牛病毒性腹泻病毒牦牛分离株E0基因的克隆表达

将青海牦牛牛病毒性腹泻病毒(BVDV)青海泽库(QHZK)株的E0基因亚克隆入原核表达载体pET-32(a),构建了重组表达载体pET-32(a)-E0,然后用重组质粒转化Rosetta(DE3)感受态细胞,并利用IPTG诱导蛋白表达。表达的蛋白用His-Band镍柱进行亲合层析纯化,Western blot鉴定表达蛋白。结果显示,E0基因可在大肠埃希菌中获得表达,表达产物的分子质量约为44ku,与预期的蛋白分子质量大小一致;Western blot分析表明,该蛋白可以与BVDV标准阳性血清产生特异性结合反应。     

牛病毒性腹泻病毒E0基因重组表达质粒pMG36e-E0的构建与免疫原性分析

利用SacⅠ、HindⅢ限制性内切酶分别对pMG36e与pMD19-T-E0进行双酶切,将目的基因E0整合入穿梭表达载体pMG36e,构建牛病毒性腹泻病毒E0基因重组表达质粒pMG36e-E0。提取重组质粒pMG36e-E0,进行双酶切鉴定及PCR鉴定。将阳性重组质粒pMG36e-E0转化到大肠杆菌DH5α中进行表达,对表达产物进行SDSPAGE和Western-blotting鉴定。用表达的E0蛋白二次免疫家兔,间接ELISA法检测其血清抗体水平。结果,重组质粒经双酶切得到大小分别约为3 600、691bp的2个片段,PCR扩增出691bp的片段,双酶切与PCR鉴定结果表明目的基因E0正确插入到载体pMG36e中。SDS-PAGE电泳结果表明E0基因在大肠杆菌获得了表达,表达产物相对分子质量大小约为27 000。Western-blotting分析结果证明表达产物能被BVDV阳性血清所识别。ELISA检测结果证明表达的E0融合蛋白能刺激动物产生抗体,具有天然蛋白的免疫原性。     

牛病毒性腹泻病毒E0基因的原核表达与活性检测

参考牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)基因组序列设计1对引物,扩增出650 bp的E0基因片段。将目的片段克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。将E0基因定向亚克隆到pET32a表达载体中,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白经亲和层析法纯化后,免疫印迹检测证明纯化的重组蛋白具有良好的活性。     

鹅副粘病毒NP基因的原核表达及表达产物抗原性检测

根据GenBank中发表的GPMVSF02株的NP基因的核苷酸序列设计合成一对引物，通过RT-PCR扩增JS／1／97／Go株的NP基因，将其克隆人pMDl8-T载体，序列测定和分析表明：所扩增的NP基因的核苷酸长为1470bp，共编码490个氨基酸。再将NP基因定向亚克隆至原核表达载体pGEX-6P的多克隆位点，经酶切鉴定后将含有NP基因的阳性亚克隆重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，用诱导荆IPTG分别以不同的浓度进行诱导，并在不同的诱导时间进行采样，样品经处理后通过SDS-PAGE、Westernblot和Dot-ELISA进行分析。结果显示：以终浓度为1mmol／LIPTG进行诱导4h表达可达到高峰。表达的融合蛋白大小约为80kD，并具有良好的抗原性。     

牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV) E0蛋白,纯化后免疫小鼠制备E0蛋白多克隆抗体用于BVDV的检测技术研究。【方法】采用PCR扩增BVDV的E0基因,将其连接至pET-28a (+)构建重组表达载体pET28a-E0。将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导、亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定E0蛋白的表达情况。将纯化的E0蛋白免疫小鼠制备BVDV E0多克隆抗体,并通过Western blotting、细胞免疫荧光试验、ELISA等试验检测该多克隆抗体的特异性和效价,以及在BVDV检测中的应用。【结果】成功构建原核表达载体pET28a-E0,表达并纯化E0蛋白,制备的BVDV E0多克隆抗体可特异性识别纯化的E0蛋白及pET28a-E0在BL21中表达的总蛋白。进一步Western blotting、细胞免疫荧光试验、双抗夹心法ELISA证明制备的E0多克隆抗体可用于BVDV的检测。间接ELISA结果表明,E0多克隆抗体效价高于1∶64 000。【结论】制备的BVDV E0多克隆抗体效价高、抗原结合特异性强,为BVDV E0蛋白的生物学功能研究及BVDV的检测提供了材料支持。     

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区编码基因的原核表达及抗原性研究

本试验旨在分析猪瘟病毒E2蛋白的免疫反应,应用RT-PCR方法扩增了编码猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株C株囊膜糖蛋白E2基因主要编码区,并定向克隆到表达载体pET-30a-c(+)中,获得重组表达载体pET30a-E2,将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blottin分析结果表明,E2基因获得高效融合表达,且具有免疫反应活性。本试验为建立E2抗原的检测试剂盒奠定基础。     

口蹄疫病毒VP2基因的原核表达及抗原性检测

将口蹄疫病毒VP2基因连接到原核表达载体pPROEX^TM HTb上，获得重组质粒pPR-VP2。将此质粒转化感受态菌DH5α中，经终浓度为1．0mmol／L的IPTG诱导，1h～6h依次收集菌液，SDS-PAGE电泳分析，在4h后表达量可达到高峰。经过软件分析，表达产物占总菌体蛋白的23．1％，大小为33Ku左右。根据Ni-NTA纯化系统说明操作，获得较纯的VP2融合蛋白。以牛抗O型口蹄疫病毒血清为第一抗体，通过Western blot和Dot ELISA鉴定，纯化后的VP2融合蛋白可以与牛抗O型口蹄疫病毒血清发生特异性反应。     

猪瘟病毒E0蛋白的表达与抗原性研究

本研究采用PCR技术,扩增猪瘟病毒E0蛋白191～227氨基酸基因片段,将其克隆到表达载体pET-30C质粒中,获得重组质粒30C-E0-1725。经酶切、PCR、序列分析,证明插入的目的基因有正确的编码框架。Westernblot试验表明,利用大肠杆菌表达的目的蛋白,能与CSFV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原特异性。     

日本脑炎病毒囊膜蛋白的基因原核表达及抗原性分析

参照GenBank中的日本脑炎病毒序列设计一对特异性引物,采用RT-PCR法扩增E基因得到cDNA,克隆至pMD-18T载体,经测序证实后亚克隆至原核表达载体pET-28a中,转化入BL21(DE3),IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明,成功构建了重组质粒pET-28a/JEV E,目的蛋白主要以包涵体形式表达。Western blot检测表明,表达产物与兔抗JEV多克隆抗体呈阳性反应,在ELISA试验中,用表达出的E蛋白包被,能够很明显地区分出猪日本脑炎阴性、阳性血清。     

鹅细小病毒NS2基因的原核表达及抗原性检测

为原核表达鹅细小病毒(GPV)NS2蛋白,本研究利用特异性引物扩增获得GPV的H1分离株NS2基因,将其克隆于pMD18-T载体后进行序列测定。并将NS2基因亚克隆于原核表达载体pGEX-6P-1中,获得重组质粒pGEX-NS2。该质粒转化于感受态菌BL21(DE3)plysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为75ku左右。经过亲和层析方法获得了纯化的重组NS2蛋白。Westernblot和Dot-ELISA鉴定结果表明,表达的重组NS2蛋白可以与GPV阳性血清发生特异性反应。     

牛病毒性腹泻病毒E^rns基因的真核表达及抗原性检测

为研究牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E^rns基因的生物学功能，将含有牛病毒性腹泻病毒E^rns基因的质粒pMD18-T—EE^rns经BamHⅠ／HindⅢ双酶切，获得了E^rns片段，再与杆状病毒转移栽体pBlueBaeHis2A连接，构建成重组质粒。将重组质粒pBlueBaeHis2A-E^rns与Bac-N—Blue^TMDNA共转染至sf9昆虫细胞中，获得了重组病毒，经噬斑筛选纯化，感染sf9昆虫细胞进行表达。SDS-PAGE分析结果表明，表达的目的蛋白大小约30ku；Western-blotting检测表明，该蛋白具有良好的抗原性。     

牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株E0基因的克隆与抗原表位预测

根据GenBank上发表的牛病毒性腹泻病毒(BVDV) Oregon C24V株E0基因的核苷酸序列设计1对特异性引物,应用PCR技术扩增BVDV HB-DCZ株E0基因.将PCR产物克隆到pMD18-T载体,克隆产物进行序列测定与分析.结果显示,HB-DCZ cDNA体外扩增获得特异性条带,约为687 bp.序列测定结果表明,HB-DCZ株E0基因由681个核苷酸组成,编码227个氨基酸.与已公开发表的BVDV其他毒株核苷酸和推导氨基酸序列同源性相似顺序依次为:CCSYD 99％和98.7％、QHZK10 98.4％和97.8％、VEDEVAC 98.2％和97.8％、Oregon C24V80.9％和89.9％、Yak 74.2％和81.1％.HB-DCZ与CCSYD、QHZK10以及VEDEVAC株的遗传距离较近,与国际标准毒株C24V、Yak株的遗传距离较远.运用Kyte-Doolittle方案预测氨基酸的亲水性,采用Karplus-Schulz方案预测蛋白质的柔性区域,按Jameson-Wolf方案预测抗原指数,利用Emini方案预测蛋白质的表面可及性.对预测结果综合分析,推测最有可能的B细胞表位位于N-端6～17、23～29、47～53、59～68、70～81、97～109、114～122、127～134、137～143、165～172、186～198和213～220.     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的多克隆抗体制备及鉴定

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白的兔源多克隆抗体,本研究利用表达BVDV E2蛋白的重组质粒pET30a-E2转化E.coli BL21(DE3),经诱导表达获得重组E2蛋白。Western blot检测显示纯化蛋白能够与BVDV参考阳性血清反应。以纯化的重组E2蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,病毒中和试验测定其中和效价为1:2048,间接免疫荧光和western blot试验表明其具有良好的反应性和特异性。本研究制备的BVDV重组E2蛋白兔源多克隆抗体可应用于BVDV的检测,同时为进一步建立检测BVDV E2蛋白的ELISA方法奠定基础。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的截短表达与鉴定

利用牛病毒性腹泻病毒（BVDV）BA株接种MDBK细胞，提取病毒RNA。参照已发表的BVDV基因组序列，利用Oligo6生物学软件设计扩增E2基因的1对引物，引入酶切位点并去掉E2蛋白的跨膜区及疏水区。通过RT-PCR扩增了长约1000bp的E2基因片段，克隆到pMD18-T载体上，酶切并测序鉴定。然后将目的片段进一步定向克隆到pET30a表达载体，转化BL21表达菌。取转化菌培养，并用IPTG诱导，获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白变性、纯化和复性后，用免疫印迹与间接ELISA检测表明纯化的重组蛋白具有良好的免疫原性，为牛病毒性腹泻病毒诊断试剂的研制奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒重组E2蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

为建立一种简单快速、敏感特异、高通量的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体检测方法,采用原核表达方法对BVDV E2基因中免疫原性强的1段序列进行截短表达,获得了具有良好反应活性的重组E2蛋白,以重组E2蛋白为包被抗原建立了检测BVDV抗体的间接ELISA方法。结果显示:该方法检测牛副流感病毒3型(BPIV-3)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)阳性血清均为阴性,检测BVDV抗体的灵敏度可达1∶12 800,批内和批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%,与中和试验的符合率为94.44%。应用该方法检测国内外5个生产厂家的53批次细胞培养用牛血清样品,阳性污染率达39.62%;检测589份临床牛血清样品,阳性感染率为34.80%。研究表明,建立的BVDV重组E2蛋白间接ELISA抗体检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和适用性,为BVDV感染的监测提供了重要工具。     

牛病毒性腹泻病毒TC株的分离鉴定及E0基因的序列分析

从新疆塔城地区某牛场采集患病犊牛全血,将RT-PCR方法鉴定为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)阳性的样品接种到MDBK细胞,传代至第4代,出现典型病变(CPE)。通过间接免疫荧光试验,证明该分离病毒为BVDV,命名为BVDV-TC。设计引物对E0基因进行扩增和序列分析。所得片段与GenBank上已发表的BVDV毒株核苷酸序列的同源性为69.3%~93.8%,氨基酸同源性为73.6%~97.8%,TC株的遗传距离与VEDEVAC株最接近。BVDV-TC是第一个在新疆地区报道的1b亚型BVDV毒株,为新疆地区BVDV感染的防控提供依据。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立及临床效果评价

旨在建立一种检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体的间接ELISA方法。将BVDV的囊膜蛋白E2基因克隆到原核表达载体pET-32a中进行表达,将纯化后的蛋白作为包被抗原,优化ELISA条件,建立了BVDV抗体间接E2-ELISA检测方法,证实该方法的特异性、敏感性和重复性均较好。用所建立的E2-ELISA方法检测从广西各牛场采集的475份血清样品,检出率为24.8%;与商品化试剂合作比较,符合率为95%。结果表明,建立的E2-ELISA方法简便易行,适用大量样本检测,可用于BVDV的抗体水平监测及牛病毒性腹泻的流行病学调查。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白纳米抗体筛选及反应原性检测

通过噬菌体展示技术筛选牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白特异性纳米抗体,验证纳米抗体反应原性.使用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,分别在第0、21、49及70天采集全血,测得抗体效价后分离全血中淋巴细胞,提取总RNA,反转录后PCR扩增目的片段.目的片段和pCANTAB5E使用限制性内切酶酶切连接后转至TG1感受态细胞...     

进口奶牛病毒性腹泻病毒快速检测鉴定

采用ELISA方法对3 073头奶牛全血进行牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)检测,结果发现编号a889的血样呈阳性反应,另外有3份血样(a126、a803、b1277)呈可疑反应;进一步的白细胞抽提物ELISA反应表明,a889血样呈阳性反应,其余呈阴性反应。对a889血样进行RT-PCR扩增,得到1条310 bp大小的特异性条带,与预期片段大小吻合;经序列同源性比较分析,确定a889血样中存在牛病毒性腹泻病毒。     

Viral and viral protein specificity of antibodies induced in cows persistently infected with noncytopathic bovine viral diarrhea virus after vaccination with cytopathic bovine viral diarrhea virus

Neutralizing and nonneutralizing antibodies to bovine viral diarrhea (BVD) virus were detected in 3 cows persistently infected with noncytopathic BVD virus after vaccination with modified-live cytopathic BVD virus. Neutralizing antibodies detected in serum samples from each persistently infected cow at 3 weeks after vaccination were highly specific for certain isolates of cytopathic BVD virus and reacted only with a viral protein with a molecular weight of 53,000. Neutralizing antibodies to 1 of 3 isolates of noncytopathic BVD virus were detected in a serum sample obtained at 12 weeks after vaccination from 1 of 3 persistently infected cows. Nonneutralizing antibodies were detected in all cows at 7 to 12 weeks after vaccination. The nonneutralizing antibodies were less specific for isolates of BVD virus and reacted with viral proteins with molecular weights of 115,000, 80,000, 53,000, and 47,000.