H2O2在戊四氮致痫模型中对海马神经元兴奋毒性的影响

目的 研究戊四氮致痫模型中,大鼠海马过量产生的H 2O 2对海马神经元兴奋毒性的影响.方法 SD雄性大鼠随机分为3组,每组14只.A组为生理盐水对照组,B组为戊四氮致痫组,C组为H 2O 2酶处理+戊四氮致痫组.动物造模后,观察各组大鼠癫痫发作情况;然后分别采用分光光度法测定大鼠海马H 2O 2含量,免疫组织化学法(SABC法)检测大鼠海马谷氨酸(Glu)免疫反应性,RT-PCR法检测大鼠海马Caspase-3 mRNA水平.结果 A组大鼠无明显癫痫发作,B组大鼠有癫痫大发作达Ⅴ级,C组大鼠癫痫发作为Ⅱ～Ⅲ级.B组大鼠海马H 2O 2含量、Glu免疫反应性、Caspase-3 mRNA表达水平均显著高于A组(均 P ＜0.05),C组海马H 2O 2、Glu免疫反应性、Caspase-3 mRNA表达水平均明显低于B组(均 P ＜0.05).结论 戊四氮诱发癫痫发作后,导致H 2O 2过量产生,其对海马神经元具有兴奋毒性作用.     

瘦素在海人酸诱导小鼠颞叶癫痫海马损伤中的作用

目的：探讨瘦素(Leptin)与颞叶癫痫发生、发展过程的关系。方法外源Leptin注射C57BL/6J小鼠后,右侧海马微量注射200 ng海人酸(kainic acid,KA)诱导颞叶癫痫,记录小鼠癫痫评分,1周后观察小鼠海马病理变化,包括Western blot检测Bax的表达水平,尼式染色(Nissl staining)观察海马Hilus区神经元丢失,免疫荧光检测Hilus区星形胶质细胞活化与增殖。结果在200 ng KA诱导的颞叶癫痫模型基础上,10 mg/kg外源Leptin预处理后,癫痫评分增加约52%,Bax表达水平升高约75%(P＜0.05),海马Hilus区神经元丢失严重,星形胶质细胞过度活化。结论 Leptin增加了KA诱导的神经元凋亡,加重KA诱导的神经病理过程。     

TSA对发育期大鼠癫痫后脑损伤的保护作用及其机制

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑素A(TSA)在癫痫后脑损伤发病中的作用及其机制。方法将32只雄性SD大鼠随机分为4组:对照组、海人酸(KA)组、小剂量TSA干预组(0.03 mg/kg)及大剂量TSA干预组(0.1 mg/kg)组,通过腹腔注射海人酸(KA)制作发育期大鼠癫痫模型,TSA于KA诱导癫痫前2 h腹腔注射给药,评估惊厥发作的等级及记录惊厥的潜伏期。癫痫后24 h处死大鼠,HE染色观察脑组织病理变化;TUNEL染色检测大鼠海马神经元细胞凋亡;CD68染色检测活化的小胶质细胞;Western blot检测IL-1β和TNF-α蛋白的表达。结果KA组均达到Ⅳ~V级惊厥发作,而TSA干预组能减轻惊厥发作的等级和延长惊厥的潜伏期。HE染色可见KA组明显的神经元凋亡及细胞水肿,伴有较多的炎症细胞浸润,而TSA干预组能减轻神经元凋亡及细胞水肿,同时减少炎症细胞浸润。与对照组比较,KA组神经元凋亡数、小胶质细胞活化数及炎症因子的表达均显著增加(P<0.05),而TSA能抑制KA诱导的改变。相对于0.03 mg/kg TSA干预组,0.1 mg/kg TSA干预组治疗作用更明显(P<0.05)。结论TSA能抑制癫痫后海马神经元凋亡、小胶质细胞活化及炎症因子的表达,同时能减轻惊厥发作的等级和延长惊厥的潜伏期,从而对癫痫后脑损伤起到保护作用。     

红藻氨酸致痫后大鼠海马神经元和星形胶质细胞的反应性变化

目的研究红藻氨酸(Kainic acid, KA)诱导大鼠癫痫发作后海马内神经元和星形胶质细胞的反应变化情况。方法立体定向大鼠侧脑室内注射KA引起大鼠癫痫发作,用抗即早反应基因Fos蛋白和抗神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫组织化学方法,分别观察痫性发作后在各时间点反应性神经元和星形胶质细胞在海马各区的分布情况。结果KA诱导大鼠癫痫发作后,海马内Fos阳性神经元和GFAP阳性星形胶质细胞明显增多。癫痫发作30 min后GFAP开始增多,1 h达高峰;1 h 后Fos阳性产物开始增多,2 h达高峰。结论海马内反应性的神经元和星形胶质细胞在癫痫发作后增加,反应性星形胶质细胞可能参与癫痫的发生及其调节。     

红藻氨酸致病后大鼠海马神经元和星形胶质细胞的反应性变化

目的 研究红藻氨酸(Kainieacid，KA)诱导大鼠癫痫发作后海马内神经元和星形胶质细胞的反应变化情况。方法 立体定向大鼠侧脑室内注射KA引起大鼠癫痫发作。用抗即早反应基因Fos蛋白和抗神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫组织化学方法，分别观察痫性发作后在各时间点反应性神经元和星形胶质细胞在海马各区的分布情况。结果 KA诱导大鼠癫痫发作后，海马内Fos阳性神经元和GFAP阳性星形胶质细胞明显增多。癫痫发作30min后GFAP开始增多，1h达高峰；1h后Fos阳性产物开始增多，2h达高峰。结论 海马内反应性的神经元和星形胶质细胞在癫痫发作后增加，反应性星形胶质细胞可能参与癫痫的发生及其调节。     

左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症海马NVU神经元的调控作用及其机制

目的探讨糖尿病并发抑郁症(DD)状态下谷氨酸(Glu)失衡对海马神经血管单元(neurovascular unit,NVU)中神经元GluR2、Beclin-1蛋白表达的影响,及左归降糖解郁方对其干预作用。方法原代分离、纯化和培养SD大鼠海马神经元、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞,构建海马NVU体外共培养体系,采用免疫细胞化学染色法进行细胞鉴定;采用高糖(150 mmol/L)联合皮质酮(200μmol/L)干预构建海马NVU细胞模型;将培养的细胞随机分组,未造模细胞分为正常组、空白血清对照组,造模细胞分为模型组、左归降糖解郁方(32. 82 g/kg)含药血清组和阳性药(氟西汀0. 18 g/kg+二甲双胍1. 8 mg/kg)含药血清组,除正常组与模型组给予等量培养液,其余组给予相应体积分数10%的含药血清或空白血清;采用酶联免疫吸附法检测各组海马NVU神经元培养液上清中Glu含量;采用免疫荧光染色与高内涵细胞成像分析技术(HCA)检测各组海马神经元内GluR2、Beclin-1蛋白表达情况;采用Tunel染色检测各组海马神经元凋亡情况。结果与正常组及空白血清对照组比较,模型组海马NVU培养液上清中Glu含量显著升高(P 0. 01),GluR2表达明显减少(P 0. 01),Beclin-1表达明显增加(P 0. 01),细胞凋亡明显增多;与模型组比较,阳性药含药血清组与左归降糖解郁方含药血清组Glu含量显著降低(P 0. 01),GluR2表达上调(P 0. 01),Beclin-1表达下调(P 0. 01或P 0. 05),细胞凋亡显著减少。结论左归降糖解郁方对海马NVU细胞模型中神经元GluR2、Beclin-1蛋白表达具有明显的调控作用,该作用可能与改善谷氨酸失衡有关,这可能是其抑制细胞自噬继而抗DD海马神经元凋亡的重要机制。     

海马内注射脂多糖导致痫性发作及其机制

目的 研究脂多糖海马内注射激活胶质细胞免疫反应引起大鼠痫性发作及海马硬化的作用机制。方法 随机将36只成年雄性Wistar大鼠分为脂多糖组(LPS组)、海人酸组(KA组)、生理盐水组(NS组)。立体定位在大鼠CA3区分别注射脂多糖5μg/μL、生理盐水、海人酸0.4μg/μL各1.5μL,记录大鼠的行为学、脑电图;行海马区HE染色观察神经元形态;采用免疫组化法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元型一氧化氮合酶(nNOS)的表达。结果 海马内注射NS后大鼠未见痫性发作,脑电图呈基本节律。注射LPS或KA后2h内大鼠出现不同程度的痫性发作和脑电图异常改变(尖波或棘波),KA组发作等级高于LPS组,部分LPS和KA组大鼠在给药后3～4周仍可见痫性发作。与NS组比较,LPS和KA组给药后急性期海马各区星形胶质细胞活化,神经元nNOS活性增高,慢性期星形胶质细胞增生,神经元数量减少,呈海马硬化表现。结论 海马内注射脂多糖可激活胶质细胞的固有免疫反应,并导致大鼠痫性发作和海马硬化。     

白藜芦醇对慢性癫痫大鼠脑组织中氨基酸类递质含量的影响

目的:测定慢性癫痫大鼠脑组织谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)含量,分析白藜芦醇抗癫痫作用机制。方法:动物分为生理盐水组(NS组)、癫痫组(KA组)、低剂量白藜芦醇组(L-Res组)和高剂量白藜芦醇组(H-Res组)。利用立体定位技术,在大鼠右侧海马CA3中心区注射海人草酸,建立癫痫大鼠模型,以高、低剂量白藜芦醇干预10 d,利用高效液相色谱法测定慢性癫痫大鼠海马和皮层Glu和GABA含量。结果:与NS组比较,KA组大鼠海马和皮层Glu含量、Glu/GABA比值均明显升高(P<0.05);与KA组比较,L-Res组大鼠海马Glu含量、Glu/GABA比值均明显降低(P<0.05),但皮层Glu含量、Glu/GABA比值却明显高于NS组(P<0.05);H-Res组大鼠海马和皮层Glu含量、Glu/GABA比值均明显高于NS组(P<0.05)。结论:白藜芦醇通过维持海马Glu/GABA平衡达到抗癫痫作用效果。     

降低海马NO含量对凋亡相关因子的调节作用

目的探讨降低海马NO含量对凋亡相关因子的调节作用。方法体内和体外实验均分为4组:生理盐水对照组(NS组),海人酸致痫组(KA组),氨基胍预处理+海人酸组(AG+KA组)和氨基胍组(AG组)。采用免疫细胞化学法显示体外培养的海马神经元在不同处理因素作用24h和48h后bcl-2、bax的免疫反应性。采用Western blot法或半定量RT-PCR法检测各组大鼠造模后24h、48h时bcl-2、bax蛋白及Apaf-1mRNA的表达情况。结果在体外实验中,KA组bcl-2的免疫反应较NS组减弱而bax的免疫反应增强;AG+KA组bcl-2的免疫反应较KA组增强而bax的免疫反应减弱;AG组与NS组相比无明显差异。体内实验中,Western blot检测显示大鼠海马组织中bcl-2和bax蛋白的表达水平呈负相关,其趋势与体外实验结果一致;半定量RT-PCR检测显示Apaf-1mRNA的含量在造模后24h和48h时间点,KA组明显高于NS组(P<0.05),而AG预处理则明显拮抗KA诱导的Apaf-1mRNA高表达。结论降低NO含量可以上调bcl-2蛋白的表达,下调bax和Apaf-1mRNA的表达。     

OX-42和Fos蛋白在海人酸致癫大鼠前脑中早期的表达变化

目的:研究大鼠在海人酸(KA)导致癫痫发作早期前脑内小胶质细胞的变化及其与神经元的关系.方法:应用免疫组织化学法单标分别显示前脑内OX-42和Fos蛋白表达的时间规律,并用免疫组织化学双重标记显示OX-42和Fos阳性细胞的相互关系.结果:在KA致大鼠癫痫发作早期(从15 min到360 min),前脑的小胶质细胞OX-42表达阳性,随着存活时间的变化,OX-42的阳性反应经历逐渐升高又降低的过程;反应强弱:120 min组>360 min组>60 min组>30 min组>15 min组.Fos蛋白在神经元和小胶质细胞中均表达阳性,也呈现逐渐升高又降低的变化,但Fos阳性小胶质细胞出现高峰的时间早于Fos阳性神经元,各组间Fos阳性神经元数量差异均有统计学意义(P<0.01).OX-42阳性小胶质细胞和Fos阳性神经元在前脑主要分布于大脑皮层、海马、杏仁核等部位,两者的分布特征基本一致.结论:小胶质细胞可能和神经元一起参与了KA所致癫痫发作早期的变化.     

刺五加多糖对氧化应激损伤的海马神经元iNOSmRNA表达的影响

目的研究刺五加多糖（Acanthopanacis senticosi polysaccharides，ASPS）对氧化应激损伤的海马神经元iNOSmRNA表达的影响，并探讨其可能机制。方法运用海马神经细胞原代培养技术，采用H2O2诱导建立细胞氧化损伤模型。观察细胞形态学变化MTT法测定细胞活性；化学比色法检测细胞匀浆液中一氧化氮（NO）的含量；RT-PCR法检测iNOSmRNA的表达。结果形态学观察显示：与模型组比较，ASPS组细胞损伤程度明显减轻，NO的含量和iNOSmRNA的表达显著降低，ASPS组细胞活性（0．46）比模型组细胞活性（0．36）高（P〈0．01）。结论ASPS能够下调iNOSmRNA的表达，并对海马神经元氧化损伤有保护作用。     

依达拉奉对谷氨酸诱导神经元释放一氧化氮的影响

目的探讨依达拉奉（Edaravone,Eda）对谷氨酸（Glutamate,Glu）诱导皮层神经元释放一氧化氮的影响。方法 SD乳鼠皮层神经元原代培养7d后,分对照组、Glu组（50μM）以及Glu（50μM）＋Eda（100μM）组,分别在加药前、加药6h和24h后取三组培养基以硝酸还原酶法检测NO浓度。结果加药前三组培养基的NO浓度没有显著差异（P〉0.05）,加药6h、24h后,Glu组和Glu＋Eda组NO浓度均显著高于对照组（P〈0.01）,而且Glu组NO浓度显著高于Glu＋Eda组（P〈0.01）。结论依达拉奉能降低谷氨酸诱导皮层神经元释放一氧化氮。     

白藜芦醇对高糖环境近端小管上皮细胞氧化应激的影响

目的白藜芦醇对高糖诱导的近端小管上皮细胞（proximal tubule epithelial cells,PTEC）氧化应激的影响。方法采用手工微分离法体外培养大鼠PTEC,行免疫细胞化学法鉴定细胞类型。将细胞分为正常对照组（NC）（DMEM培养基）、高糖组（25mmol/L）、白藜芦醇治疗组（高糖＋Res组）,化学比色法测定各组PTEC的一氧化氮（nitrogen monoxidum,NO）、过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）、还原型谷胱甘肽（reduced glutathione hormone,GSH）水平和过氧化氢酶（catalase,CAT）活性。结果高糖组NO和H2O2显著高于NC组（P〈0.01）;高糖＋Res组NO和H2O2与高糖组比较明显降低（P〈0.05）;高糖组CAT活性和GSH水平显著低于NC组（P〈0.05）;高糖＋Res组CAT活性和GSH水平较高糖组明显升高（P〈0.05）,与NC组比较无明显差异。结论白藜芦醇具有抑制氧化应激和增强抗氧化能力,来发挥对糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）的防治作用。     

Caffeic acid ester fraction from Erigeron breviscapus inhibits microglial activation and provides neuroprotection

Objective:To investigate the effects of caffeic acid ester fraction(Caf)from Erigeron breviscapus, mainly composed of dicaffeoylquinic acids(diCQAs),on microglial activation in vitro and focal cerebral ischemia in vivo.Methods:The production of nitric oxide(NO),tumor necrosis factorα(TNF-α),and interleukin-1β(IL-1β)induced by lipopolysaccharide(LPS)treatment in rat primary cultured microglia were measured by Griess reaction or enzyme-linked immunosorbent assay.Cell viability of cortical neurons was measured using AlamarBlue reagent.The behavioral tests and the infarct area of brain were used to evaluate the damage to central nervous system in rat middle cerebral artery occlusion(MCAO)model of cerebral ischemia.Real time polymerase chain reaction was used to determine the expression of inducible nitric oxide synthase(iNOS), TNF-αand IL-1βmRNA in ischemic cerebral tissues.Results:Caf inhibited the production of NO,TNF-αand IL-1βinduced by LPS treatment in primary microglia in a dose-dependent manner.Exposure of cortical neurons to conditioned medium from Caf-treated microglia increased neuronal cell viability(P<0.01)compared with conditioned medium from LPS-treated alone.In MCAO rat model of cerebral ischemia,Caf could significantly improve neurobehavioural performance and reduce percentage infarct volume compared with the vehicle group (P<0.05).Caf could also significantly inhibit the up-regulation of iNOS,TNF-α,and IL-1βgene expressions in ischemic cerebral tissues.Conclusion:Caf could suppress microglial activation,which may be one mechanism of its neuroprotective effect against ischemia.     

PGC-1α在海人酸(KA)诱导培养大鼠海马神经元氧化应激损伤中的作用

 目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子(peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator,PGC)-1α 在海人酸(kainic acid,KA)诱导的培养大鼠海马神经元氧化应激及神经损伤中的作用。方法 离体培养大鼠海马神经元,采用电穿孔基因转染技术分别转染PGC-1α shRNA质粒和空载体质粒。培养7 天后,用KA刺激上述海马神经元24 h,检测转染空载体质粒海马神经元(空白对照组,n=10)、KA刺激的转染PGC-1α shRNA质粒(实验组,n=11)和KA刺激的空载体质粒海马神经元(KA对照组,n=10)的谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量、超氧化物歧化酶(superoxidase dismutase,SOD)和乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)活性变化。FJB染色检测KA刺激24 h后实验组和KA对照组培养大鼠海马神经元神经损伤情况。结果 KA刺激24 h,培养的大鼠海马神经元GSH含量和SOD活性分别为(5.74±0.54) μmol·L-1·μg-1 protein和(10.57±1.25) U/mg protein,较空白对照组显著降低［(9.38±0.72) μmol·L-1·μg-1 protein,P<0.01;(23.12±3.23) U/mg protein,P<0.01］;LDH活性为(2.21±0.18) mmol NADH,H+/min/100 mg protein,较空白对照组海马神经元显著增高［(1.29±0.09) mmol NADH,H+/min/100 mg protein,P<0.01］。转染PGC-1α shRNA质粒组,KA刺激24 h海马神经元GSH含量和SOD活性分别为(3.37±0.42) μmol·L-1·μg-1 protein和(4.54±0.91) U/mg protein,较KA对照组海马神经元明显降低(P均<0.05);LDH活性为(2.74±0.19) mol/NADH+/min/mg protein,较KA对照组海马神经元显著增加(P<0.01)。FJB染色显示转染PGC 1α shRNA质粒组,KA刺激24h培养大鼠海马神经元损伤较KA对照组明显增加(P<0.05)。结论 PGC-1α基因下调加重KA刺激后培养大鼠海马神经元损伤,可能与其加重氧化应激损伤有关。     

一氧化氮在缺氧复氧所致神经细胞凋亡中的作用及银杏叶提取物的保护效应

为探讨银杏叶提取物对缺氧复氧神经细胞凋亡中一氧化氮 (NO)动态表达的作用 ,对大鼠大脑皮质神经细胞原代分离培养 ,用原位末端标记法 (TUNEL)及流式细胞术检测细胞凋亡 ,用荧光分光光度法检测细胞培养上清液中亚硝酸根含量的变化。结果 :缺氧复氧致胎鼠大脑皮质神经细胞凋亡中NO含量呈双时相增高 (单纯缺氧 2h及缺氧 18h复氧 18h) ,银杏叶提取物 (EGB)对此双时相的NO升高有抑制作用 ,氨基胍 (AG)可抑制缺氧 8h复氧 18h组的NO升高 ,对缺氧 2h组的NO升高无抑制作用。提示 :NO参与了缺氧复氧过程中神经细胞凋亡 ,银杏叶提取物对缺氧复氧神经细胞凋亡有保护作用 ,其作用可能是通过抑制NO而实现的。     

藏药八味沉香散对H_2O_2所致乳鼠心肌细胞氧化应激损伤的保护作用

目的探讨八味沉香散对过氧化氢（H2O2）所致乳鼠心肌细胞氧化应激损伤的保护作用。方法 SD乳鼠心肌细胞原代培养,H2O2诱导心肌细胞氧化应激损伤,用不同剂量藏药八味沉香散处理24 h后,测定培养液中乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、过氧化氢酶（CAT）的含量;同时检测培养液中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性。结果八味沉香散可明显减轻H2O2所致乳鼠心肌细胞培养液中LDH、CK和CAT的释放量,同时能够升高SOD、GSH-Px活性,降低MDA活性。结论八味沉香散对H2O2所致乳鼠心肌细胞氧化应激损伤有明显保护作用。     

逍遥散对模拟应激体外培养大鼠海马神经细胞内Ca2+水平的影响

目的 观测逍遥散对模拟应激体外培养大鼠海马神经细胞内Ca2+水平的影响.方法 体外培养海马神经细胞为研究对象,分为1.空白对照组、2.正常血清对照组、3.正常血清+Glu组、4.模型血清+Glu组、5.模型血清+Glu+MK801组、6.逍遥散治疗血清+Glu组、7.逍遥散治疗血清+Glu+MK801组,以MK-801为工具药,通过激光共聚焦显微镜技术对模拟慢性应激微环境下以及逍遥散治疗血清干预后大鼠海马神经细胞内Ca2+浓度进行检测.结果 与第1组(779.97±36.81)相比较,第2组(1092.38±36.41)、第3组(1472.49±76.19)、第4组(1509.52±104.69)、第5组(1186.97±41.92)组荧光强度均明显升高,差异有显著性(P＜0.01),第6组(908.74±40.24)也有所升高(P＜0.05);与第2组相比较,第3、4、6组荧光强度均明显升高,差异有显著性(P＜0.01),第7组(721.99±60.33)则明显降低,也差异有显著性(P＜0.01);与第4组相比较,第6,7组荧光强度均明显降低,差异有显著性(P＜0.01),第5组也有所降低(P＜0.05);与第6组相比较,第5组荧光强度均明显升高,第7组明显降低,均差异有显著性(P＜0.01).结论 逍遥散可能通过包括谷氨酸-N-甲基,D-天门冬氨酸受体-钙离子(Glu-NR-Ca2+)在内的多种细胞信号途径维持胞内钙稳态从而保护神经元免受兴奋性神经毒性的作用.     

锌对新生大鼠海马神经元bcl-2 mRNA表达的影响

目的：观察微量元素锌对新生大鼠海马神经元细胞凋亡抑制基因ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ表达的影响。探讨锌影响中枢神经系统发育的分子机制。方法;采用无血清培养Ｗｉｓｔａｒ新生儿大鼠海马神经元细胞,分别在无血清培养液中加入不同浓度的ＺｎＳＯ４溶液培养７ｄ,采用图像分析技术分析其生长分化情况;收集海马神经元细胞,利用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术检测海马神经元ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ表达情况。结果：锌可通过提高ｂｃｌ－２ｍＲＮ