进行观察。结果移植的卫星细胞分化成为带有横纹的心肌样细胞；在卫星细胞移植区心肌细胞玻璃样变性较轻，肌纤维排列有序，微血管生长良好。结论bFGF转染自体骨骼肌卫星细胞在缺血心肌中可分化成心肌细胞样细胞，局部血液循环得到改善。     

肌源性干细胞治疗压力性尿失禁的实验研究

目的 探讨肌源性干细胞(muscle-derived stem cells,MDSCs)移植至压力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)大鼠近端尿道后体内形态、分布以及尿动力学变化,为压力性尿失禁的干细胞移植治疗提供理论基础.方法 采用坐骨神经离断法建立压力性尿失禁模型,改良差速贴壁技术分离MDSCs,pEGFP-N1转染作标记,注射至SUI大鼠近端尿道.尿动力学仪检测MDSCs移植后1、2周的漏尿点压力(leak point pressure,LPP)和最大膀胱容量.显微镜观察MDSCs移植后1、3、7、10、14 d荧光细胞的形态和分布.结果 MDSCs移植后第7、14天,SUI大鼠的LPP均显著提高,移植后2周LPP显著高于移植后1周.在MDSCs移植后第1、3天,细胞保持小圆形和短梭形,局限于注射部位;第7天,一部分移植的MDSCs开始分化,分布范围扩大;第10天,一部分MDSCs分化为平滑肌细胞,部分死亡;第14天,一部分细胞分化为肌纤维,而其余细胞发生变性、死亡.结论 MDSCs移植后能存活并分化而整合至尿道括约肌,尿道括约肌功能得到改善,提示MDSCs移植可能是治疗压力性尿失禁的有效方法.     

量子点免疫标记技术在肺癌组织芯片上的应用

目的:探讨新的标记试剂——量子点(QDs)在肺癌组织芯片上进行不同蛋白的检测并评价其效果。方法:在肺癌组织芯片上,利用QDs标记的链霉亲和素复合物(QDs-SA)能与生物素化二抗IgG结合的特点进行免疫荧光组织化学检测细胞角蛋白(CK)和增殖细胞核抗原(PCNA)的蛋白表达,评价蛋白的定位是否准确,并每隔1周在荧光显微镜下观察荧光信号的瘁灭情况。结果:观察到CK、PCNA蛋白分别定位于肺癌细胞的胞膜和胞核,定位准确,并且阳性信号呈现橙红色的光。直到4周后,才观察到荧光信号有明显的减弱。结论:QDs具有很好的耐光性,很宽的激发和发射光谱,荧光寿命也长。采用链霉亲合素修饰的QDs,能精确地检测肺癌组织芯片上不同蛋白的定位。     

骨骼肌干细胞移植抑制缺血心肌纤维化的实验研究

目的 观察自体骨骼肌干细胞移植于缺血心肌纤维化的抑制作用。方法 取12只成年犬臀大肌,分离卫星细胞,培养、传代、用4‘,6-二乙酰基－2－苯基吲哚（DAPI）标记卫星细胞;在已建立的犬急性心肌梗死动物模型基础上;将DAPI标记的卫星细胞,自左冠状动脉前降支灌入缺血心肌中。分别于2、4、8周后取出心脏,对缺血心肌的纤维化程度及植入的卫星细胞进行观察,并设对照组。结果 卫星细胞在缺血心肌中可分化成心肌细胞样细胞;在卫星细胞移植区域,心肌细胞的纤维化被有效抑制;对照组缺血心肌发生玻璃样变性,心肌细胞基本结构紊乱。结论 自体骨骼肌卫星细胞在缺血心肌中可分化成心肌细胞样细胞,并可抑制血心肌的纤维化;骨骼肌干细胞移植有望为心肌损伤提供一样新的治疗途径。     

兔骨骼肌干细胞向平滑肌细胞分化的实验研究

目的:探讨兔骨骼肌干细胞(MDSCs)分离、鉴定及诱导分化为平滑肌细胞的方法。方法:应用酶消化法消化兔骨骼肌组织,应用改良差速贴壁法获得MDSCs,并用免疫组化和免疫荧光鉴定,体外诱导骨骼肌干细胞向平滑肌细胞定向分化,镜下观察细胞生长情况;Real-time PCR和Western blot检测平滑肌细胞特异标记α-SMA和SM-MHC的表达情况。结果:骨骼肌干细胞具有良好的增殖能力和分化潜能,免疫细胞化学染色法和免疫细胞荧光法显示MDSCs呈结蛋白、干细胞抗原-1(Sca-1)和CD34阳性,CD45阴性,诱导后细胞排列形态呈漩涡状,Real-time PCR和Western blot结果提示α-SMA和SM-MHC表达增高。结论:骨骼肌干细胞经体外培养及诱导后,呈明显的平滑肌细胞特性,可作为输尿管组织工程新的种子细胞来源。     

自体骨骼肌星状细胞心肌成形的实验研究

目的 通过不同途径在心肌梗死的不同时期移植自体骨骼肌星状细胞,观察其移植后能否在心肌梗死区进一步增殖分化,形成心肌样横纹肌组织。方法 采用冠脉结扎与C形环冷冻相结合于犬左室游离壁做心肌梗死Ⅰ区,在其邻近位置单纯冷冻法做心肌梗死Ⅱ区。A组：在心肌梗死后立即将二咪基苯吲哚(DAH)标记的骨骼肌星状细胞悬液经冠状动脉及肌壁分别注射到自体犬的两个心肌梗死区。B组：在心肌梗死形成10～14.1后,二次开胸行自体骨骼肌星状细胞移植,方法同前。细胞移植后4周,取心脏标本行组织学检查结果冠脉结扎与半环形冷冻相结合及单纯冷冻法可成功制作小面积心肌梗死模型;冰冻切片荧光显微镜检查：组A心肌梗死Ⅰ区可见少量散在荧光,组B心肌梗死Ⅰ区未见荧光分布;两组实验动物心肌梗死Ⅱ区于注射部位均见线形荧光,但普通光学显微镜及透射电镜下均未见横纹肌组织。结论 用骨骼肌星状细胞移植替代受损坏死心肌尚不成熟,其临床应用有待进一步研究。