百合三种病毒的多重RT-PCR检测

根据基因库中黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）、百合斑驳病毒（Lily mottle virus,LMoV）、百合无症病毒（Lily symptomless virus, LSV）的外壳蛋白基因序列,设计了3对特异引物,通过对扩增条件进行优化,建立了同时检测CMV、LMoV和LSV的多重RT-PCR检测方法。该方法可以从带有CMV、LMoV和LSV的样品中同时扩增出3条大小与试验设计相符的657 bp (CMV) 、428 bp（LMoV）、171 bp (LSV)的特异性多重RT-PCR扩增带。扩增产物测序表明,CMV、LMoV和LSV 3种病毒与GenBank中登录的亚洲和荷兰多数分离物核苷酸同源性在90%以上,地域差异不明显,外壳蛋白序列高度保守。     

香蕉两种主要病毒多重PCR检测方法的建立

 根据香蕉束顶病(Banana bunchy top virus, BBTV) 和香蕉花叶心腐病(Cucumber mosaic virus,CMV) 的复制酶基因、外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物对, 在BBTV单一PCR和CMV RT-PCR优化体系的基础上, 建立了可同时检测BBTV、CMV的多重PCR检测方法。此方法可以特异地从感染BBTV和CMV的样品中扩增出2条带, BBTV (748 bp) 和CMV (557 bp) 。扩增产物序列测定结果表明, BBTV扩增产物与GenBank中其他分离物的核苷酸序列同源性为91% ～99% , CMV扩增产物与GenBank中其他分离物的核苷酸序列同源性为93%～98%。     

太子参芜菁花叶病毒和蚕豆萎蔫病毒的双重RT-PCR检测

针对不同产地栽培的太子参(Pseudostellaria heterophylla)中主要存在芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,Tu MV)和蚕豆萎蔫病毒(Broad bean wilt virus,BBWV)侵染且为害严重的情况,建立能同时检测这2种病毒的双重RT-PCR快速检测方法。根据Gen Bank数据库中的Tu MV、BBWV外壳蛋白(coat protein,CP)基因核苷酸序列的保守区域分别设计简并引物,在单一RT-PCR检测体系的基础上,建立和优化双重RT-PCR检测体系。双重RT-PCR的优化结果显示,最佳扩增循环数为35,最佳引物浓度为0.4μmol·L~(-1),最佳退火温度为51℃。其灵敏度测定结果显示,2种病毒在样品c DNA稀释至原液的10-4倍后仍能扩增出特异条带。应用该方法对7份栽培太子参样品和4份脱毒苗样品进行了检测,结果表明,建立的双重RT-PCR检测方法可稳定、准确、灵敏地同时检测Tu MV和BBWV。     

三种百香果病毒在贵州的发生分布

前期利用高通量测序鉴定了侵染贵州百香果的3种病毒,为了解其分布情况,本研究采集贵州省镇宁县、贞丰县、关岭县和罗甸县4个百香果主产区疑似感病样品105份,利用RT-PCR方法检测病毒分布情况。结果表明,该方法扩增产物清晰,且特异性和灵敏度较高。夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus,TeMV)检出率最高,为100%;东亚西番莲病毒(East Asian passiflora virus,EAPV)和西番莲潜隐病毒(Passiflora latent carlavirus,PLV)检出率分别为81.9%和74.3%。说明贵州4个主产区的百香果均受到不同程度的病毒侵染,且部分地区病毒侵染情况严重。     

柑橘碎叶病毒巢式RT-PCR检测方法建立及应用

柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leafvius,CTLV)是威胁柑橘生产的重要病原之-.本研究在柑橘碎叶病毒-步法RT-PCR检测体系的基础上建立了CTLV的巢式RT-PCR检测方法,并对其检测灵敏度及特异性进行了分析.结果表明,该方法检测灵敏度比一步法RT-PCR至少提高100倍,检测模板总核酸的最低浓度...     

马铃薯Y病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立及应用

根据文献报道和GenBank已登录序列设计引物建立了马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)实时荧光定量RT-PCR检测技术体系。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系,相关系数R²为0.9912,可特异性检测PVY,灵敏度达常规RT-PCR的1000倍,重复性好。利用建立的检测方法对山东省、青海省、贵州省、黑龙江省和河北省5个地区马铃薯植株中的PVY进行检测,检出率较常规RT-PCR技术分别高16.00、33.33、25.00、14.29、20.00百分点。因此,建立的PVY实时荧光定量RT-PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速、准确地检测马铃薯带病种薯和植株中PVY的含量,为马铃薯Y病毒的早期监测和有效防治提供了有效的技术手段。     

马铃薯Y 病毒实时荧光定量RT-PCR 检测体系的建立及应用

根据文献报道和GenBank 已登录序列设计引物建立了马铃薯Y 病毒（potato virus Y，PVY）实时荧光定量RT-PCR 检测技术体系。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系，相关系数R² 为0.991 2，可特异性检测PVY，灵 敏度达常规RT-PCR 的1 000 倍，重复性好。利用建立的检测方法对山东省、青海省、贵州省、黑龙江省和河北省5 个地区 马铃薯植株中的PVY 进行检测，检出率较常规RT-PCR 技术分别高16.00、33.33、25.00、14.29、20.00 百分点。因此，建 立的PVY 实时荧光定量RT-PCR 检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点，可以快速、准确地检测马铃薯带病种薯和植株 中PVY 的含量，为马铃薯Y 病毒的早期监测和有效防治提供了有效的技术手段。     

葡萄4 种病毒多重RT-PCR 检测体系的建立

 以复合感染4种病毒的‘红地球’（Red Globe）葡萄样品为试材,对影响多重PCR的dNTPS浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度及模板量进行了调整和优化,建立了能同时检测葡萄卷叶伴随病毒3（Grapevine leafroll-associated virus-3,GLRaV-3）、沙地葡萄茎痘相关病毒（Grapevine rupestris stem pitting associated virus,GRSPaV）、葡萄病毒B（Grapevine virus B,GVB）和葡萄病毒A（Grapevine virus A,GVA）的多重RT-PCR方法。灵敏度测验结果显示,多重RT-PCR与单一RT-PCR检测灵敏度基本一致。多重RT-PCR获得的特异性片段大小分别为905、546、460和196 bp,经过克隆、测序及序列比对,表明其序列与已报道的病毒序列具有较高的同源性。对7个已知带病毒的葡萄样品进行检测验证的结果表明,所建立的多重RT-PCR技术可用于大量田间样品中这些病毒的检测。     

喇叭水仙中百合斑驳病毒的RT-PCR检测及序列分析

 根据基因库中已发表的百合斑驳病毒（Lily mottle virus, LMoV）外壳蛋白基因序列设计引物,通过RT-PCR方法从喇叭水仙Narcissus pseudonarcissus‘Pink-charm’ 样品中扩增出1条大小与试验设计相符的553 bp的特异性LMoV RT-PCR带。扩增产物序列分析表明：与GenBank中百合斑驳病毒百合分离物核苷酸相似性在90%以上。将该序列翻译为外壳蛋白的氨基酸序列ABW16938发现它完全存在于GenBank上已登录的LMoV病毒外壳蛋白序列NP-945145中,确认喇叭水仙该样品感染了百合斑驳病毒。     

柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的二重RT-PCR检测体系的建立与应用

选用柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)和柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)两种病毒外壳蛋白保守序列及内参基因Ubiquitin的特异性引物,优化影响二重RT-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度和退火温度,建立了针对两种病毒的一步法二重RT-PCR检测体系。二重RT-PCR获得CYVCV、CTV及Ubiquitin的特异性片段大小分别为614、373和194 bp,克隆测序和序列对比结果显示它们与已报道的病毒序列具有较高的同源性。该体系最低能从40 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CYVCV,从4 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CTV,其灵敏度与单一RT-PCR检测灵敏度一致。利用该体系对33份田间样品进行检测,CYVCV和CTV感染率分别为54.5%和66.7%,复合侵染率高达36.4%。该一步法二重RT-PCR技术体系可用于大量田间样品中CYVCV和CTV的快速同步检测。     

苹果花叶病毒RT-PCR检测技术

根据苹果花叶病毒的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,以带毒和不带毒苹果品种国光的总RNA为模板,进行cDNA的合成和PCR扩增,结果从感病材料中扩增出与预期的161 bp大小一致的目的片段,而健康的材料无此扩增产物。对此PCR扩增产物克隆测序,进一步佐证了RT-PCR检测结果。经过多次试验验证该检测体系,都可得到很好的重演性,从而建立了ApMV快速、灵敏、准确的RT-PCR检测技术。     

侵染白菜的黄瓜花叶病毒分离物基因组的全序列分析

对浙江省杭州地区白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis var. commuis Tsen et Lee.）上获得的CMV分离物（CMV-CTL）进行了全长克隆和基因组序列分析。结果显示：CMV-CTL的RNA1（GenBank序列号：EF213023）全长为3357个核苷酸（nt）,编码993个氨基酸（aa）的1a蛋白;RNA2 （GenBank序列号：EF213024）全长为3047 nt ,编码858 aa的2a蛋白和111 aa的2b蛋白;RNA3 （GenBank序列号：EF213025）全长为2217 nt,编码278 aa的MP蛋白和218 aa的CP蛋白。序列相似性分析表明,CMV-CTL与CMV亚组IB中株系IA相似性最高,RNA 1、RNA 2和RNA3与该株系的相似性分别为91.3%、91.3%和93.6%。CP基因和RNA 3 的5' NTR核酸序列系统发生树分析表明,CMV-CTL与中国大多数CMV分离物一样,属于CMV亚组IB。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒传播方式的研究进展

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是葫芦科作物重要病毒,通过多种方式如种子、土壤、水、介体和机械接触传播,病害蔓延扩散迅速。该病害在许多国家和地区频繁报道,我国也曾大面积受到为害,尤其是西瓜嫁接地区,产业损失严重。带毒种子为初侵染源,发生过该病害的地块土壤也是重要的侵染源,发病植株可通过灌溉水以及机械接触传播病毒。为了更好地控制该病害的发生与流行,本文介绍了该病毒传播方式方面的研究进展。     

检疫性黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测和防疫控制

综述了黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus)的分布、识别特征、生物学特性、传播方式,及其检测技术和风险分析,并提出了相关防疫措施。     

黄瓜再生体系和除草剂抗性筛选体系的建立

试验以黄瓜自交系C-8子叶节为材料,比较了不同浓度的6-BA和IAA组合对其不定芽诱导的影响,建立了高效快速的再生体系;摸索了不同浓度的草铵膦对产生不定芽的影响,建立了C-8的草铵膦抗性筛选体系,为下一步的遗传转化打下基础。结果表明,最佳的诱芽培养基为MS+0.5mg·L-16-BA+2mg·L-1IAA,出芽率为77.5%,生根培养基为1/2MS。对于C-8黄瓜,草铵膦的最佳遗传转化筛选浓度为0.6mg·L-1。