DLX1过表达对骨肉瘤细胞MG63迁移、侵袭、凋亡和增殖的影响

前期经基因芯片筛选发现,同源盒基因1(distal-less homeobox 1,DLX1)低表达是导致骨肉瘤形成的关键基因。该研究在此基础上,拟通过过表达DLX1探讨其对骨肉瘤细胞MG63迁移和侵袭等生物学特征的影响,并初步揭示其作用途径。采用含DLX1基因的重组腺病毒Ad DLX1(adenovirus distal-less homeobox 1)和空载腺病毒Ad RFP(adenovirus red fl uorescence protein)分别感染人骨肉瘤细胞MG63,观察细胞荧光表达情况,并用RT-PCR和Western blot验证DLX1表达水平;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力;DAPI染色和流式细胞术检测细胞凋亡水平;CCK-8检测细胞增殖能力;RT-PCR和Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin的表达。结果显示,与对照组(Ad RFP感染组)相比,Ad DLX1能显著增加MG63细胞中DLX1的表达,并导致细胞迁移和侵袭能力下降,但细胞增殖和凋亡情况无明显改变。DLX1过表达还可以上调Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin的表达。该研究表明,DLX1可通过Wnt/β-catenin信号通路抑制骨肉瘤细胞MG63的迁移和侵袭。     

白桦脂酸改善脓毒症大鼠心血管功能与AKT/mTOR及AKT/AMPK通路调控自噬有关

白桦脂酸(betulinic acid, BA)对脓毒症动物的诸多器官发挥保护作用。然而,白桦脂酸是否能改善脓毒症大鼠的心血管功能,其机制如何,尚不清楚。本研究给予雄性SD大鼠灌胃白桦脂酸(25 mg/kg/d, 5 d)预处理后,腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)(10 mg/kg)诱导脓毒症。腹腔注射LPS 6 h,对大鼠进行心功能超声检测,HE染色检测心肌组织形态,酶联免疫吸附法测定血清心肌损伤标志物(cTnI、CK-MB)和炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6),Western印迹测定心肌组织自噬相关蛋白质p62与LC3Ⅱ、AKT自噬通路相关蛋白质表达。结果发现,白桦脂酸预处理显著提高了脓毒症大鼠左心室射血分数和左室短轴缩短率(P<0.05),改善了心肌组织结构,也明显降低了血清cTnI、CK-MB、TNF-α、IL-1β和IL6水平(P<0.05);白桦脂酸明显减少了脓毒症大鼠心肌p62表达(P<0.01)并增加了LC3Ⅱ表达(P<0.001),显著下调了p-AKT (Thr308)、p-AMPKα (Ser485/...     

七氟醚、异氟醚对骨肉瘤MG63细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响

目的:观察不同浓度的七氟醚(Sev)、异氟醚(Iso)对骨肉瘤MG63细胞增殖、凋亡及对顺铂化疗敏感性的影响。方法:体外培养骨肉瘤MG63细胞。用噻唑蓝比色法(MTT法)检测不同浓度七氟醚和异氟醚对MG63细胞增殖的影响。平板克隆形成检测不同浓度七氟醚和异氟醚对MG63细胞克隆形成率的影响。流式细胞术检测细胞凋亡。结果:七氟醚、异氟醚对骨肉瘤MG63细胞增殖有一定抑制作用(P0.05),相对其它浓度5.1%Sev和2.6%Iso抑制作用更明显(P0.05)。七氟醚、异氟醚对骨肉瘤MG63细胞克隆形成有抑制作用(P0.05)。不同浓度Sev、Iso促进MG63凋亡作用不明显(P0.05)。2.5%Sev、2.0%Iso使骨肉瘤MG63细胞对顺铂诱导的凋亡率降低(P0.05)。结论:不同浓度的七氟醚、异氟醚可抑制骨肉瘤MG63细胞的增殖及克隆形成,高浓度的七氟醚、异氟醚对其增殖抑制作用更明显。七氟醚和异氟醚不促进骨肉瘤MG63细胞的凋亡,但可以降低其对顺铂化疗敏感性。     

圣草酚调控Akt/mTOR通路对胶质瘤细胞自噬的影响CSCD

为研究圣草酚对胶质瘤细胞自噬的影响,探讨其通过调控Akt/mTOR通路在胶质瘤自噬过程中的作用。本研究采用CCK8和细胞克隆形成实验检测圣草酚对胶质瘤细胞增殖的影响。构建GFP-mRFP-LC3B稳定表达的细胞株,圣草酚(100μmol/L)处理48 h,观察自噬小体的形成情况;然后分别用圣草酚(100μmol/L)、雷帕霉素(200 nmol/L)以及圣草酚(100μmol/L)+雷帕霉素(200 nmol/L)处理48 h后观察自噬流的情况。利用蛋白免疫印迹法检测圣草酚对自噬及Akt/mTOR通路相关蛋白表达水平的影响。建立裸鼠皮下移植瘤模型,观察圣草酚在体内对胶质瘤自噬过程的影响。实验结果显示,圣草酚能够显著抑制胶质瘤细胞的增殖,且呈时间—剂量依赖性(P<0.05)。圣草酚使胶质瘤细胞中绿色自噬小体明显增多,LC3Ⅱ、Beclin 1、ATG5蛋白表达上调。圣草酚处理GFP-mRFP-LC3B稳转细胞株48 h后呈亮黄色,且减弱了雷帕霉素对自噬流的促进作用,并上调P62蛋白的表达。此外,圣草酚可抑制p-Akt、p-mTOR的表达,但该作用被Akt激动剂740 Y-P逆转。体内实验结果同体外一致。说明圣草酚能够抑制胶质瘤细胞的增殖和自噬流,其影响自噬过程的作用机制可能与下调Akt/mTOR通路有关。     

甘草次酸抑制骨肉瘤细胞MG63增殖的NF-κB信号通路机制

目的:探讨甘草次酸抑制骨肉瘤细胞MG63增殖的机制。方法:实验应用骨肉瘤细胞MG63作为研究对象,分5组。空白组、甘草次数组(50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L)、阳性对照组。每组6个复孔。空白组为不含有甘草次酸的DMEM的培养基,甘草次酸组分别加入50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L的甘草次酸,阳性对照组加入白藜芦醇(40μmol/L)。将细胞接种于培养瓶内,当细胞进入生长平台期后使用0.1%的胰酶消化并按1×106cells/ml的密度接种于96孔板中,继续培养24 h。采用甲基四氮唑蓝检测细胞的增长率,Annexin V/PI双标记流式细胞术检测骨肉瘤细胞MG63的凋亡,蛋白质印迹法检测NF-κB蛋白的表达。结果:与空白对照组相比,甘草次酸孵育24 h后,各组的骨肉瘤细胞G63增殖率明显降低(P<0.05)、凋亡细胞比例明显升高(P<0.05);甘草次酸孵育48 h后,骨肉瘤细胞G63增殖率和NF-κB蛋白的相对表达量均明显降低(P<0.05)、凋亡细胞比例明显升高(P<0.05)。与阳性对照组比较,甘草次酸孵育2...     

PI3K/AKT/mTOR信号通路在骨肉瘤中的作用

骨肉瘤是儿童和青少年最常见的非血液病性骨恶性肿瘤.在骨肉瘤的发生机制中,PI3K/AKT/mTOR信号通路可通过调控细胞周期进程、抑制细胞凋亡、促进血管形成,进而参与骨肉瘤的增殖、侵袭和转移.在骨肉瘤组织和细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路常被异常激活,促进了骨肉瘤的快速发展.本文就PI3K/AKT/mTOR信号...     

小檗碱通过PI3K/AKT信号通路调控人牙周膜干细胞的增殖和成骨分化

该文旨在探讨小檗碱(berberine)对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)增殖和成骨分化的影响及潜在的机制。体外培养hPDLSCs,将其分为空白对照(Con)组、PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002(LY)组、小檗碱(Ber)组和小檗碱+PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002(Ber+LY)组,采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测h PDLSCs的增殖活力,流式细胞仪检测细胞周期分布,酶联免疫检测仪检测碱性磷酸酶(ALP)活性,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、骨钙蛋白(OCN)、骨膜蛋白(POSTN)和骨桥蛋白(OPN)的表达情况,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PCNA、Cyclin D1、OCN、POSTN、OPN和PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达情况。与Con组相比,Ber组h PDLSCs增殖活力,ALP的活性,S期和G₂/M期细胞比例,PCNA、Cyclin D1、OCN、POSTN、OPN、p-PI3K和p-AKT的表达水平均显著升...     

mTORC1信号通路调控细胞自噬的研究进展

蛋白激酶mTORC1主要感应细胞内的营养状态和细胞外的压力刺激,通过磷酸化众多下游底物蛋白,参与调控细胞的生长、增殖和代谢等过程.近年来的研究表明, m TORC1信号通路在细胞内的重要分解代谢过程——细胞自噬的调控中发挥主导作用.在细胞自噬过程的不同阶段发挥作用的多个蛋白陆续被鉴定为mTORC1的直接磷酸化底物,表明mTORC1在细胞自噬过程的不同阶段均发挥调控作用.以上作用机制让mTORC1精确而全面地控制细胞自噬的起始、终止和强度,进而帮助细胞更好地应对细胞内外环境的改变.本文将围绕mTORC1信号通路在细胞自噬调控中的主导作用综述近年来的相关研究进展.     

FoxO调控细胞增殖、分化与凋亡

与细胞发育和代谢相关的转录因子中,2000年才正式发布并统一命名的Fox家族受到了研究者的高度重视,其广泛存在于从酵母到哺乳类的真核生物中.FoxO转录因子作为Fox家族主要成员,是INS/IGF-1信号通路中的关键因子,通过转录调控和信号转导途径在动物的生理调节、代谢和细胞周期等方面起重要作用.     

BMP9经Smad信号通路调控iSCAP成骨/成牙本质分化

目的：研究BMP9是否能够激活 iSCAP细胞中的Smad信号通路,以及Smad信号通路在BMP9诱导iSCAP细胞成骨/成牙本质向分化过程中的作用。方法：首先,采用Western印迹实验检测Ad-BMP9转染iSCAP后Smad1/5/8蛋白的磷酸化水平。随后,利用dnALK1重组腺病毒和BMP9条件培养基作用于iSCAP,Western印迹实验检测Smad1/5/8蛋白磷酸化水平;采用碱性磷酸酶（ALP）活性检测和染色方法分析早期成骨/成牙本质指标变化,茜素红染色法检测钙盐沉积程度;RT-PCR成骨/成牙本质相关基因Runx2、OCN、OPN和DMP1表达的影响。结果：BMP9可上调iSCAP中Smad1/5/8的磷酸化水平;dnALK1抑制BMP9条件培养基作用后,可抑制Smad1/5/8的磷酸化,iSCAP细胞中早期成骨/成牙本质标志物ALP活性和晚期成骨/成牙本质标志钙盐结节减少,重要成骨转录因子Runx2基因表达减少,成骨/成牙本质相关基因OCN、OPN、DMP1的表达也受到了抑制。结论：Smad信号通路在BMP9诱导iSCAP成骨/成牙本质过程中存在并起着重要作用。     

miR-133a mimics对骨肉瘤细胞系MG63增殖和凋亡作用的影响

目的:研究采用miR-133a mimics瞬时转染骨肉瘤细胞系MG63对其细胞增殖和凋亡作用的影响.方法:采用miR-133a mimics瞬时转染骨肉瘤细胞系MG63,以miR-negative control(NC)mimics作为阴性对照.通过RT-PCR法检测miR-133a在转录水平的表达,CCK法检测其对增殖的影响,采用流式细胞仪检测miR-133a mimics对MG63细胞凋亡作用的影响.利用生物信息学方法预测miR-133a的靶基因,并对其靶基因进行基因功能分析.结果:(1)miR-133a mimics成功转染MG63细胞,并经RT-PCR检测可有效表达.(2)转染48h后,miR-133a mimics组与miR-NC mimics组比较,增值活性明显降低(P＜0.01).(3)miR-133amimics组与miR-NC mimics组和正常细胞相比,其凋亡率显著上升(P＜0.01).(4)生物信息学方法预测miR-133a的靶基因,部分发挥抑制细胞增殖和凋亡的作用.结论:miR-133a对人骨肉瘤细胞MG63的增殖和凋亡能力可能存在调控作用,可能成为骨肉瘤治疗的潜在候选靶点.     

MT1过表达可通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路影响SKOV3细胞的增殖与凋亡

卵巢癌是一种常见的威胁女性健康的恶性肿瘤。然而卵巢癌的发生机制尚不清楚。该研究旨在探讨褪黑激素受体MT1在人卵巢癌SKOV3细胞中的作用及其主要机制。采用MT1-pcDNA3.1质粒(MT1组)与空载体pcDNA3.1(对照组)转染SKOV3细胞,未转染SKOV3细胞作为阴性对照组。转染48 h后,新鲜培养基培养24 h或48 h,观察细胞周期、增殖、凋亡情况,上清液检测褪黑激素表达。此外,在血清缺乏培养基培养细胞并转48 h后,更换新鲜培养基并加入4 μmol/L PF-04691502抑制剂孵化24 h。测定AKT蛋白水平、总mTOR蛋白水平和相应磷酸化蛋白水平。结果显示,与NC组相比,MT1组在细胞周期S期阻滞(P0.05),伴随增殖减少和早期凋亡(P0.05)。3组细胞上清液检测到褪黑激素分泌均随时间增加(P0.05)。Western blot分析显示,MT1过表达抑制了PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活。该研究得出,SKOV3细胞有自行分泌褪黑激素的能力。MT1过表达可与内源性褪黑激素结合,抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活,最终发挥抗癌作用。     

氧化低密度脂蛋白经AMPK/mTOR信号通路诱导HUVECs自噬

氧化低密度脂蛋白（oxygenized low density lipoprotein, ox-LDL）诱导人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）损伤有助于动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）的发展。但ox-LDL对HUVECs自噬的影响及机制尚不清楚。为探究其机制,采用体外培养HUVECs,建立ox-LDL损伤模型。透射电子显微镜观察HUVECs中自噬体的变化;Western印迹法检测p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR及Beclin1、LC3-II、P62的表达。结果显示,与对照组比较,透射电子显微镜下观察到ox-LDL组的自噬体明显增多。Western印迹结果显示,与对照组比较,ox-LDL组Beclin1(0.81±0.04 vs. 1.83±0.11,P＜0.01)、LC3-II(0.80±0.06 vs. 1.61±0.06, P＜0.01)和P62(0.65±0.10 vs. 1.64±0.17, P＜0.01)表达显著增高。ox-LDL和BafilomycinA1共同干预组Beclin-1(3.15±0.15 vs. 3.17±0.13, P>0.05)、LC3-II(2.95±0.12 vs. 2.96±0.12, P >0.05)和P62(3.26±0.15 vs. 3.19±0.15, P>0.05)表达与BafilomycinA1组无显著差异,ox-LDL未使自噬起始增加,可能是降解受损导致自噬体的积累。与对照组比较,ox-LDL增加p-AMPK (0.47±0.03 vs. 0.96±0.03, P＜0.01)表达,并降低p-mTOR(0.86±0.04 vs. 0.25±0.05, P＜0.01)表达。单独阻断mTOR时, Beclin-1(0.81±0.05 vs. 2.19±0.17, P＜0.01)、LC3-II(0.76±0.13 vs 2.00±0.05, P＜0.01)和P62(0.74±0.12 vs. 1.94±0.11, P＜0.01)表达显著增加。亮氨酸（Leucine）可增加p-mTOR(0.87±0.11 vs. 1.67±0.07, P＜0.01)表达,并降低Beclin-1(0.81±0.05 vs. 0.37±0.03, P＜0.01)、LC3-II（0.76±0.13 vs. 0.41±0.02, P＜0.01）和P62（0.76±0.10 vs. 0.44±0.04, P＜0.01）表达,但ox-LDL可使Leucine预处理后的p-mTOR（1.67±0.11 vs. 0.82±0.02, P＜0.01）表达显著降低,并且Beclin-1（0.37±0.03 vs. 0.78±0.04, P＜0.01）、LC3-II（0.41±0.02 vs. 0.78±0.02, P＜0.01）和P62（0.44±0.04 vs. 0.74±0.04, P＜0.01）表达显著增加。说明mTOR参与ox-LDL诱导的自噬。与ox-LDL组相比,ox-LDL和Si-AMPK共同处理组p-mTOR(0.25±0.05 vs. 0.46±0.03, P＜0.01)表达增加以及Beclin-1(1.97±0.04 vs. 1.26±0.12, P＜0.01)、LC3-II(1.42±0.10 vs. 0.95±0.05, P＜0.01)和P62(1.58±0.09 vs. 0.98±0.11, P＜0.01)表达降低。以上结果表明,ox-LDL通过AMPK/mTOR途径诱导HUVECs发生自噬,并且导致自噬体的积累。     

miR-21通过PTEN/PI3K/AKT信号通路调控胶质瘤细胞的增殖

探讨miR-21对胶质瘤细胞U87中人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因/磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PTEN/PI3K/AKT)信号通路相关影响作用研究。脂质体Lipofectamine~(TM)2000将miR-21 inhibitor和miR-21 NC转入U87细胞中,48 h后,RT-PCR检测miR-21表达,MTT法检测细胞活力,Annexin V/PI流式双染检测细胞凋亡情况,Western blotting检测PTEN/PI3K/AKT激活情况及程序性细胞死亡因子4(PDCD4),Bax及Bcl-2的表达。与miR-21 NC组比较,miR-21 inhibitor组miR-21表达量显著降低,U87细胞活力下降,细胞凋亡率提高,PI3K、Bcl-2及p-AKT表达量下调,PTEN、PDCD4及Bax表达量上调,差异均具有统计学意义(p0.01)。miR-21inhibitor能显著的抑制U87细胞的增殖,与PTEN/PI3K/AKT信号通路有关。     

miR-29家族通过AKT/mTOR信号通路抑制结肠癌MC38细胞的增殖、迁移和侵袭

结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,死亡人数仅次于肺癌。有研究发现miR-29家族成员(miR-29a、miR-29b和miR-29c)在结肠癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织,但其对结肠癌的影响不明。为探讨miR-29家族对结肠癌的影响及作用机制,该研究在结肠癌细胞系MC38中分别转染miR-29a/b/c-3p mimics,利用qRT-PCR、CCK-8、EdU染色等实验确定miR-29家族成员可以显著降低MC38细胞的增殖能力(P<0.05);通过划痕实验和Transwell侵袭实验,明确miR-29家族成员可显著抑制MC38细胞的迁移和侵袭(P<0.05);最后利用信号通路活性分析、双荧光素酶报告分析等确定miR-29家族成员能够抑制AKT/mTOR信号通路的活性,并且与束蛋白结合蛋白1(Fascin actin-bundling protein 1,FSCN1)存在相互作用。上述结果表明,miR-29家族成员能够抑制AKT/mTOR信号通路活性,进而降低结肠癌细胞MC38增殖、迁移和侵袭的能力。     

PI3K/Akt/mTOR信号通路与自噬及肿瘤的关系

自噬是一种以胞质内出现双层膜结构包裹长寿命蛋白和细胞器的自噬体为特征的细胞“自我消化”过程,在维持细胞内稳态、发育、肿瘤发生和感染中发挥重要作用。近来,诸多研究表明,自噬作为一把“双刃剑”,对肿瘤的发生发展既有促进作用,也有抑制作用。PI3K/Akt/mTOR通路由PI3激酶(PI3K)、蛋白激酶B（PKB/Akt）和哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白（mTOR）3个作用分子组成,是一个中心的调节机构,对肿瘤细胞的生长与增殖有促进作用,同时对自噬进行抑制。本文就PI3K/Akt/mTOR通路与自噬及肿瘤发生发展的关系作一综述。     

miRNA靶向mTOR相关信号通路对肿瘤的影响

miRNA是一类含有22个nt左右的内源性短小非编码RNA,可作用于mRNA使之降解或者抑制翻译来调节靶基因的表达。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammals target of rapamycin,mTOR)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,近年来有研究表明mTOR集成了多个信号通路控制着有机体的生长和体内平衡。目前,大量研究表明miRNA能靶向mTOR相关信号通路对肿瘤产生影响。因此,本文主要探讨m TOR相关信号通路与肿瘤的关系,综述miRNA靶向m TOR相关信号通路对肿瘤的影响,旨在为肿瘤的靶向性治疗提供更好的理论依据。     

绿原酸对人骨肉瘤MG63细胞生物学行为的影响

目的:探讨绿原酸对人骨肉瘤MG63细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响。方法:采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖,细胞侵袭实验(Transwell)及细胞划痕实验检测细胞侵袭性及迁移性,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞干性基因及凋亡相关基因,凋亡试剂盒检测细胞凋亡比例。结果:在100μg/mL绿原酸干预的实验组中MG63细胞增殖减慢,细胞干性基因较对照组表达降低,侵袭性及迁移性经绿原酸处理后也相应降低,抗凋亡基因Bcl-2表达下降,细胞凋亡比例增加。结论:绿原酸对MG63人骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、迁移具有抑制作用并促进MG63细胞的凋亡,有望成为治疗骨肉瘤的有效药物。     

mTOR信号通路在iPS定向分化RPE细胞中的调控机制研究

目的：探讨mTOR信号通路在iPS定向分化RPE细胞中的调控机制。方法培养iPS细胞,悬浮培养后形成拟胚体EB,诱导分化为RPE细胞。通过免疫细胞化学的方法,观察iPS-RPE细胞分化一个月后特异性蛋白（RPE65、LRAT、zo-1）的表达。同时通过Q-PCR,Western Blotting的方法检测iPS-RPE在不同分化时间点（分化1个月、2个月、3个月）上,iPS-RPE细胞中特异性基因、蛋白的表达变化以及mTOR信号通路的活性。最后应用雷帕霉素抑制iPS-RPE细胞中mTOR的通路,进一步观察iPS-RPE细胞中的蛋白表达变化。Q-PCR采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行组间比较。结果荧光显微镜观察到iPS-RPE细胞在分化1个月时,表达RPE65、LRAT、zo-1蛋白。与对照组iPS比较,Q-PCR结果显示,实验组RPE65在分化1个月,2个月,3个月时的表达量分别为0.84±0.13,4.8±1.1,20.3±4.9（P=0.000）;Best1分化1个月,2个月,3个月时的表达量分别为1.5±0.16,2.3±0.68,11.78±1.57（P=0.000）;MerTK在分化1个月,2个月,3个月时的表达量分别为4.12±1.94,1.87±0.76,15.53±1.33（P=0.000）,CK18分化1个月,2个月,3个月时的表达量分别为2.4±0.63,2.3±0.37,9.67±1.44（P=0.000）,Western Blotting结果也表明,随着分化时间延长,iPS-RPE细胞中特异性蛋白（BEST1、catenin、MerTK）表达量有显著提高,而mTOR信号通路的活性受到抑制。与对照组（加DMSO）比较,雷帕霉素处理获得的iPS-RPE细胞中BEST1、MerTK、ck18蛋白表达量上升不是很明显,catenin蛋白显著提高。结论建立了体外高等分化、功能高效的iPS-RPE细胞,随iPS-RPE细胞分化时间延长,mTOR信号通路的活性是逐步抑制的。