抗旋毛虫肌幼虫ES抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备分泌抗旋毛虫肌幼虫排泄分泌(ES)抗原单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株,并对其及分泌的McAb进行鉴定。方法用旋毛虫肌幼虫ES抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌特异性、高滴度McAb的杂交瘤细胞株,制备腹水,进行纯化。ELISA间接法、夹心法和竞争法分别测定McAb滴度、相对亲和力和相加效应,琼脂双扩散试验鉴定免疫球蛋白类型,检测McAb与其他寄生虫抗原的交叉反应。电镜观察杂交瘤细胞超微结构,计数染色体数目及观察杂交瘤细胞分泌McAb的稳定性。结果筛选出2株(B2C12和E11F11)分泌抗旋毛虫肌幼虫ES抗原McAb杂交瘤细胞株。电镜显示,杂交瘤细胞具有肿瘤细胞和浆细胞的特征,胞浆内可见大量分泌颗粒;杂交瘤细胞染色体数目平均为98.6条,均能稳定分泌McAb(属IgM)。B2C12株培养上清液和腹水McAb滴度分别为1∶1280和1∶2.048×104,E11F11株为1∶640和1∶1.024×104,其中前者的相对亲和力较后者稍高。2株McAb识别ES抗原不同的抗原决定簇;且不与其他寄生虫抗原发生交叉反应。结论获得2株抗旋毛虫肌幼虫ES抗原杂交瘤细胞株,均能稳定分泌高滴度、特异性的IgM类McAb,并识别不同的抗原决定簇,为研制旋毛虫病诊断试剂盒和制备基因工程抗体奠定了基础。     

抗旋毛虫单克隆抗体的制备及应用

抗旋毛虫单克隆抗体的制备及应用华西医科大学寄生虫学教研室胡少良，冯瑞元七十年代中期以来，单克隆抗体以其突出特点被迅速地推广到包括寄生虫学在内的许多领域。１９８４年，Ｏｒｔｅｇａ－Ｐｉｅｒｒｅｓ等［１］以及其他学者率先制备了抗旋毛虫单克隆抗体并开始着手...     

抗华支睾吸虫单克隆抗体的制备和鉴定

目的：建立分泌抗华支睾吸虫成虫的单克隆抗体杂交瘤细胞株并进行鉴定。方法：用华支睾吸虫成虫可溶性抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０融合，筛选分泌高滴度单克隆抗体的杂交瘤细胞株，测定单抗免疫球蛋白亚类和单抗效价，检测单抗与日本血吸虫虫卵抗原、卫氏并殖吸虫成虫抗原和猪囊尾蚴抗原的交叉反应，用ＩＦＡＴ进行单抗识别的抗原定位。结果：获得５株分泌高滴度抗华支睾吸虫成虫单抗的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴抗原均不发生交叉反应；５株单抗均属ＩｇＭ；单抗所识别的抗原定位于华支睾吸虫肠管壁。结论：制备的抗华支睾吸虫成虫的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗。     

抗细粒棘球绦虫成虫单克隆抗体的制备及鉴定

目的 建立能分泌与细粒棘球绦虫(简称包虫)成虫特异结合的抗包虫成虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法 用包虫成虫抗原免疫BALB／c小鼠后，获取免疫的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0融合。结果 ELISA方法筛选出1株能持续稳定分泌抗包虫成虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株，1F5E3C9E9D5杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体可以与包虫成虫、棘球蚴结合，与囊液抗原呈边缘性阳性反应，而与泡球蚴EM2抗原呈阴性反应。冻存1个月后复苏，仍能稳定分泌。经免疫组织化学检测发现，该单克隆抗体与棘球蚴的生发层，棘球蚴原头节虫体呈阳性反应。结论 1F5E3C9E9D5是一株稳定的杂交瘤细胞株，所分泌的抗细粒棘球绦虫成虫单克隆抗体在粪抗原的检测方面有应用前景。     

旋毛虫原肌球蛋白的特性分析及原核表达

目的 分析旋毛虫(Trichinella spiralis)的原肌球蛋白(Tropomyosin, TM)特性并制备重组旋毛虫TM蛋白。方法 在NCBI的Nucleotide数据库选取旋毛虫TM (GenBank:AF419300.1),利用在线分析工具分析旋毛虫TM的氨基酸组成、二级/三级结构、疏水性等特性。密码子优化后合成旋毛虫TM(GenBank:AF419300.1)的全长并插入到原核表达载体pET-28a(+),构建重组原核表达质粒pET-28a(+)-TM,转化至BL21(DE3)中,以终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导旋毛虫TM的表达,纯化后采用Western blot法对重组旋毛虫TM蛋白进行鉴定。结果 旋毛虫TM为亲水性不稳定蛋白,二级结构以α-螺旋为主,无复杂的空间结构。构建的重组原核质粒pET-28a(+)-TM经双酶切得到867 bp的基因片段,序列测定后证实重组原核质粒pET-28a(+)-TM构建正确。经IPTG诱导的菌体超声混悬液、离心后上清均检测到相对分子质量约40×10³的目的蛋白,纯化后得到条带单一的旋毛虫TM。West...     

抗华支睾吸虫代谢抗原单克隆抗体的制备及鉴定研究

目的建立分泌抗华支睾吸虫代谢抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株。方法用华支睾吸虫成虫代谢抗原免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0融合，筛选分泌高滴度单克隆抗体的杂交瘤细胞株，测定单抗免疫球蛋白亚类和单抗效价，检测单抗与日本血吸虫全虫可溶性抗原、卫氏并殖吸虫成虫抗原和猪囊尾蚴抗原的交叉反应。结果获得3株分泌高滴度抗华支睾吸虫代谢抗原的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴抗原均不发生交叉反应，3株单抗均属IgG。结论制备的抗华支睾吸虫代谢抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗，为制备免疫诊断试剂盒奠定了基础。     

抗人胰腺癌单克隆抗体的制备及其特性的研究

本实验采用常规细菌融合方法，在PEG作用下，成功地制备了五株能稳定分泌抗人胰腺癌单克隆抗体的杂交瘤。以间接型ELISA方法和ABC技术进行抗体检测，有限稀释法进行克隆。用羟基磷灰石法纯化单克隆抗体（MAb)，所得MAbB6的免疫球蛋白类型为IgG1,它在培养上清及小鼠腹水中的效价分别为1：16和1：2600。MAbB6具有较好的特异性，其所针对的抗原可能为一种胰腺癌细胞胸膜抗原，是一种肿瘤相关性抗原，羟基磷灰石方法是一种比较理想的单克隆抗体提纯方法。     

寄生虫副肌球蛋白的分子免疫学研究进展

副肌球蛋白存在于无脊椎动物,由同源二聚体构成。副肌球蛋白具有多方面的生理作用,是一个重要的显性抗原,具有调节免疫反应的特性。近来,对副肌球蛋白的分子生物学特点和免疫学作用做了较广泛深入的研究。该文将从其分布,作用及分子特征,疫苗的研究,T、B淋巴细胞表位,参与免疫调节等研究进展进行了综述。     

抗旋毛虫成虫单克隆抗体的制备和保护性免疫的初步研究

目的：获得抗旋毛虫成虫的单克隆抗体（单抗）并初步研究其保护性免疫作用，方法：利用杂交瘤技术，用旋毛虫抗原免疫的Balb/c小鼠脾细胞与小鼠骨瘤细胞SP2／0进行细胞融合。用免疫双扩散鉴定单抗亚类，免疫印迹鉴定单抗的特异性。小鼠尾静脉接种单抗进行被动免疫保护实验。结果：建立了1株稳定分泌抗旋毛虫成虫单抗的细胞株，杂交瘤细胞培养上清液效价为1：6400，诱生腹水ELISA效价达1：204800，经鉴定单克隆抗体类型为IgM,可以识别旋毛虫成虫，肌幼虫及新生幼虫，相对分子质量约为40000蛋白，并且不与猪蛔虫，血吸虫，包虫，囊虫抗原发生交叉反应。单抗被动免疫后的减虫率为55．63％，结论：获得1株具种特异性，保护性的单克隆抗体，为筛选能诱导保护性免疫功能的旋毛虫抗原分子提供了有力的工具。     

Ts21基因在旋毛虫不同期虫体的表达及特性的研究

目的观察旋毛虫Ts21基因在不同发育期虫体的表达及其特性。方法应用RT-PCR检测旋毛虫Ts21基因在成虫、新生幼虫、感染后15d的成囊前幼虫及感染后42d的成囊幼虫(肌幼虫)的转录情况;应用抗Ts21重组蛋白血清通过间接荧光抗体试验(IFA)对成囊前幼虫及肌幼虫冰冻切片抗原进行检测。应用抗Ts21重组蛋白血清对旋毛虫肌幼虫粗(可溶性)抗原及排泄分泌(ES)抗原进行Western-blot分析。结果RT-PCR发现旋毛虫成虫与感染后42d肌幼虫均扩增出一条分子量约540bp的特异性条带(Ts21基因目的条带),而新生幼虫与感染后15d成囊前幼虫则未扩增出目的条带;IFA结果表明抗Ts21重组蛋白血清只与感染后42d成囊幼虫抗原发生阳性反应,而不与感染后15d的成囊前幼虫抗原发生阳性反应。Western-blot结果显示抗Ts21重组蛋白血清只与旋毛虫肌幼虫粗抗原和ES抗原中Mr 21 000的单一蛋白条带发生阳性反应。结论旋毛虫Ts21基因的表达具有期特异性,Ts21蛋白是旋毛虫肌幼虫ES抗原中的一部分。     

Comparative dynamics and phenotype of the murine immune response to Trichinella spiralis and Trichinella pseudospiralis

Infection of NIH mice with Trichinella spiralis and Trichinella pseudospiralis results in qualitatively comparable immune responses. Antigen-specific proliferation by mesenteric lymph node cells was transient and temporally associated with intestinal infection, but in contrast was sustained throughout infection by splenocytes. Early cytokine production by mesenteric lymph node cells was dominated by interleukin 10, but also IL-5 and IL-4, with rapid resolution following parasite expulsion from the gut. Splenocytes showed a mixed profile of cytokine production, although again dominated by IL-10 and sustained over 60 days of infection. All antibody classes were evident, with early production of IgA and IgG1, and subsequent secretion of other subclasses including IgG2a. Granulocytic infiltration of the spleen was significantly greater in T. spiralis infection. The concentration of serum corticosterone generally remained within normal boundaries, although was raised by day 60 in T. spiralis-infected mice. We conclude that the systemic suppression of inflammation reported for T. pseudospiralis does not result from selective induction of regulatory cytokines, or a major difference in the immune response to infection with T. spiralis.     

抗旋毛虫鸡卵黄抗体的活性检测

目的制备特异性抗旋毛虫的鸡卵黄免疫球蛋白,研究其免疫应答规律及其稳定性。方法用纯化的旋毛虫幼虫免疫育龄种鸡,经水稀释法初步纯化浓缩后获得卵黄抗体。应用酶联免疫吸附试验检测卵黄抗体的效价及其敏感性和稳定性。结果通过免疫可成功诱导出高效价的抗旋毛虫抗体,效价可达1∶106以上,免疫应答持续时间可达34周以上。免疫后卵黄抗体敏感性和血清抗体敏感性无显著性差异(P>0.05)。稳定性试验表明IgY敏感性高,在pH4～10及温度不超过60℃条件下活性稳定。结论成功制备出高效价的特异性抗旋毛虫卵黄抗体,其敏感性高,有一定的耐热、耐酸碱性,可进一步用于旋毛虫感染的研究。     

合欢皮总皂苷治疗旋毛虫感染小鼠的疗效观察

目的研究合欢皮总皂苷对感染旋毛虫小鼠的治疗效果。方法将36只感染旋毛虫的ICR小鼠随机分为6组(每只小鼠感染300条旋毛虫),每组6只。组Ⅰ-Ⅲ为成虫组:组Ⅰ为感染对照组,组Ⅱ为合欢皮总皂苷治疗组,组Ⅲ为阿苯达唑治疗组;组Ⅳ-Ⅵ为肌幼虫组:组Ⅳ为感染对照组,组Ⅴ为合欢皮总皂苷治疗组,组Ⅵ为阿苯达唑治疗组。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组于感染后第2d开始给药,连续给药3d,于感染后第7d处死,计数小肠内成虫;Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组于感染后第7d开始给药,连续给药14d,于感染后第40d处死,计数肌幼虫并计算减虫率,HE染色计数肌幼虫,免疫组化检测膈肌中IL-1β,IL-6,TNF-α,COX-2因子的表达。结果合欢皮总皂苷和阿苯达唑治疗组成虫数和肌幼虫数均少于感染对照组(P<0.01),成虫减虫率分别为71.60%和81.24%,肌幼虫减虫率分别为65.70%和89.94%;HE染色结果表明两个治疗组囊包幼虫均减少,炎症细胞表达均明显减轻;免疫组化结果显示治疗组IL-1β,IL-6,TNF-α,COX-2的表达降低。结论合欢皮总皂苷对旋毛虫成虫和囊包幼虫均有较好的杀虫效果,虽然效果略次于阿苯达唑,但其作为中药提取物毒性较低。     

旋毛虫5'-nucleotidase基因特征与克隆表达

目的 研究旋毛虫5'-nucleotidase基因的序列结构特征及其蛋白克隆表达。方法 从旋毛虫获得5'-nucleotidase基因的序列,利用生物信息学方法进行系统性分析,并进行原核表达。结果 旋毛虫5'-nucleotidase基因大小为1 653 bp,编码550个氨基酸,119个氨基酸残基组成,理论相对分子质量(Mr)为62 kD,分子式为C₂₈₀₀H₄₃₅₈N₇₄₂O₈₀₃S₂₃,等电点为6.13,属于稳定存在的亲水蛋白质。该蛋白含有21个氨基酸组成的信号肽,同时具有跨膜区域,此外还含有3个N-糖基化位点、2个O-糖基化位点、20个磷酸化位点、28个B细胞线性结合位点和13个T细胞结合位点。二级结构中,α-螺旋占43.27%(238个),伸展链占22.73%(125个),β-折叠占7.82%(43个),无规则卷曲占26.18%(144个)。SDS-PAGE显示,5'-nucleotidase基因在原核表达系统中呈可溶性形式表达,重组蛋白大小约为74 kD。结论 成功克隆了旋毛虫5'-nucleotidase基因,对其进行序列分析和原核表达,为进一步探究5'-nucleotidase蛋白在旋毛虫感染过程中的作用奠定基础。     

Protection against Trichinella spiralis induced by a monoclonal antibody that promotes killing of newborn larvae by granulocytes

Summary Mouse monoclonal antibodies directed against biochemically defined surface antigens of Trichinella spiralis were selected and tested for their ability to destroy parasites in vivo and in vitro. One of these (NIM-M5; IgGl), which recognised a surface component of approximately 64 K molecular weight in newborn larvae (NBL), bound to a surface component of this stage (as shown by fluorescence), and mediated the adherence of rodent eosinophil leucocytes to the surface of living NBL. Following cell adherence mediated by this monoclonal antibody, the worms were killed. This effect was enhanced by fresh normal serum suggesting a role for complement in this phenomenon. A monoclonal antibody directed against a surface component of infective larvae (NIM-M1; IgM) did not promote adherence of cells nor killing of NBL in vitro. The effect of NIM-M5 on the development of NBL to the intramuscular stage was examined. Treatment of NBL with the NIM-M5 monoclonal antibody prior to their injection into mice, together with passive transfer of NIM-M5 for 3 days, significantly reduced (36–51%) the proportion of larvae recovered by digestion 28 days later. Thus a single monoclonal antibody to NBL was able to mediate eosinophil-dependent destruction of worms in vitro and reduce infectivity in vivo. These observations suggest that antibodies capable of mediating eosinophil-induced destruction of nematodes in vitro may also be important in protection against infection.     

旋毛虫成囊前期幼虫的收集

目的 探索旋毛虫成囊前期幼虫的收集时间与方法.方法 20只成年大鼠,每只大鼠经口感染3000条旋毛虫脱囊幼虫,分别于第14、15、16、17、18、19、20天将大鼠处死,用人工胃蛋白酶消化肌肉收集旋毛虫.结果 感染后第14、15、16大膈肌均未见旋毛虫,第17、18、19、20天膈肌有旋毛虫的侵入并逐渐增多;第14、15、16天均未收集到旋毛虫,第17、18、19、20天平均每只大鼠分别收集5000、8000、10000、30000条旋毛虫.结论 旋毛虫在感染后第20天是旋毛虫成囊前期幼虫收集的最佳时期.人工胃蛋白酶消化肌肉可以收集成囊前期幼虫.