利用胶体金免疫层析技术快速定量检测单增李斯特菌方法的建立

〔目的〕建立胶体金免疫层析技术快速定量检测单增李斯特菌方法。〔方法〕利用胶体金标记和双抗体夹心免疫层析技术,建立单增李斯特菌的快速检测方法,评价其特异性和敏感性,并拟合标准曲线进行定量检测;在牛奶、橙汁、果冻等即食食品样品中添加单增李斯特菌模拟污染样品,评价该方法对半固体、液体等即食食品、可疑生物恐怖样品的检测能力。〔结果〕该法可在10min内完成定性和半定量检测,定量检测灵敏度为3.5×103cfu/ml,线性范围3.5×105～3.5×108cfu/ml,回收率在99%～101.7%之间。〔结论〕建立的检测单增李斯特菌的胶体金免疫层析方法,能快速、灵敏、特异、准确地对样品中的单增李斯特菌进行定性、定量检测。     

应用PCR技术快速检测市售猪肉中产单核李斯特菌

目的：调查安徽省产单核李斯特菌对动物性食品的污染状况。方法：采集合肥农贸市场生猪肉样品，通过李斯特菌富集培养基培养16h，应用PCR技术进行产单核李斯特菌的检测。结果：从120份猪肉样品中分离出2株产单核李斯特菌，阳性检出率为1．7％。结论：表明安徽省市售猪肉中有不同程度产单核李斯特菌的污染，且存在李斯特菌病的可能性。整个检测过程只需24h，显示PCR技术对产单核李斯特菌的检测具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作等优点。     

产单核李斯特菌的研究进展

产单核李斯特菌属于典型的胞内寄生菌，是一种可引起全世界范围内人畜共患和食源性疾病的致病菌。文章从该菌的生物学特性、毒力因子、与动物性食品污染的关系以及检测等方面的研究进展进行了阐述。     

温州市食源性产单核李斯特菌污染调查

目的：掌握温州市各类食品中产单核李斯特菌（LM）的污染状况，初步确定易受污染的食品，为食源性疾病监测提供科学依据。方法：采集8大类食品及冰箱内壁涂抹物，按国标GB／T4789-30方法进行分离培养，然后用生化、API鉴定。结果：218件样品中检出LM13株，检出率为5．96％。冰箱内壁涂抹物96件均未检出。结论：LM主要污染的食品为家禽类、熟食制品、淡水鱼及涮羊肉等。     

改良分子信标-实时PCR快速检测产单核李斯特菌

目的：建立改良分子信标-实时PCR检测产单核李斯特菌（LMO）的快速方法，应用于食品中LMO的污染状况调查及食物中毒快速诊断。方法：根据GenBank公布的LMO hlyA基因的保守序列，设计引物和改良分子信标探针，建立改良分子信标-实时PCR检测体系，应用于食品中LMO检测。结果：改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为110fg，菌液灵敏度为99cfu／ml或4cfu／PCR反应体系，无交叉反应。以此反应体系检测28株LMO，均出现特异的荧光信号。上述方法可将检测时问由原来的至少4d缩短至1d。对228份食品进行LMO检测，8份增菌液LMO实时荧光PCR阳性，其中6份1310细菌培养阳性。结论：改良分子信标-实时PCR反应体系快速、灵敏度高，特异性强．能提高LMO的检出率和准确性，可应用于LMO食品污染状况调查及食物中毒的快速诊断。     

食品中产单核李斯特菌PCR检测灵敏度的研究

目的:研究PCR检测不同食品中产单核李斯特菌(Lm)的灵敏度。方法:从市场采集牛奶和火腿,向其中以及作为对照的生理盐水中添加不同量的Lm,直接检测或经过高温处理后检测Lm。结果:添加Lm的牛奶、火腿和生理盐水样品,未经高温、经100℃10 m in、经121℃15 m in处理后,PCR检测灵敏度分别为未经高温26.5、265、2.65×103cfu/m l;265、2.65×104、2.65×104cfu/m l;2.65×105、2.65×108、2.65×108cfu/m l。结论:不同食品中Lm PCR检测灵敏度不同,高温处理影响检测灵敏度。     

鼠疫菌免疫胶体金快速检测方法的建立

目的利用免疫胶体金技术建立一种简便、快速并适用于基层人员使用的鼠疫菌抗原检测方法。方法将抗鼠疫菌F1抗原的抗体致敏硝酸纤维素膜,用于捕获鼠疫抗原,然后用免疫胶体金颗粒进行标记。结果应用鼠疫菌免疫胶体金快速检测法最低可检出不同鼠疫菌(EV和Evp株)1.56×105CFU/ml,检测鼠疫菌F1抗原最低可检出1ng/ml,与鼠疫反向间接血凝法的检测结果一致;并且不与假结核小肠结肠炎等耶尔森菌以及其他相关细菌发生交叉反应。结论鼠疫菌免疫胶体金快速检测法具有较好的特异性、敏感性和简便快速的特点。     

单增李斯特菌免疫胶体金试纸条快速检测

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,单增李斯特菌),是李斯特菌属(Listeria)中最重要的人类食源性病原菌^〔1〕。目前单增李斯特菌的检测方法主要依靠传统的分离培养和生化鉴定,该方法费时费力^〔2,3〕。胶体金快速诊断试纸条技术是20世纪90年代以来发展起来的一项新型体外诊断技术^〔4〕。近年来该方法发展迅速,在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用,但用于食品卫生领域检测的产品较少。本研究针对单增李斯特菌研制出了食品污染单增李斯特菌的免疫胶体金检测试纸条。     

产单核李斯特菌的改良分子信标荧光PCR-磁捕获快速检测体系的建立

[目的]建立改良分子信标荧光PCR-磁捕获快速检测产单核李斯特菌(LMO)的体系,应用于食品中LMO的污染状况调查及食物中毒快速诊断. [方法]根据GenBank公布的LMO hlyA基因的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立改良分子信标荧光PCR检测体系.运用磁捕获材料对PCR检测阳性的增菌液进一步处理后划平皿做分离培养. [结果]改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为110 fg,菌液灵敏度为99 cfu/ml或4 cfu/PCR反应体系,无交叉反应.以此反应体系检测28株LMO,均出现特异的荧光信号.对228份食品进行LMO检测,8份增菌液LMO实时荧光PCR阳性.用磁捕获材料处理此8份增菌液,全部细菌培养阳性,高于国标法的6份阳性.[结论]改良分子信标一实时PCR反应体系快速、灵敏度高,特异性强,运用磁捕获试剂能有效提高培养阳性率.应用该检测系统能提高LMO的检出率和准确性.该系统可应用于LMO食品污染状况调查及食物中毒的快速诊断.     

建立快速检测鼠疫耶尔森菌的胶体金免疫层析法

〔目的〕　建立检测鼠疫耶尔森菌 (鼠疫杆菌 )的胶体金标记免疫层析方法。〔方法〕　采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒 ,并标记鼠疫杆菌的抗体 ,制成免疫层析检测试纸条 ,进行特异性和敏感性评价 ,并对面粉、土壤、奶粉、淀粉等不同材料进行模拟添加鼠疫菌检测。〔结果〕　用多种不同的常见细菌或近缘细菌进行测试 ,未出现非特异性反应 ,检测鼠疫杆菌的灵敏度为 1× 10 5cfu/ml,对水、土壤、奶粉、面粉、淀粉、酵母粉等不同材料中鼠疫杆菌进行检测也取得同样结果 ,10～ 15min即可得到结果。〔结论〕　建立了 1种可以用于现场快速检测鼠疫杆菌的胶体金免疫层析方法 ,为进一步大规模应用奠定了基础。     

胶体金标记单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的制备

目的制备胶体金标记单核细胞增生李斯特菌的单克隆抗体（McAb）,用于检测食品中的致病性单核细胞增生李斯特菌。方法以纯化的单核细胞增生李斯特菌（标准菌株号54001、54002）为抗原,免疫Balb/c小鼠,制备单克隆抗体,建立胶体金标记的单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的制备方法。结果筛选出2株单抗杂交瘤细胞株F5、F9,并获得免疫球蛋白,测定免疫球蛋白亚类为IgM。通过选用柠檬酸钠法制备胶体金标记单核细胞增生李斯特菌抗体,测定其最适蛋白结合浓度为12 g/ml。结论成功制备了胶体金标记的单核细胞增生李斯特菌的单克隆抗体,为建立食品中病原性单核细胞增生李斯特菌检测技术奠定基础。     

奶液模拟标本中单增李斯特菌real-time PCR检测方法的建立

目的建立了基于TaqMan探针的real-time PCR技术针对奶液模拟标本中单增李斯特菌的快速检测方法。方法用单增李斯特菌hlyO基因的部分片段作为靶基因,制作标准曲线,定量检测奶液中的单增李斯特菌。结果通过对不同李斯特菌及一些较为常见的致病菌的DNA进行扩增,只有单增李斯特菌能够产生扩增曲线,其余菌株均不产生扩增曲线。单增李斯特菌的检测灵敏度可以达到9copies/反应体系。结论该方法特异性好,灵敏度高,整个实验可在1.5h内完成,可用于食品中单增李斯特菌的快速检测和疫情暴发时的相关病原调查。     

显色培养基在单核细胞增生李斯特菌快速检测中的应用研究

目的:研究显色培养基对单核细胞增生李斯特菌的检测效果,探讨建立新型快速检测方法。方法:检测按国标GB4789-33程序进行。结果:人工污染样品和实际样品检测中,显色培养基CHROM agar L isteria和HKL isteria与传统平板OXA和MMA可以达到相同的检测限和灵敏度,且具有更高的特异性。结论:用显色培养基检测单核细胞增生李斯特菌是一种新途径,可大大提高检测效率。     

单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测技术研究

目的建立快速检测单增李斯特菌的PCR-ELISA方法,将其应用于人工污染的食物样品检测。方法根据GenBank数据库资料,应用分子生物学软件DNAMAN6.0和Primer Premier5.0,以单增李斯特菌的致病基因hlyA为基础,选用PCR引物,应用地高辛标记试剂盒,获得单增李斯特菌特异的地高辛标记片段。根据PCR目的片段序列,设计特异性捕获探针,建立了单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测方法。应用该方法对不同血清型的单增李斯特菌食品分离株进行了检测,并将PCR方法与PCR-ELISA方法对人工污染单增李斯特菌的牛奶样品的检测敏感性进行了比较。结果应用单增李斯特菌特异的PCR-ELISA方法完成检测约需6h。该方法对单增李斯特菌分离株检测的结果,与国家食源性疾病检测网的鉴定结果100%符合。经过12h的增菌培养,PCR-ELISA方法最低可从25ml样品中检出1CFU,检测敏感性为传统PCR方法的10～100倍。结论建立了单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测方法。该方法敏感性高、特异性强、可靠性好,对于提高食源性疾病预警、预测能力,增强检测的时效性和准确性,具有推广应用价值。     

全自动微生物磁珠分选系统检测单核细胞增生李斯特菌效果研究

目的:研究全自动微生物磁珠分选系统对食品中单增李斯特氏菌的检测效果。方法:取400份自然样品,用磁珠分选系统和国标法对样品进行对比检测。结果:全自动微生物磁珠分选系统相较国标法对自然样品中单核细胞增生李斯特氏菌阳性检出率有一定程度提高。结论:全自动微生物磁珠分选系统简单易用,标准化程度高,可以和国标检测方法相结合以提高单增李斯特氏菌的检出率。     

应用PCR方法检定单核细胞增多性李斯特菌

目的建立单核细胞增多性李斯特菌（单增李斯特菌）快速、敏感、特异的ＰＣＲ诊断方法。方法选取ｈｌｙＡ基因作为靶序列设计一对引物，用该引物对５４株标准李斯特菌和２１株无关菌进行ＰＣＲ扩增，得到进一步验证。采用ＰＣＲ和常规鉴定方法同时对从国内食品分离的３３株李斯特菌进行鉴定。结果可扩增含有保守ＨｉｎｄⅢ切点的７４３ｂｐ片段。表现出极好的单增李斯特菌种特异性。纯培养的检测极限为５５个菌。发现其中１８株用两种方法都鉴定为单增李斯特菌，两种方法的结果完全符合。当用于食物标本检测时，ＰＣＲ反应遭强烈抑制。经过２５小时的增菌培养，对培养物进行化学抽提、纯化的菌体经加热裂解后直接用作ＰＣＲ反应模板，可使抑制作用大大降低。每毫升牛奶人工接种４个菌可用该法特异检出。结论建立了ＰＣＲ方法，可初步用于单增李斯特菌的快速、特异、敏感诊断。     

食品中单增李斯特菌的脉冲场凝胶电泳分型

目的分析吉林省食品中分离的单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)的脉冲场凝胶电泳(PFGE)型别,探讨吉林省食品中单核细胞增生李斯特菌污染的同源性。方法将市售熟制米面制品、熟肉制品、中式凉拌菜和即食非发酵豆制品中分离出的39株单核细胞增生李斯特菌进行PFGE分子分型,BioNumerics version软件分析比较同源性。结果 39株单核细胞增生李斯特菌的PFGE结果主要分为6大群,其中1群包括6株,相似度为86.0%以上;2群包括16株,分为2个亚群,2A亚群包括7株,相似度为94.1%以上,2B亚群9株,相似度为74.8%;3群包括3株,相似度为80.0%以上;4群包括14株,亦分为4个亚群;5群包括3株,相似度为85.7%以上;6群包括1株,相似度为63.3%以上。结论吉林省食品中的LM来源于不同的克隆株,但部分LM有不同程度的相关性;PFGE是分析LM同源性的有效方法,对LM的流行趋势、分布特点和分子流行病学研究具有重要意义。     

进口三文鱼单核细胞增生李斯特菌污染检测

目的对2003~2006年由北京口岸挪威进口的三文鱼进行单核细胞增生李斯特菌污染情况监控,并对分离的单核细胞增生李斯特菌进行血清分型。方法采用美国食品药品管理局颁布的检测方法对单核细胞增生李斯特菌进行分离和血清分型。结果挪威三文鱼的单核细胞增生李斯特菌的检出率为1.2%~6.3%,在2003~2006年呈下降趋势;血清分型结果显示,分离自三文鱼的单核细胞增生李斯特菌的血清型主要是1/2a、1/2b和4b型,分别占分离菌株的85%,6%和6%。结论首次对分离自挪威三文鱼的单核细胞增生李斯特菌进行血清分型,所分离的菌株中97%是引起人类李斯特菌病的菌株。