Cx43基因shRNA慢病毒载体的构建及其对大鼠心肌细胞Cx43基因的作用

目的构建缝隙连接蛋白(Cx)43基因shRNA慢病毒载体,并检测其对大鼠心肌细胞Cx43基因的作用。方法针对Cx43基因序列,设计RNA干扰靶点序列,合成靶序列的双链DNA,接入pGCL-GFP载体,挑选阳性克隆行PCR鉴定及测序。用pHelper1.0和pHelper2.0质粒转染293T细胞,包装产生具备感染能力的慢病毒。以293T细胞中绿色荧光蛋白的细胞数量计算病毒滴度;以最适感染复数感染大鼠心肌细胞,通过荧光显微镜观察感染效率;应用real-time PCR和Western blot法检测大鼠心肌细胞Cx43 mRNA及Cx43蛋白表达,并评价其抑制效果。结果经PCR鉴定和测序证实,Cx43慢病毒载体构建正确,其病毒滴度为8×108TU/mL、转染效率为82.59%。荧光定量real-time PCR法检测Cx43 mRNA的抑制率为96.10%,Western blot法检测Cx43蛋白的抑制率为77.16%。结论成功构建了Cx43基因shRNA慢病毒载体,其能显著抑制大鼠心肌细胞Cx43基因的表达。     

siRNA沉默AFP基因对肝癌细胞系EGHC-9901凋亡的影响

目的建立稳定表达针对AFP基因siRNA质粒的肝癌细胞模型并探讨对其凋亡的影响。方法构建针对AFP基因的siRNAs表达质粒,脂质体法将该质粒转染肝癌细胞系EGHC-9901,G418筛选4~5周后Western blot及RT-PCR检测靶基因抑制效果,细胞分组：实验组（siRNA-afp）,转染AFP-siRNA质粒组;载体对照组,转染空载体组;空白对照组,未做任何处理组。免疫荧光检测细胞在无血清状态下凋亡情况,Western blot及RT-PCR检测Caspase-3、Caspase-8等凋亡相关蛋白表达。结果在体外成功构建针对AFP的siRNA表达质粒并在体外建立稳定表达该质粒肝癌细胞系EGHC-9901,转染后细胞表达AFP近乎完全抑制;免疫荧光表明促进细胞在无血清状态下的实验组凋亡率为32%±4%,对照组凋亡率为17%±3%,差异有统计学意义（P〈0.05）;RT-PCR及Western blot检测凋亡相关蛋白表明实验组Caspase-3表达较对照组高,差异有统计学意义（P〈0.05）,而Caspase-8、Caspase-9、bcl-2表达无显著差异（P〉0.05）。结论在体外成功建立稳定表达针对AFP基因的siRNA肝癌细胞系,抑制AFP表达可能通过上调Caspase-3表达促进其凋亡。     

靶向大鼠Smad3基因的siRNA筛选及其shRNA重组慢病毒的构建

目的设计并筛选针对大鼠Smad3基因的siRNA,构建靶向Smad3基因的shRNA重组慢病毒。方法针对大鼠Smad3基因设计并合成6对siRNA（siRNA001～006）及1对无关对照siRNA,转染大鼠肝细胞株BRL-3A,应用Western Blot检测各siRNA对SMAD3蛋白表达的抑制作用,挑选抑制效率高的siRNA。依据所得的序列合成并克隆到pLL3.7载体中,与包装质粒pRSV-rev、pMDLg-pRRE和VSV-G共转染293FT细胞获得靶向Smad3的慢病毒。通过流式细胞仪绿色荧光蛋白（GFP）荧光计数来检测病毒滴度。结果 Western Blot检测证实siRNA001、siRNA005、siRNA006对SMAD3蛋白表达的抑制作用明显,抑制率分别可达83.36%、86.99%及64.88%,而对照siRNA无明显作用。酶切和测序结果显示Smad3 shRNA及对照shRNA重组载体质粒pLL3.7-shRNA构建成功,将构建的质粒进行慢病毒包装可产生有感染活性的慢病毒颗粒。结论筛选出针对大鼠Smad3基因有明显抑制作用的3对siRNA,并成功构建表达相应shRNA的4种重组慢病毒,为研究调控Smad3的表达对肝再生或肝纤维化的影响提供了实验条件。     

抑制 RhoA 基因表达诱导乳腺癌细胞凋亡的实验研究

目的：探讨抑制RhoA基因表达诱导乳腺癌（ BC）细胞凋亡的作用。方法通过已建立的RhoA腺病毒载体系统,感染BC MCF -7细胞。经过细胞培养、病毒滴度等,将收集的样本分别用Western blot、RT-PCR技术检测RhoA 蛋白表达和基因表达变化;对感染Adsi RNA-RhoA的BC 细胞进行MTT检测及细胞内DNA片段化检测。结果腺病毒siRNA-RhoA感染BC细胞能明显抑制RhoA基因表达（抑制率为75．64％）,降低RhoA基因的mRNA转录水平69．44％。 MTT检测结果表明,感染腺病毒Adsi RNA-RhoA组的肿瘤细胞生长、增殖被明显抑制。 TUNEL检测显示,抑制RhoA基因表达能明显导致BC细胞凋亡。结论利用siRNA抑制BC细胞中RhoA基因表达,能诱导BC细胞凋亡。     

RNA干扰抗A型H1N1流感病毒的研究

目的 制备靶向A型H1N1流感病毒RNA聚合酶(PA)基因的小干扰RNA(siRNA),研究其抑制病毒复制的效果.方法 设计并合成3对靶向A型H1N1流感病毒PA基因的siRNA,构建表达质粒pS-PA646、pS-PA841、pS-PA1537,分别转染MDCK细胞及鸡胚,并感染H1N1亚流感病毒,检测siRNA抑制流感病毒复制的效果.结果 设计的3对siRNA中,pS-PA1537可明显抑制A型H1N1流感病毒在MDCK细胞及鸡胚中的复制.结论 该研究为开发抗H1N1治疗制剂研究奠定了基础.     

慢病毒介导siRNA抑制登革病毒复制的研究

目的探讨siRNA抑制登革病毒复制的分子机制。方法用登革病毒感染Vero细胞,实时荧光定量PCR检测稳定表达Si-DENV的Vero细胞系上清中病毒含量,并通过流式细胞技术检测感染细胞的比例,利用细胞免疫荧光法和Western blot方法检测登革病毒蛋白表达情况。结果 Si-DENV能够抑制登革病毒在细胞内的复制以及病毒释放,与对照组相比,感染后第3～7d,上清中病毒含量的差异均具有统计学意义(P0.01)。感染后第7d,Si-DENV组登革病毒感染细胞的比例仅为4.48%,对照组感染细胞比例为81.06%。实时荧光RT-PCR结果表明Si-DENV组病毒基因组RNA及负链RNA含量显著减少,与Si-NC组相比差异具有统计学意义(P0.01),细胞免疫荧光法和Western blot实验证明Si-DENV下调prM、E、NS1等病毒蛋白在Vero细胞中的表达水平。结论利用慢病毒转染Si-DENV能抑制登革病毒在Vero细胞中的复制,为登革病毒的防治提供了新的思路。     

AQP5基因重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建人水通道蛋白5（AQP5）基因慢病毒载体。方法体外扩增出AQP5基因全长cDNA,将慢病毒载体pWPTS-GFP与扩增出的AQP5用MluⅠ和SalⅠ进行双酶切,将AQP5全长序列克隆入pWPTS-GFP,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,对长出的克隆用菌落PCR鉴定,再对阳性克隆进行测序和比对分析。重组病毒质粒与另外两种辅助包装原件载体质粒通过CaCl2共转染293T细胞（人胚肾细胞）,培养48 h后收集细胞培养上清液,将病毒浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度,并检测慢病毒载体在工具细胞SGC7901细胞（胃癌细胞）的转染效率。Western blot检测SGC7901细胞中AQP5蛋白。结果测序结果和Western blot检测均证明AQP5重组慢病毒载体构建正确,并能在细胞中正确表达。与辅助质粒共转包装细胞获得慢病毒颗粒,并成功感染SGC7901细胞。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为1×108 TU/ml。结论成功构建了稳定表达AQP5基因的重组慢病毒载体。     

siRNA干扰立早蛋白ICP4对HSV-1病毒复制能力的影响

目的观察siRNA作用于HSV-1病毒的ICP4后对HSV-1复制能力的影响。方法设计两段靶向HSV-1 ICP4的siRNA和一段阴性对照序列,酶切连接法构建重组质粒pLKO-puror-hU6-siRNA/CON;脂质体法包装重组慢病毒pLKO-puror-hU6-siRNA/CON;嘌呤霉素筛选法建立抗ICP4的siRNA单克隆细胞系（VERO115、VERO3604、VERO115＋3604、VERO-CON）;TCID50法检测siRNA对HSV-1的病毒复制能力的影响。结果成功构建重组质粒pLKO-puror-hU6-siRNA/CON;获得重组慢病毒pLKO-puror-hU6-siRNA/CON;成功构建四个抗ICP4的siRNA单克隆细胞系;BAC-HSV-1-GFP病毒感染单克隆细胞系,siRNA作用后野生型VERO细胞的细胞病变效应（CPE）及绿色荧光蛋白（GFP）表达率均近100%,VERO-CON细胞达90%以上。siRNAVERO115及VERO3604的CPE及GFP表达率明显高于VERO115＋3604细胞,P〈0.05。且不同位点联合干扰对病毒的抑制作用强于单一位点干扰,低于VERO115和VERO3604,P〈0.05。结论抗ICP4的siRNA对HSV-1的复制有明显的抑制作用,且不同位点siRNA联合干扰对病毒的复制有协同抑制效果。     

多效蛋白基因的小干涉RNA慢病毒表达载体的构建及其对人小细胞肺癌H446细胞株生长与凋亡的影响

目的 构建针对多效蛋白(pleiotrophin,PTN)基因的小干涉RNA(siRNA)慢病毒表达载体并观察其对人小细胞肺癌H446细胞株PTN表达抑制及对细胞生长和凋亡的影响.方法 设计4对针对PTN基阒的小发夹RNA(shRNA)序列,与Plvthm载体连接,构建慢病毒表达载体LV(lentiviral)-shPTN,连接产物转化到DH5α感受态细胞,阳性克隆测序鉴定.再用LV-shPTN与pRsvREV、pMDlg-pRRE、pMD2G三种质粒共转染293T细胞,小量包装与纯化产生慢病毒颗粒.感染H446细胞后,用荧光定量PCR及Western blot法检测PTN的表达.将包含对PTN基因十扰效率最高的序列慢病毒载体进行大量包装、纯化及病毒滴度测定,将包装好的病毒感染H446细胞.实验分为正常未干扰细胞组、阴性对照组、PTN抑制组、化疗组及PTN抑制加化疗组,四甲基偶氮唑盐比色法观察细胞生长,流式细胞仪分析细胞凋亡.结果 测序结果与构建慢病毒载体的预期结果一致,对PTNmRNA的最高抑制效率为72%,对PTN蛋白的最高抑制效率为59%.大量包装与纯化后病毒滴度为1×10~8 TU/ml.PTN基因抑制组H446细胞活力明显低于正常未干扰细胞组和阴性对照组,基因抑制联合化疗组较单纯基因抑制组及化疗组细胞活力下降,凋亡率增高,并具有浓度依赖性.结论 构建PTN RNA干涉载体,转染后可有效降低H446细胞FIN的转录和表达,抑制H446细胞的生长并促进其凋亡,有望成为小细胞肺癌基因治疗的可选择的方法之一.     

ECEL1基因PSCSI-GFP慢病毒载体的构建

目的设计并构建针对ECEL1基因的RNA干扰慢病毒载体。方法依照ECEL1基因为模板,设计RNA干扰靶点,根据选定的靶点序列,设计短发夹RNA(shRNA)干扰序列,在两端添加相应的限制性内切酶酶切位点,合成单链DNA oligo,退火缓冲液中配对形成双链DNA oligo。利用Age I和EcoR I双酶线性化GV115载体。把载体和DNA oligo相连接,其连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,经PCR扩增并测序鉴定。再通过质粒抽提,转染,浓缩与纯化后获得重组的ECEL1基因RNAi慢病毒,用"HIV-1p24抗原ELISA法"测定样品滴度。选取检测合格的慢病毒感染人肝癌细胞(BEL-7404),并设置对照组,荧光观察感染率。并使用Real-time PCR法及Western blot检测人肝癌细胞(BEL-7404)中ECEL1基因敲减后mRNA和蛋白质的表达量。2组间比较采用两独立样本t检验。结果 (1)根据ECEL1基因模板设计后,选定psc48784片段作为RNA干扰靶点,制备双链DNA oligo,PCR鉴定阳性重组子并测序,验证psc48784为正确的克隆。经过质粒抽提,转染以及浓缩纯化后,成功构建ECEL1基因RNAi慢病毒。物理检测与无菌检测合格。(2)通过HIV-1 p24抗原ELISA法测定ECEL1基因RNAi慢病毒样品病毒滴,测定样品病毒滴度为3×108TU/ml;表明已成功构建高滴度且合格的ECEL1基因RNA干扰慢病毒。(3)用ECEL1基因RNAi慢病毒感染人肝癌细胞(BEL-7404),荧光观察结果显示细胞感染效率达到80%,细胞状态稳定;使用Real-time PCR的方法及Western blot检测实验组人肝癌细胞(BEL-7404)中ECEL1基因在mRNA和蛋白质水平的表达量受到抑制(P值均0. 05),敲减效率达到70. 5%。结论成功构建ECEL1基因PSCSI-GFP慢病毒载体并获得稳定高滴度的病毒样品,并获得稳定的ECEL1基因敲减的人肝癌细胞(BEL-7404)。     

化学合成siRNA体外对柯萨奇B3病毒的影响

目的RNA干扰是近年来研究基因功能的重要工具。本研究是在培养HELA细胞中，体外化学合成siRNA（small interfering RNA）对柯萨奇B3病毒（Coxsackievirus B3，CVB3）的影响，探讨RNA干扰的抗病毒效应与其应用前景。方法根据siRNA靶序列设计原则，设计了一段针对编码CVB3病毒VP4蛋白基因组的siRNA，并在体外通过化学合成形成siRNA。同时合成一段与CVB基因组序列无关的阴性对照siRNA。用CVB3感染培养HELA细胞，将其分为3组，即siRNA组（n=8），阴性siRNA组（n=8），病毒对照组（n=8），分别观察转染后第1天到第5天的细胞病变，并与未感染CVB3的空白对照组进行比较；采用RT-PCR技术检测感染CVB3各组的病毒RNA片断，观察病毒RNA与内参GAPDH的OD比值；用免疫荧光技术检测各组CVB3蛋白的表达。结果RT-PCR检测各组CVB3病毒5’端非编码区（5’UTR）RNA，siRNA组与阴性siRNA组和病毒对照组比较无明显变化（P〉0．05）；免疫荧光检测各组CVB3病毒蛋白也未见显著差异；细胞病理效应（cytophatic effects，CPE）各组问未见明显差异。结论本文选择针对编码CVB3病毒VP4蛋白基因组的siRNA未能抑制CVB3病毒复制。     

慢病毒-HBx表达载体的构建及其在人正常肝细胞系Chang liver的稳定表达

目的:构建乙型肝炎病毒X基因(hepatitis B virus x,HBx)慢病毒表达载体,建立稳定表达HBx蛋白的人正常肝细胞系Chang liverHBx.方法:应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法从质粒中扩增HBx基因,并克隆到慢病毒p EB-3xflag-GP-Puro载体上,经PCR、酶切和测序鉴定正确后经慢病毒包装感染人肝细胞Chang liver,再用嘌呤霉素筛选出稳定表达HBx蛋白的细胞株,最后用免疫荧光和Western blot技术检测HBx蛋白的表达.结果:酶切鉴定和基因测序证实HBx基因成功克隆到慢病毒表达载体上,重组慢病毒经包装纯化后获得滴度为1×108 TU/m L,用包装好的重组慢病毒感染人肝细胞Chang liver,经嘌呤霉素筛选获得单克隆细胞株Chang liver-HBx,利用免疫荧光和Western blot技术检测发现细胞株Chang liver-HBx可稳定表达HBx蛋白.结论:成功构建了HBx的重组慢病毒表达载体,获得了稳定表达HBx的Chang liver细胞系Chang liver-HBx,为进一步研究HBx诱导正常肝细胞恶性转化提供细胞模型.     

腺相关病毒介导的小干扰RNA对大鼠肝星状细胞金属蛋白酶组织抑制因子-1及基质金属蛋白酶13表达的影响

目的 观察以腺相关病毒(AAV)为载体含有针对金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1具有较强抑制作用的小干扰RNA(siRNA)感染大鼠星状细胞系HSC-T6后TIMP-1及基质金属蛋白酶13(MMP13)的表达情况.方法 将对大鼠TIMP-1基因具有最强抑制作用的一对siRNA,在体外构建为短发夹siRNA表达载体后,将其包装为重组AAV-rAAV/siRNA-TIMP-1/neo并感染HSC-T6,于感染后4周及12周应用荧光定量PCR方法及Western blot方法分别检测TIMP-1及MMP13 mRNA及蛋白质表达情况.结果 经PCR、酶切及序列测定证实抑制作用最强的1对siRNA在体外构建的shRNA表达载体成功克隆.将重组质粒包装成病毒后感染HSC-T6细胞,与对照组细胞相比,rAAV/siRNA-TIMP-1/neo感染组在感染后4周及12周细胞TIMP-1 mRNA及蛋白质表达水平明显降低(P＜0.01),而MMP13 mRNA及蛋白质表达水平明显增高(P＜0.01).结论 化学合成的siRNA在短时期内可有效地抑制TIMP-1基因的表达,重组病毒rAAV/siRNA-TIMP-1/neo可长期有效地抑制TIMP-1基因表达.     

小鼠肝细胞SMAC基因特异干扰载体的构建及慢病毒包装

目的构建并鉴定小鼠SMAC特异干扰载体,并进行慢病毒包装。方法针对小鼠SMAC基因设计并合成3对干扰序列siRNA1、siRNA2、siRNA3及一对阴性对照序列siRNAn,脂质体法转染小鼠肝细胞,Real time PCR法筛选出最佳干扰序列。依据该最佳干扰序列合成DNA oligo,连接GV115载体,获得重组干扰质粒,PCR鉴定阳性克隆并测序鉴定构建的正确性。将该重组干扰质粒与辅助质粒pHelper1.0和pHelper2.0共转染293T细胞,进行慢病毒包装,收集细胞上清并浓缩,梯度稀释法测定病毒滴度。多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用SNK-q检验。结果 3条siRNA对肝细胞SMAC mRNA均有不同程度的抑制作用,其中siRNA1的抑制效应最强,抑制效率达到70.3%。依siRNA1片段合成DNA oligo,并与慢病毒载体连接,测序显示其构建正确,梯度稀释法测定慢病毒滴度为6×108TU/ml。结论成功构建了小鼠SMAC基因特异干扰性的慢病毒,为研究SMAC基因在肝衰竭中的作用奠定基础。     

NF-κB/p65特异的RNAi腺病毒载体的构建及其对p65表达的抑制效应

目的构建NF-κB p65亚基特异的RNA干扰（RNAi）腺病毒表达载体，并验证其对p65亚基的基因沉默效应。方法设计合成三对针对p65 mRNA不同位点的短发夹RNA（shRNA）编码序列，克隆到穿梭载体中，通过体外同源重组将短干扰RNA（siRNA）表达盒转移到腺病毒骨架质粒，构建RNAi腺病毒表达载体；在HEK293A细胞中包装并扩增病毒、空斑实验法进行病毒滴度测定；腺病毒感染人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞，Western印迹法和免疫细胞化学法验证构建的RNAi腺病毒对p65蛋白表达的抑制效应。结果成功构建了NF-κB p65亚基特异的RNAi腺病毒表达载体，获得高滴度的腺病毒液；RNAi腺病毒感染ECV304细胞后可以高效抑制p65蛋白的表达，且对p65蛋白表达的抑制作用可持续6d以上。结论应用RNAi腺病毒表达载体能有效阻断目的基因的表达。     

SYNPO2蛋白在狂犬病病毒复制过程中的功能初探

目的 探明SYNPO2蛋白对狂犬病病毒复制的影响。方法 通过免疫印迹分析病毒感染后SYNPO2蛋白的差异表达情况;构建SYNPO2基因真核表达载体和shRNA干扰载体,转染SK-N-SH细胞后进行病毒感染,免疫印迹分析过表达或干扰SYNPO2对病毒蛋白表达的影响,荧光定量PCR分析过表达或干扰SYNPO2对病毒基因组复制和转录水平的影响,病毒滴度测定分析过表达或干扰SYNPO2对感染性病毒粒子释放能力的影响;SYNPO2真核表达载体转染SK-N-SH细胞后进行病毒感染,或与构建成功的病毒M基因真核表达载体共转染SK-N-SH细胞,间接免疫荧光实验结合激光共聚焦拍照技术分析SYNPO2与M蛋白在病毒感染或真核表达细胞中的亚细胞定位情况。结果 狂犬病病毒感染可诱导SYNPO2蛋白的下调表达;SYNPO2过表达可促进病毒M蛋白表达,但未影响病毒基因组的复制、转录及感染性病毒粒子释放的能力;干扰SYNPO2则在未影响病毒基因组复制和转录的情况下显著抑制了病毒M蛋白的表达和感染性病毒粒子的释放;进一步经共定位分析发现SYNPO2与病毒M蛋白存在明显共定位现象。结论 确定了SYNPO2蛋白对狂犬病...     

重组5型腺病毒高效扩增的研究

目的探讨高效扩增腺病毒载体的方法。方法采用人胚肾293细胞株扩增合有SERCA2a基因的重组5型腺病素(Ad-SERCA2a),采用半组织定量法测定病毒滴度,PCR和Western blot法检测SERCA2a基因表达。结果扩增纯化后腺病毒滴度为1.0×10~(12) PFU/ml,扩增病毒SERCA2a基因表达。结论采用人胚肾293细胞扩增重组腺病毒,经纯化后可获得高滴度病毒。     

应用表达载体介导siRNA抑制胰腺癌STAT3基因表达的研究

目的探讨表达载体介导小干扰RNA（siRNA）对人胰腺癌细胞系SW1990转录激活因子-3（STAT3）表达的抑制作用。方法设计合成3种可编码后形成小发夹结构针对STAT3基因的siRNA的DNA序列，将其连入pRNAT—U6．1／Neo质粒中，构建STAT3siRNA表达载体。表达载体进行PCR及测序鉴定，并分别转染SW1990细胞，实时定量PCR和Western blot观察SW1990细胞转染后STAT3 mRNA和蛋白表达的改变。结果PCR和DNA测序证实携带3种STAT3 siRNA表达载体构建成功，分别转染SW1990细胞后，STAT3基因的mRNA和蛋白表达量与空质粒转染相比均明显下降（P〈0．05），其中，第二种STAT3 siRNA作用明显，可使mRNA和蛋白表达水平分别下降63％和60％。结论本研究构建的STAT3．siRNA表达载体可有效抑制SW1990细胞STAT3的mRNA和蛋白表达，为下一步以STAT3为靶点的胰腺癌基因治疗实验研究奠定了基础．     

整合素β1对泡沫细胞形成的影响及其机制

目的 探讨整合素β1对泡沫细胞形成的影响并初步阐明其作用机制.方法 针对整合素β1基因设计并化学合成siRNA.RAW264.7细胞与含0.1 g/L ox-LDL的培养基培养,分为空白对照组、转染siRNA阴性对照组(siRNANC)和siRNA组.应用油红O染色观察泡沫细胞形成,胆固醇氧化酶终点法测定细胞内总胆固醇的含量,原子力显微镜观察细胞膜上小凹结构的变化,Western blot和实时荧光定量PCR检测清道夫受体CD36蛋白和mRNA的表达.结果 与空白对照组相比,siRNA组油红O染色阳性细胞数明显减少,细胞内总胆固醇/总蛋白显著降低(P＜0.01).原子力显微镜下,siRNA干扰整合素β1基因后细胞未见明显的小凹结构.Western blot及荧光定量PCR结果显示siRNA组CD36蛋白和mRNA表达均显著减少(P＜0.01).结论 沉默整合素B1基因能有效减少RAW264.7细胞对ox-LDL的摄取,抑制泡沫细胞的形成,其机制可能与降低清道夫受体CD36的表达和减少细胞膜表面的小凹相关.     

SARS病毒Spike蛋白重组腺病毒疫苗的构建及其免疫学分析

目的构建基于sARS病毒Spike（S）蛋白的重组腺病毒,并对该重组腺病毒进行初步鉴定和免疫学探讨。方法通过全基因合成得到全长S蛋白基因,利用Ad5腺病毒系统构建S蛋白基因的重组腺病毒,采用间接免疫荧光（IFA）试验和蛋白免疫印迹法（Western blot）对S蛋白的表达进行鉴定,再用重组腺病毒免疫小鼠,观察小鼠抗体诱生情况,从而对该重组腺病毒的免疫效果进行初步评价。结果PCR扩增重组腺病毒质粒外源片段,大小为800bp,与预期值一致;Western blot和IFA结果表明,重组腺病毒（rAd-S）表达S蛋白能被马抗SARS血清识别;ELISA检测结果显示,rAd-S能刺激小鼠机体产生抗体。结论重组腺病毒系统成功表达了SARS病毒S蛋白,免疫小鼠产生S蛋白特异的抗体。