红曲霉T-DNA插入转化库中桔霉素突变子的筛选

以农杆菌介导法建立的红曲霉T—DNA转化库为实验材料,采用抑菌圈法从5,000多个转化子中筛选出200株桔霉素突变子的候选菌株,用高效液相色谱法进一步筛选得到53株与出发菌株相比产桔霉素能力发生显著变化的突变子,其红曲中桔霉素含量介于0．04～154．57μg／g之间。进一步分析了突变子的红曲色价,发现突变子产桔霉素能力与产色素能力之间有一定的相关性。这些研究结果为进一步从分子水平上探讨红曲霉产桔霉素和色素等次生代谢产物之间的关系提供了材料和基础。     

红曲霉T-DNA插入转化库中桔霉素突变子的筛选*

以农杆菌介导法建立的红曲霉T-DNA转化库为实验材料,采用抑菌圈法从5,000多个转化子中筛选出200株桔霉素突变子的候选菌株,用高效液相色谱法进一步筛选得到53株与出发菌株相比产桔霉素能力发生显著变化的突变子,其红曲中桔霉素含量介于0·04~154·57μg/g之间。进一步分析了突变子的红曲色价,发现突变子产桔霉素能力与产色素能力之间有一定的相关性。这些研究结果为进一步从分子水平上探讨红曲霉产桔霉素和色素等次生代谢产物之间的关系提供了材料和基础。     

农杆菌介导的红曲菌T-DNA插入突变库的构建及色素突变子的性质分析

以农杆菌EHA105为介导,将带有潮霉素抗性基因和gus基因的T-DNA片段转化到红色红曲菌(Monascusruber)中。通过转化条件的优化,成功构建了含有5132个转化子的T-DNA插入突变库。根据菌落颜色与色素分泌情况筛选到50株色素突变子,聚合酶链式反应(PCR)表明上述突变子均有T-DNA片段插入。经5代的继代培养后,94%的突变子具有稳定性(潮霉素抗性)。对突变子产色素和桔霉素能力的分析表明其分泌次生代谢产物的能力发生了较大变化。本方法的建立,为进一步深入研究红曲菌的代谢调节和基因功能奠定了基础。     

农杆菌介导的紫色红曲霉遗传转化体系的建立和优化

通过优化各种转化因素,建立了根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导红曲霉(Monascus)的高效转化体系:红曲霉在PDA培养基培养21 d后收集孢子,制备红曲霉孢子悬浮液,浓度为106个/mL,根癌农杆菌浓度为OD600值0.5,诱导剂AS浓度为100μmol/L,农杆菌与红曲霉在25℃共培养3 d。采用此转化体系构建了含有530多个转化子的红曲霉T-DNA插入突变体库。随机选取50株转化子菌株进行分子验证和稳定性检测,证明T-DNA成功插入红曲霉基因组DNA中,并能稳定遗传。最后,通过形态观察筛选出8株变异较大的菌株,为以后的红曲霉基因功能研究奠定了一定的基础。     

红光对红曲霉生长及次级代谢产物的影响

光照作为重要的环境因子之一,对包括真菌在内的多种生物的生长及生理过程起着重要作用.研究发现,红色单色光对平板培养的红曲霉(Monascus M10)菌落形态有明显的影响;在液态发酵时,红光在发酵初期可促进红曲霉的生长并促进其提前进入色素合成期,但对其生物量无明显影响;红光培养与黑暗培养对照相比,其发酵液、菌丝及单位菌丝中产生的色素都有明显提高,并在一定程度上降低了桔霉素的产量.     

TAIL-PCR法快速分离红曲霉色素突变株T-DNA插入位点侧翼序列

采用热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)法分离红曲霉色素突变株T-DNA插入位点的侧翼序列,扩增到了长度介于500bp～1300bp之间的7个DNA片段,对这些DNA片段测序,并采用生物信息学方法对测序结果进行了分析,表明其中有1个片段与烟曲霉Af293发育调控子flbA的相似性较高。TAIL-PCR法成功应用于分离红曲霉突变株T-DNA插入位点的侧翼序列,为大规模获取插入位点侧翼序列建立了可行的方法,也为进一步研究红曲霉功能基因奠定了基础。     

红曲霉菌液相培养高产色素低产桔霉素的代谢调控研究

从8株固态发酵高产红曲色素菌株中筛选出一株适合于液相培养工艺的高产红曲色素菌株FL1,并对其液相培养过程特性及高产色素低产桔霉素的代谢调控策略进行了研究.发酵过程动力学研究结果表明,红曲色素与桔霉素作为次级代谢产物,其合成与红曲霉菌生长的关系属于非生长偶联型.本文首次采用连续补料的Fed-Batch培养技术,用于红曲霉...     

高产γ-氨基丁酸低产桔霉素红曲霉(Monascus ruber)突变子1047筛选与发酵特性研究

以红曲米中筛选到的红色红曲霉菌株G为原始菌株,通过农杆菌介导T-DNA插入突变技术,成功构建了含有1 483株红曲霉突变子的T-DNA插入突变库。用HPLC等方法从突变库中筛选出10株γ-氨基丁酸(GABA)产量稳定高于原始菌株G的突变子,薄层层析结合HPLC技术分析了10株突变子发酵液中桔霉素的含量;其中突变子1047的GABA产量较高,为1.169g/L,是原始菌株G(GABA产量0.472g/L)的247.67%,桔霉素含量稳定低于原始菌株G。以红曲霉菌株G和突变子1047为实验材料,通过5 L发酵罐发酵并定时取样,HPLC等方法精确分析发酵液各种活性物质的含量;结果显示,突变子1047生长速度稍快于原始菌株G;GABA、莫纳可林K(Monacolin K)、红曲色素色价分别为2.201 g/L、83.892 mg/L、21.984 U/mL,是原始菌株G的279.67%、108.01%和182.35%;而桔霉素产量为1.976 mg/L,是原始菌株G的41.71%。因此,利用TDNA插入的方法对红曲霉进行育种,能产生稳定的遗传变化,在红曲霉资源的保护和利用上有一定潜力。     

红曲霉液态发酵生产红曲色素的工艺优化

为提高红曲色素的液态发酵水平,降低生产成本,采用Plackett-Burman试验与Box-Benhnken试验对红曲霉MY-03液态发酵生产红曲色素的工艺条件进行了优化,获得了最佳工艺条件:葡萄糖50 g/L、蛋白胨58.07 g/L、Mg SO4 2 g/L、Na NO3 2g/L、Mn SO4 0.3 g/L、Zn SO4 0.1 g/L、装瓶量50.8 m L、接种量10.0%(V/V),于150 r/min、30℃恒温培养7 d,红曲色素色价可达342.24±2.88 U/m L,比基础培养基提高了86.9%。     

红曲霉桔霉素的检测方法及红曲霉产桔霉素的判别方法*

建立了红曲霉真菌毒素桔霉素的HPLC检测方法。用谷氨酸和葡萄糖为唯一氮、碳源的培养基(MSG)液态摇瓶培养及红曲米固态培养,对30多株红曲霉产桔霉素的情况进行了普查,发现大多数红曲霉菌种可产生桔霉素。红曲霉的培养状态及条件对桔霉素的产生有重大影响。红曲霉菌种是否产桔霉素,可根据MSG培养基摇瓶发酵液中是否含有桔霉素来初步定性判断,为准确判断红曲霉菌是否产桔霉素,可采用多种培养法综合判断。     

Repeated-batch production of pigments by immobilised Monascus purpureus

Extracellular pigment production by immobilised Monascus purpureus C322 has been studied in repeated-batch processes using different immobilising carriers such as Ca-alginate, polyurethane sponge, active carbon and pearlite. With Ca-alginate, pigment production was maximum (30.5 UA₄₇₀ as process mean production, three batches) while the cell leakage was negligible (0.4 g l⁻¹ free biomass) and the bead mechanical stability good; with this carrier, an extended repeated-batch fermentation (nine batches, 55 days) was carried out: the process pigment productivity was 3.87 UA₄₇₀ day⁻¹.     

红曲霉原生质体的制备、再生及其遗传转化系统

原生质体是研究和建立真菌遗传转化系统的重要工具。为了建立原生质体介导的红曲霉遗传转化系统,考察了各种细胞壁裂解酶和渗透压稳定剂等对红曲霉原生质体形成和再生的影响。将红曲霉分生孢子在铺有玻璃纸的平板上30℃培养30~40 h收获的菌丝体最有利于原生质体的形成和释放。红曲霉菌丝体形成和释放原生质体最适裂解酶和酶解时间分别为：0.3 % lysing enzyme、0.1 % cellulase和1 % snailase的酶组合,30℃作用2.5 h;最适渗透压稳定剂是：1mol /L MgSO4。最适合原生质体再生的培养基为含0.6 mol/L蔗糖的CM培养基。原生质体液涂布单层再生培养基的方法,再生率最高,菌株M34和N18分别为8.5 %和36.4 %。在PEG和CaCl2存在下,以潮霉素B为抗生素选择标记,用质粒pBC-Hygro和pNL1共转化菌株M34原生质体,每微克DNA克获得100个稳定转化子。     

红曲霉变异株A6产色素发酵条件研究

本文对红曲霉变异株Ａ６进行了产红曲色素发酵条件试验,发现在以６％饴糖为碳源,以０３％ＮａＮＯ３为氮源的培养基,初始ｐＨ４０～４５,接种量为１５％时产色素浓度最高。同时,考察了整个发酵过程中ｐＨ,残糖量与色素生成浓度的关系,认为发酵周期拟控制在８０～８５ｈｒ为宜。本试验还发现在发酵过程中补加适量饴糖有利于产红曲色素     

Effort and Contribution of T-DNA Insertion Mutant Library for Rice Functional Genomics Research in China: Review and Perspective

With the completion of the rice (Oryza sativa L.) genome‐sequencing project, the rice research community proposed to characterize the function of every predicted gene in rice by 2020. One of the most effective and high‐throughput strategies for studying gene function is to employ genetic mutations induced by insertion elements such as T‐DNA or transposons. Since 1999, with support from the Ministry of Science and Technology of China for Rice Functional Genomics Programs, large‐scale T‐DNA insertion mutant populations have been generated in Huazhong Agricultural University, the Chinese Academy of Sciences and the Chinese Academy of Agricultural Sciences. Currently, a total of 372,346 mutant lines have been generated, and 58,226 T‐DNA or Tos17 flanking sequence tags have been isolated. Using these mutant resources, more than 40 genes with potential applications in rice breeding have already been identified. These include genes involved in biotic or abiotic stress responses, nutrient metabolism, pollen development, and plant architecture. The functional analysis of these genes will not only deepen our understanding of the fundamental biological questions in rice, but will also offer valuable gene resources for developing Green Super Rice that is high‐yielding with few inputs even under the poor growth conditions of many regions of Africa and Asia.      

紫色红曲霉Mp-24高产Monacolin K发酵工艺响应面优化

将单因素实验结果与响应面法相结合,对高产Monacolin K的紫色红曲霉Mp-24菌株进行发酵工艺条件优化。通过摇瓶发酵对碳源、氮源、碳源含量、氮源含量、培养时间等进行单因素优化,确定Mp-24菌株摇瓶发酵适宜条件：乳糖为碳源、酵母膏为氮源、碳源含量7%、氮源含量2%、培养时间12 d,Monacolin K产量为167 mg/L。应用Box-Behnken中心组合试验设计建立数学模型,进行响应面分析优化发酵条件,结果显示最佳发酵工艺条件为：碳源(乳糖)8%,氮源(酵母膏)3%,培养时间11 d,在此条件下Monacolin K的含量达到247.8 mg/L,比优化前提高1.5倍。     

高产红曲黄色素菌株的选育

利用紫外、硫酸二乙酯、氯化锂和亚硝基胍复合诱变的方法,选育到一株高产黄色素的红曲霉突变株MYM2.经过稳定性实验证明,诱变得到的菌株稳定性较好,液态发酵试验黄色素色价达到100U/mL以上,黄色素色调达到3.5左右.此黄色素在300nm～600nm波长之间只有一个在410 nm附近的最大吸收峰,在pH 3～8之间稳定性较好.当pH小于3时,红曲黄色素不稳定,黄色素溶液变混浊,放置后有沉淀产生.     

红曲霉发酵液中桔霉素快速检测方法的优化

研究确立了一种高效液相色谱法,能有效地对红曲霉代谢产物中的桔霉素分离和定量分析。色谱柱:Shimadzu VP-ODS C18(5μm,250 mm×4.6 mm),流动相组成为V(乙腈):V(甲醇):V(水)=70:10:20,pH≤2.8。荧光检测器:λex=331 nm,λem=500 nm。在优化的色谱条件下绘制标准曲线,当桔霉素质量浓度为0.1 mg.L-1~1 mg.L-1时线性关系良好,R2=0.9992。对桔霉素标品的最低检测质量浓度为0.01 mg.L-1,在红曲霉发酵样品中的定量回收率达到了0.9187722~1.029138。