草鱼呼肠孤病毒RT-LAMP检测方法的建立

根据草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的VP6基因序列设计一套RT-LAMP引物,以样品的cDNA为模板,在63℃恒温条件下进行扩增,扩增后加入SYBRGreenI染料染料,可通过肉眼直接观察到颜色变化来判定扩增结果。该方法操作简便,不需要特殊仪器,适用于水产养殖临床上对草鱼呼肠孤病毒的快速诊断。     

草鱼呼肠孤病毒RT—LAMP检测方法的建立

根据草鱼呼肠孤病毒（GCRV）的VP6基因序列设计一套RT—LAMP引物,以样品的cDNA为模板,在63℃恒温条件下进行扩增,扩增后加入SYBRGreenI染料染料,可通过肉眼直接观察到颜色变化来判定扩增结果。该方法操作简便,不需要特殊仪器,适用于水产养殖临床上对草鱼呼肠孤病毒的快速诊断。     

检测鸭呼肠孤病毒抗体间接ELISA方法的建立

RT—PCR扩增鸭呼肠孤病毒（Duckreovirus,DRV）的dB基因,克隆到pET-32a（＋）表达载体,再转化大肠杆菌Transetta（DE3）;含有重组质粒pET—σB的大肠杆菌经IPTG诱导,获得大小为55000的以包涵体形式表达的σB重组蛋白。Westernblotting显示,σB重组蛋白能够与兔抗DRV多抗血清特异性结合。以高亲和NI—NTA树脂在变性条件下纯化、梯度尿素复性的σB重组蛋白为包被抗原,建立了检测DRV抗体的间接ELSIA方法。分别以间接ELSIA方法和血清中和试验对DRV感染鸭血清和SPF鸭血清进行检测,两者的符合率为100％。该间接ELSIA方法对鸭瘟病毒、鸭病毒性肝炎病毒和禽流感病毒阳性血清均无交叉反应。     

抗A型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测方法的建立

为建立A型口蹄疫病毒(FMDV)病原学诊断方法,本研究应用纯化的A型FMDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得一株稳定分泌单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株5F7.经IFA特异性鉴定,5F7为一株血清型特异性MAb.亚类为IgG1/k.间接ELISA检测杂交瘤细胞上清和腹水抗体效价分别为1:12 800和1:105.硫氰酸盐洗脱法测定其相对亲和力常数为1.5 mol/L.应用该A型特异性MAb及实验室已制备的MAb 3D9初步建立了检测A型FMDV的抗原捕获ELISA方法.该方法可以检出2.0 ng纯化FMDV和1.0×104 TCID50病毒,与O型、Asial型FMDV及牛肠道病毒、牛呼肠孤病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,组内及组间重复性试验显示变异系数小于8％.本研究建立的抗原捕获ELISA方法为A型FMDV抗原检测提供了一种实用有效的技术手段.     

草鱼呼肠孤病毒生长特性研究

以草鱼呼肠孤病毒(GCRV)873毒株为试验材料,建立了GCRV荧光定量PCR检测方法;用GCRV873株感染CIK细胞及草鱼,通过对病毒RNA复制水平、子代病毒含量以及细胞病变等情况进行监测,研究其在CIK细胞及草鱼体内的生长特性。在CIK细胞中,GCRV感染后12 h即可检测到子代病毒,36 h时,所有细胞被感染;72 h时,病毒滴度达到最高,为10~(6.75) TCID_(50)/mL。在草鱼的肝、脾、肾中,均能检测到GCRV RNA,其中肾脏中含量最高,其次是肝脏,脾脏中最少。本试验为研究GCRV致病机理及制备细胞灭活疫苗奠定了试验基础。     

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体捕获ELISA方法的建立

以纯化的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)作为抗原免疫BALB/C系小鼠,通过细胞融合和克隆筛选出稳定分泌BVDV抗体的杂交瘤细胞株,将杂交瘤细胞接种于BALB/C系小鼠的腹腔内诱生腹水,腹水单抗与BVDV均呈阳性反应.将5A9、2G3和5C2(分别结合不同的抗原结合位点)诱生的BVDV单抗纯化后等量混合包被酶标板,与鸡抗BVDV IgY(检测抗体)联合应用,建立BVDV抗原捕捉ELISA(AC-ELISA)方法.采用方阵滴定法确定单抗、鸡抗BVDV IgY的最适工作浓度,用阴性组织样品作为判定检测结果的D490临界值,最后以建立的AC-ELISA检测临床粪样棉拭子27份,结果表明:该方法敏感性、特异性高,与全血病毒分离结果的符合率迭86.36%;与全血和粪样RT-PCR检测结果的符合率分别为89.47%和94.74%.阴性对照RT-PCR、病毒分离和AC-ELISA检测均为阴性.     

猪血凝性脑脊髓炎病毒抗原捕获ELISA诊断方法的建立

采用实验室保存的杂交瘤细胞,通过扩大培养、接种小鼠、收集腹水、腹水纯化等程序得到了猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)单克隆抗体,并对其效价进行了测定.用HEV单克隆抗体作为检测抗体,猪多抗作为捕获抗体,建立了检测HEV的抗原捕获ELISA方法,通过对各步反应条件的优化,最终获得最佳工作条件为:猪多抗1:2 000稀释,单抗1:4 000稀释,酶标抗体为1:4 000稀释.特异性和敏感性试验结果表明:该方法对TGEV、HCV、PEDV和PRV等病毒无特异性交叉反应,其最低检测下线为3.75 mg/L.与RT-PCR方法的对比试验证明,抗原捕获ELISA阳性检出结果与PCR方法相一致.上述结果说明,已成功建立特异、敏感的用于HEV检测的抗原捕获ELISA方法,为临床快速诊断HEV试剂盒的研制奠定了基础.     

流行性出血病病毒抗原捕获ELISA方法的建立

为建立流行性出血病病毒(EHDV)病原学检测方法,本试验用纯化处理的4种血清型病毒(EHDV-2、5、6和8)混合免疫兔和豚鼠,制备高免血清。以兔抗EHDV为捕获抗体,豚鼠抗EHDV为检测抗体,羊抗豚鼠IgG-HRP为酶标抗体,建立了EHDV抗原捕获ELISA(antigen capture ELISA,AC-ELISA)方法。通过反应条件优化,获得最佳工作条件:5%马血清为稀释液,包被抗体1∶15 000稀释,检测抗体1∶20 000稀释,酶标抗体1∶15 000稀释。通过检测60份阴性样品确定临界值,P/N值≥2为阳性、P/N值1.5为阴性;特异性试验表明该方法仅能检测出各血清型EHDV、蓝舌病病毒(BTV)、赤羽病病毒(AKAV)及中山病毒(CHUV)无交叉反应;敏感性试验表明该方法可以检出102.47±0.07 TCID50的病毒;批内和批间变异系数均10%;用RT-PCR与该方法同时对70份参考样品进行检测,符合率为92.86%。表明本试验建立的AC-ELISA方法为EHDV抗原检测提供了一种可靠实用的技术手段。     

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原捕获ELISA检测方法的建立

用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)单克隆抗体包被酶标板,以兔多克隆抗体作为夹心抗体,建立BVDV抗原捕获ELISA(AC-ELISA)检测方法,优化反应条件并对该方法的稳定性等指标进行了测试和评价。结果表明,单抗最佳包被质量浓度为5μg/mL,兔多抗血清最佳质量浓度为10μg/mL;单抗在4℃包被12~24 h,多抗在37℃作用1 h为双抗体的最佳反应条件;酶标抗体最适稀释度1∶10000,最适作用时间为1 h;采用1%BSA和1%明胶分别在抗体包被后和加入待检抗原反应后进行两次封闭效果好。用AC-ELISA方法检测临床采集的11份牛腹泻病料和12份健康牛组织样品,同时以病毒分离和RT-PCR检测方法做对比,3种方法符合率很高。研究表明AC-ELISA方法稳定性好,可用于BVDV的临床快速检测。     

ELISA检测禽呼肠孤病毒抗体方法的建立及应用

建立了一种检测禽呼肠孤病毒(ARV)抗体的敏感方法——ELISA法。用此法对某鸡场血清样品进行检测,琼扩检出阳性率为65%,ELISA检出阳性率为100%,ELISA方法明显比琼扩敏感。另外,用ELISA方法诊断出江苏某鸡场发生的鸡病毒性关节炎,并用ELISA法筛选出8株分泌ARVMcAb的杂交瘤细胞株。ELISA方法因其特异、敏感、可靠,将成为SPF鸡群,祖代鸡群净化ARV的有效检测手段。     

草鱼呼肠病毒研究进展

由草鱼呼肠病毒引起的草鱼出血病是一种高度传染性与致死性的病毒性疾病,该病的频繁暴发给我国草鱼养殖业及淡水养殖业造成了巨大的经济损失。论文就近年来对草鱼呼肠病毒在基因组序列及基因分型、流行病学、先天性免疫、检测方法、免疫防控等方面的研究进行综述,以期为草鱼呼肠病毒的研究提供借鉴和参考,为草鱼出血病预防和控制提供帮助。     

Inhibition of Grass Carp Reovirus Infection by DNA Aptamers against S10 Protein

Abstract

Grass Carp reovirus (GCRV) is one of the most pathogenic agents among aquareovirus isolates and has the ability to cause a severe epidemic outbreak of hemorrhagic disease, thus resulting in both a high mortality rate during the culture of Grass Carp Ctenopharyngodon idella and an enormous economic loss. Aptamers have been demonstrated to have strong promising applications in antiviral drug development. In the present study, a complementary DNA fragment encoding the S10 gene of GCRV was cloned. The S10 protein was expressed and purified. Aptamers for S10 protein were selected by the method of selective evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX), and their characteristics and antiviral actions were examined. All targeting-selected aptamers formed a similar structure, forming a 5–7 base loop at the terminus. The results show that the aptamers could inhibit the GCRV infection. The most significant inhibitory effect was obsereved when the aptamers were added to the cell culture for 1 h before the cells were infected by GCRV. Our data showed that these novel molecular agents could be considered suitable candidates for anti-GCRV therapy.

Received August 23, 2016; accepted February 5, 2017Published online April 5, 2017     

直接免疫荧光检测禽呼肠孤病毒方法的建立

本研究利用经纯化的原核表达禽呼肠孤病毒(ARV)结构蛋白σ3作为免疫抗原,免疫兔子三次,血清效价达到27时采血分离血清.用硫酸铵沉淀法浓缩纯化血清中的IgG,纯化的IgG用荧光素FITC加以标记.利用制备的荧光标记特异性抗体和对反应条件进行优化,建立了表达σ3蛋白荧光抗体检测ARV的诊断方法.结果经纯化获得特异性抗ARV结构蛋白σ3的荧光标记IgG抗体.用标记的抗体检测ARV病毒感染的单层细胞,出现特异性的荧光.用建立的σ3-FA方法检测接种疑似ARV感染的病料的鸡胚原代成纤维细胞,检出的阳性样品与病毒分离结果一致.表明本研究建立的σ3-FA方法检测ARV病毒有较好的特异性,可用于ARV感染的临床样品检测.     

禽呼肠病毒套式RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的禽呼肠病毒(ARV)基因组序列,设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为478 bp,内部引物的扩增片段大小为247 bp,建立了适合ARV快速检测的套式RT-PCR方法(RT-nested-PCR).采用该方法对REV毒株进行了检测,均能扩增到247 bp的条带,而禽流感病毒(H9亚型)...     

乳胶凝集试验检测番鸭呼肠孤病毒方法的建立

用纯化的抗番鸭呼肠孤病毒病抗体致敏乳胶成功地建立了检测番鸭呼肠呼病毒的方法。通过试验，确定了抗体致敏乳胶的最佳浓度1：10(0．4242mg/mL)，最佳致敏温度37℃，最佳致敏时间2个小时。人工攻毒雏番鸭30只，用所建立的方法检测粪便。结果表明，攻毒后的第3天粪便中即可检测到病毒，直至攻毒鸭全部死亡都可从粪便中检测到病毒抗原；同样攻毒1日龄雏番鸭30只，剖检取心、肝、脾按常规方法处理，用所建立的方法的检测。结果表明，首先是脾脏在攻毒后第4天3只中有2只检测结果阳性，第5天2只死亡鸭中有一只肝检测结果阳性，脾脏2只都呈阳性，此后的病死鸭脾和肝均为阳性，而心脏则未见有阳性。这对，临床上诊断与防治番鸭呼肠孤病毒感染具有重要的参考意义。     

番鸭呼肠病毒抗体间接ELISA方法的建立

用硫酸铵粗提的番鸭呼肠病毒作为包被抗原,成功地建立了检测番鸭呼肠病毒抗体的间接ELISA方法。结果表明,包被抗原作1∶80稀释,待检血清作1∶40稀释,酶标二抗作1∶200稀释,是最佳的工作浓度,而且该法特异性高,重复性好,质量稳定,敏感性强,结果可靠,是一种适合于流行病血清学调查的快速、敏感、准确、特异、重复性好的方法。     

番鸭呼肠孤病毒套式RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank上发表的鸭呼肠孤病毒基因组序列,利用生物学软件设计合成内外2对引物,建立了检测番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)的套式RT-PCR检测方法,并运用建立的检测方法对分离病毒与其他禽病病毒进行检测。结果显示,该方法能从MDRV中扩增到与预期大小相符的特异性目的片段,检测灵敏度达到0.1 pg病毒RNA,对禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)、鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)、番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)、鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)、鸭病毒性肝炎病毒(duck hepatitis virus,DHV)等病毒样品的扩增结果均为阴性。因此,本研究为番鸭呼肠孤病毒病的快速检测及诊断研究提供参考。     

Establishment of Indirect ELISA Detection Method for Porcine Epidemic Diarrhea Virus

Porcine epidemic diarrhea (PED) is an acute, highly contagious enteric disease of pigs. Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) is the causative agent of PED. PED has caused significant economic losses to the pig industry. In this study,the purified PEDV as the coating antigen, by optimizing the ELISA reaction conditions,the indirect ELISA antibody detection method was established. The optimized reaction conditions were as follows: Antigen working concentration was 20 μg/mL; Serum sample dilution was 1:500;It was coated at 4℃ overnight; The plates were blocked by 5% calf serum incubated at 37℃ for 1 h; The secondary antibody was diluted at 1:10 000,incubated at 37℃ for 1 h. It was judged as positive when the cutoff value D_{450 nm}≥0.289,as negative when D_{450 nm}≤0.236,and as suspicious between 0.289 and 0.236.It could not react with the positive sear of other six viruses such as porcine respiratory and reproductive syndrome virus,porcine circovirus 2, classical swine fever virus, porcine parvovirus,pseudo rabies virus and foot-and-mouth disease virus. The variation coefficient of repeated test was less than 10%.74 pig serum samples from Jiangsu, Jiangxi, Fujian and Guangdong were detected,and the positive rate was 84%.It indicated that this method could be used for PEDV epidemiological surveys and diagnosis in the future.     

抗猪肺炎支原体IgA间接ELISA检测方法的建立

为了更准确地对猪肺炎支原体感染及免疫状况进行检测,作者拟建立抗猪肺炎支原体IgA间接ELISA检测方法.在比较了猪肺炎支原体全菌抗原和粘附因子P97R1原核表达蛋白后,选择后者作为包被抗原;以羊抗猪IgA为二抗,兔抗猪IgG-HRP作为酶标三抗,并分别对包被抗原的浓度、样品的孵育时间、二抗与三抗的最佳稀释度和作用时间以及显色液的作用时间作了优化.最终建立了稳定而特异的抗猪肺炎支原体IgA的间接ELISA检测方法.批间与批内试验结果证明该方法具有很好的稳定性.初步应用表明,该方法可用于猪肺炎支原体感染或免疫状态的临床监测.