Ⅰ型鸭病毒性肝炎RT-PCR检测方法研究

根据Ⅰ型鸭病毒性肝炎ZJ/06强毒株的测序结果,在其基因组3D基因区设计合成一对可扩增238 bp的特异性引物,成功的建立了检测DHV-Ⅰ的RT-PCR方法,并确定了其特异性与敏感性,对DHV-Ⅰ分离毒株和临床病料进行RT-PCR检测均得到阳性扩增结果,而作为阴性对照的常见4种鸭病病原:鸭瘟病毒、鸭产蛋综合症病毒、鸭副粘病毒、鸭里默氏杆菌均未扩增到任何片断。利用BHK-21细胞、SPF鸡胚对DHV-Ⅰ临床病料进行病毒分离鉴定,结果表明建立的DHV-Ⅰ的RT-PCR检测方法具有快速、特异、敏感的特点。     

应用RT-PCR技术快速检测鸭Ⅰ型病毒性肝炎

根据Genbank收录的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)的VP1基因保守序列,设计合成特异性引物,建立了检测DHV-Ⅰ的RT-PCR方法,并确定了该方法的特异性与灵敏性;对DHV-Ⅰ分离毒株进行RT-PCR检测均得到阳性扩增结果,而作为阴性对照的常见4种鸭病病原如鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、番鸭呼肠孤病毒、鹅副粘病毒均未成功扩增;对DHV-Ⅰ临床病料进行RT-PCR检测,检测结果与病毒分离结果一致。结果表明,建立的DHV-Ⅰ的RT-PCR技术具有快速、特异、灵敏的特点。     

应用RT-PCR技术快速检测鸭I型病毒性肝炎

根据Genbank收录的I型鸭肝炎病毒(DHV-I)的VPI基因保守序列,设计合成特异性引物,建立了检测DHV-I的RT-PCR方法.并确定了该方法的特异性与灵敏性;对DHV-I分离毒株进行RT-PCR检测均得到阳性扩增结果.而作为阴性对照的常见4种鸭病病原如鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、番鸭呼肠孤病毒、鹅副粘病毒均未成功扩增;对DHV-I临床病料进行RT-PCR检测,检测结果与病毒分离结果一致.结果表明,建立的DHV-I的RT-PCR技术具有快速、特异、灵敏的特点.     

Ⅰ型鸭肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank发表的DHV I的基因序列,设计了1对针对DHV Ⅰ保守区的特异性引物.通过对反应条件的优化,建立了鸭病毒性肝炎病毒快速鉴别诊断的RT-PCR方法,扩增片段大小为632 bp.试验表明,RT-PCR法具有很强的特异性,且该方法的敏感性明显高于常规的检测方法.对鸭病毒性肝炎的病料检测证明,该方法能有效鉴别DHV,特异性良好.     

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT—PCR检测方法的建立

参考GenBank中Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒（DHV-I）的基因序列,应用Primer Premier5．0软件设计了一对引物,建立了适合DHV—I快速检测的RT—PCR检测方法。以该方法对实验室分离并保存的DHV强毒株Z10株的RNA为模板进行RT—PCR扩增,得到了预期大小为699bp的目的片段。将扩增所得的DNA片段进行克隆测序,测序结果与GenBank中的DHV-I的相应基因序列比对分析,同源性均达90％以上．表明为DHV—I的基因序列,对NDV,IBDV,DPV和GPV等常见病毒扩增结果为阴性。该方法敏感性检测结果表明．最低RNA模板检出量为24pg。表明所建立的RT—PCR检测技术具有特异、快速和敏感的特点,可用于Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒的快速诊断。     

鸭肝炎病毒Ⅰ型的RT-PCR诊断方法的建立

根据Genebank上发表的鸭肝炎病毒Ⅰ型（DHV-1）的部分序列设计了1对引物D1／D2,通过对反应条件的优化,建立起了有效的鸭肝炎病毒Ⅰ型的RT—PCR诊断方法。并应用此方法对近年在上海及周遍地区分离到的2株DHV-1分离毒进行了检测和测序鉴定,结果证实此株分离毒为DHV-1病毒。结果显示建立的DHV—1的PER诊断方法具有快速、准确的优点。     

鸭肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立与应用

根据鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus,DHV)3D基因序列,设计合成1对引物,通过优化RT-PCR反应条件,建立了DHV的RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,该引物仅特异性扩增出DHV 460 bp的特异性片段,而扩增鸭瘟病毒(DPV)、鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)和鹅副粘病毒(GPMV)的核酸扩增结果均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法能检测到100 pg的DHV核酸;对6份临床病料进行RT-PCR扩增,DHV的检出率为83.33%(5/6)。结果表明:该方法具有良好的特异性和敏感性,可对临床病料中的DHV进行快速检测。     

I型鸭肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank 发表的DHV I的基因序列,设计了1对针对DHV I保守区的特异性引物。通过对反应条件的优化,建立了鸭病毒性肝炎病毒快速鉴别诊断的RT-PCR方法,扩增片段大小为632 bp。试验表明,RT-PCR法具有很强的特异性,且该方法的敏感性明显高于常规的检测方法。对鸭病毒性肝炎的病料检测证明,该方法能有效鉴别DHV,特异性良好。     

鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒三重RT PCR检测方法的建立

为建立可同时鉴别检测鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的三重RT-PCR方法,根据基因库中鸭Ⅰ型肝炎病毒、番鸭细小病毒和鸭圆环病毒的基因序列,分别设计3对特异性引物,通过三重RT-PCR扩增条件优化、敏感性和特异性试验,建立了鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒三重RT-PCR方法。使用该方法对同一样品中的鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒模板进行扩增,结果均得到与试验设计相符的202bp(鸭Ⅰ型肝炎病毒),351bp(鸭圆环病毒)和474bp(番鸭细小病毒)的特异性扩增条带,对小鸭温病毒、鸭副粘病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性。敏感性试验结果表明,该方法最低能检测到1pg的鸭Ⅰ型肝炎病毒RNA、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒DNA。建立的鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒及番鸭细小病毒的三重RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒及番鸭细小病毒感染的检测。     

1型鸭肝炎病毒RT-PCR快速检测方法的建立

为建立快速检测临床1型鸭肝炎病毒(DHAV-1)感染的方法,根据DHAV-1的vp1基因序列设计1对引物,以DHAV-1及其他常见的感染鸭的病毒基因组为模板,建立了DHAV-1的特异性RT-PCR检测方法;以10倍梯度稀释的DHAV-1 RNA为模板,测定该方法的灵敏度;采集江苏多地的疑似DHAV-1感染病料,提取基因组进行RT-PCR扩增,产物经测序鉴定后判断所建立方法的检测率。结果显示,建立的方法可以特异性扩增DHAV-1 vp1基因保守区360 bp的序列,最低可检测1 fg基因组模板,对临床样品检测率为100%。表明,成功建立了特异性强、灵敏度高且可以用于临床快速诊断DHAV-1感染的方法。     

鸭I 型肝炎病毒一步法 RT-LAMP 可视化快速检测方法的建立

本研究根据GenBank中登录的鸭I型肝炎病毒( DHV I) VP1基因的高度保守序列,设计了特异性的引物,建立了一种灵敏、特异、高效的可视化体外环介导等温扩增方法( RT-LAMP)。结果表明,该方法的灵敏性可达到10 fg,是常规一步法RT-PCR方法的100倍以上。全部反应可以在1.0~1.5 h内完成,并可以直接通过肉眼观察颜色进行结果判定,该方法对其他鸭常见的病原体检测结果全部为阴性,该方法的建立为下一步研制鸭I型肝炎病毒的RT-LAMP快速检测试剂盒打下基础。     

马铃薯卷叶病毒的RT-PCR快速检测

根据马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物。从感染马铃薯卷叶病毒(PLRV)的马铃薯叶片中提取出病毒RNA,进行cDNA合成并运用RT-PCR技术进行体外扩增,得到一条长度约627bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致,而对照未得到任何产物。从而建立了快速灵敏的PLRV检测方法,为PLRV的防治及检测提供了有效手段。     

二温式PCR检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌方法的建立与应用

为了探索简便、快速确诊猪传染性胸膜肺炎的方法,根据猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)apx IV基因序列,设计合成1对特异性引物,建立聚合酶链反应(PCR)检测APP的方法。采用该方法对APP和其他6种猪病病原核酸进行检测,结果只对APP扩增出与预期大小相符的422bp DNA片段,而对其他6种猪病病原核酸的扩增结果为阴性。该PCR最低可检出10pg的APP DNA。对送检的46份可疑病猪组织进行检测,结果有19份样品为阳性,27份为其他病原感染。     

鸭病毒性肝炎的病理形态学观察

鸭病毒性肝炎的病鸭死亡后多呈角弓反张姿势．剖检以肝肿大、土黄色并有出血斑点为主要特征,且胆囊扩张．脾脏多呈灰白色．主要组织学病变为肝呈变质性肝炎,表现为肝弥漫性空泡变性、局灶性坏死和出血．脑水肿,包括脑小血管周围水肿,神经细胞水肿．脾脏发生坏死性脾炎．胰腺、心肌、骨骼肌等组织间质水肿及实质细胞水泡变性．胸腺、胰腺、法氏囊均有坏死灶．结果表明,鸭病毒性肝炎是雏鸭的一种急性败血症     

鸭源新城疫病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

【目的】建立鸭源新城疫病毒逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)快速检测方法,为鸭源新城疫病毒的快速诊断提供支持。【方法】选取鸭源新城疫病毒NP基因的相对保守区序列,利用Primer Explorer V4在线软件设计了3对RT-LAMP引物,以鸭源新城疫病毒SDFCH株RNA为模板进行RT-LAMP反应,通过对反应温度、时间及反应体系各组分浓度的筛选,优化反应体系和反应条件,然后对该方法的灵敏性和特异性进行检测(以RT-PCR方法为对照),并将其应用于临床病料检测。【结果】优化的RT-LAMP反应体系能够在63℃下1h内实现目标核酸区段的大量扩增,反应结果可直接用肉眼判断;建立的鸭源新城疫病毒RT-LAMP检测方法特异性较强,灵敏度较高,与其他病毒,如H9N2亚型禽流感病毒(AIV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、禽偏肺病毒(aMPV)、传染性支气管炎病毒(IBV)等的核酸无交叉反应,可检测到1×10-3稀释度的目标RNA(0.1pg/μL),较普通RT-PCR的灵敏性高10倍;利用建立的鸭源新城疫病毒RT-LAMP检测方法对24份疑似鸭源新城疫样品的阳性检出率为41.7%。【结论】建立的鸭源新城疫病毒的RT-LAMP检测方法,具有快速、准确、特异性强、灵敏度高的特点。     

鸭病毒性肝炎的流行病学调查和发病原因分析

本文通过1996年1月～1998年9月郑州地区296例鸭病毒性肝炎病例的分析,结合种鸭场、养鸭户的调查,对鸭病毒性肝炎的发病规律和发病原因进行了综合的分析研究。结果发现,郑州地区鸭病毒性肝炎发病日龄以5～15日龄最多,发病日龄在逐年增大;发病月份以5～6和9～11月最高,而且混合感染病例增加。在病因的调查中发现,除了种鸭免疫和母源抗体影响外,相当多的发病属于养殖户对传染病的认识不足而造成的。     

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测罗氏沼虾诺达病毒

用逆转录聚合酶链式反应方法,检测5尾来自广西某罗氏沼虾养殖场典型白肉病症状罗氏沼虾肌肉中的诺达病毒,结果是阳性5尾,占100%。该检测方法耗时短,特异性、实用性强,灵敏度高。     

种番鸭产蛋下降综合征病毒的分离及其PCR鉴定

从临床表现产蛋率下降、产蛋异常的种番鸭输卵管粘膜中分离到1株病毒,经血凝及血凝抑制试验鉴定为产蛋下降综合征病毒,命名为E05。参照GenBank上发表的鸭源产蛋下降综合征病毒基因组序列的保守区设计1对引物,通过PCR技术扩增出286 bp的基因片段,将扩增产物与T载体连接后,转化感受态细胞,筛选出阳性重组质粒进行测序分析。测序结果与GenBank上已发表的EDSV 100kD蛋白序列比对,扩增片段与已登陆的基因片段完全相符,同源性100%。     

一种应用LORF11同源子鉴别诊断鸭瘟病毒的PCR方法

为建立一种鉴别诊断鸭瘟病毒的PCR方法,根据已发表的8株鸭瘟病毒株的长区开放阅读框(LORF11)等位基因序列,在其开放阅读框等位基因的上游5 bp和下游101 bp的位置设计1对特异性引物。应用这对引物对鸭瘟病毒LH2011株、v2085株、VAC株、Clone-03株DNA进行PCR扩增,分别获得了4 448 bp、3 277bp、934 bp和2 518 bp的特异性条带。此PCR方法特异性强,敏感性高,可检测到10TCID50或0.1LD50的鸭瘟病毒。在感染鸭瘟病毒的组织(肝脏)中均能检测到鸭瘟病毒DNA。对疑似鸭瘟的临床病料的检测结果也证明,建立的PCR方法不仅能够鉴别样品是否感染了鸭瘟病毒,而且能鉴别感染的鸭瘟病毒的来源。