中华眼镜蛇毒神经生长因子对PCI2细胞κ阿片受体蛋白质表达的影响

目的 探讨中华眼镜蛇毒(Naja NaBAtra)神经生长因子(nNGF)对PC12细胞κ阿片受体蛋白质表达的影响.方法 PC12细胞分为正常对照组和给药组,采用Western blot方法检测各组PCI2细胞κ阿片受体蛋白质的表达.结果 ①nNGF的25、50、100 μg·L-13个剂量中,50和100μg·L-1nNGF下调PC12细胞κ阿片受体蛋白质的表达,50μg·L-1剂量组下调最明显(P<0.01),100 μg·L-1剂量组下调(P<0.05).②50μg·L-1nNGF分别处理PC12细胞1、3、5、7、10 d后,其κ阿片受体蛋白质表达呈降低趋势,其中d 5、7下调(P<0.05),d 10下调明显(P<0.01).③10μmol·L-1吗啡可上调PC12细胞κ阿片受体蛋白表达,而10 μmol·L-1纳络酮对其无影响,二者分别都能逆转nNGF的下调效应,但是二者共存时不能逆转nNGF的下调效应.结论 nNGF诱导PC12细胞分化中,可引起PC12细胞κ阿片受体蛋白质表达的下调效应,该效应能被吗啡或纳络酮逆转,但二者共存不能被逆转效应.     

脊髓c-Jun在NMDA受体NR2B亚基介导的大鼠吗啡镇痛耐受中的作用

目的探讨脊髓c-Jun在N-甲基-D-天冬氨酸(N-meth-yl-D-aspartate,NMDA)受体NR2B亚基介导的吗啡镇痛耐受中的作用。方法取Sprague-Dawley(SD)成年大鼠连续7 d鞘内注射吗啡10μl(1.5 g.L-1)建立慢性吗啡镇痛耐受模型。应用热水甩尾法测定甩尾潜伏期(疼痛指标)以观察痛反应变化。应用免疫组织化学染色法检测磷酸化c-Jun(p-c-Jun)和总c-Jun(t-c-Jun)的表达。结果鞘内注射吗啡7 d,可激活大鼠脊髓的c-Jun,表现为神经元内p-c-Jun表达升高;鞘内注射NR2B选择性拮抗剂10μl Ro256981(2 g.L-1)可以抑制慢性吗啡镇痛耐受时脊髓神经元c-Jun的激活,并明显拮抗吗啡镇痛耐受的形成。结论脊髓神经元c-Jun的磷酸化参与NMDA受体NR2B亚基介导的吗啡镇痛耐受。     

慢性吗啡处理对C6细胞EAAT3蛋白表达的影响及其机制研究

目的探讨慢性吗啡暴露、戒断、再次暴露对C6细胞兴奋性氨基酸转运蛋白3(excitatory amino-acid transporter 3,EAAT3)蛋白表达的影响及可能机制。方法 0.1～10μmol·L-1吗啡作用于C6细胞不同时间,Western blot检测C6细胞EAAT3蛋白表达水平变化,然后用不含吗啡的培养液培养细胞模拟吗啡自然戒断过程,待EAAT3蛋白表达回升后,再次吗啡暴露(吗啡浓度为第1次给药的1/2)模拟吗啡复吸过程,观察吗啡多次暴露对C6细胞EAAT3蛋白表达的影响。最后在吗啡再次暴露前15 min使用纳洛酮,观察纳洛酮对多次吗啡暴露引起的C6细胞EAAT3表达变化的影响。结果 10μmol·L-1吗啡作用于C6细胞至少48 h可下调C6细胞EAAT3蛋白表达(P<0.05)。停用吗啡至少12 h后,EAAT3蛋白表达回升,5μmol·L-1吗啡再次处理C6细胞4 h即可下调C6细胞EAAT3蛋白表达水平(P<0.05)。1μmol·L-1纳洛酮可明显抑制慢性吗啡处理引起的EAAT3蛋白表达下降(P<0.05)。结论慢性吗啡处理可下调C6细胞EAAT3表达水平,停用吗啡EAAT3表达回升,吗啡再次暴露引起EAAT3表达水平下降所需吗啡浓度降低,暴露时间缩短。吗啡通过作用于阿片受体诱导C6细胞EAAT3表达下降。     

中华眼镜蛇(Naja Naja Atra)毒神经生长因子对PC_(12)细胞κ阿片受体mRNA表达的影响

目的研究眼镜蛇毒神经生长因子(nNGF)对PC12细胞κ阿片受体mRNA表达的影响,探讨nNGF诱导PC12细胞分化的分子机制。方法用RT-PCR方法半定量地考察nNGF及κ阿片受体的一些拮抗剂和激动剂对PC12细胞κ阿片受体mRNA表达的影响。结果(1)在25,50和100 ng/mL 3个nNGF剂量组中,50和100 ng/mL nNGF显著下调PC12细胞κ阿片受体mRNA的表达。(2)50 ng/mL nNGF分别处理PC12细胞1,3,5,7,10 d后,结果显示κ阿片受体mRNA表达随时间有降低的趋势,7 d时显著下调(P<0.05),10 d时特别显著(P<0.01)。(3)10μmol/L吗啡上调PC12细胞κ阿片受体mRNA表达,并能逆转nNGF对该κ阿片受体mRNA表达的下调效应。10μmol/L纳络酮对PC12细胞κ阿片受体的表达无显著影响,也能逆转nNGF对该κ阿片受体mRNA表达的下调效应。但吗啡和纳络酮共存时不能逆转NGF对该κ阿片受体mRNA表达的下调效应。结论nNGF诱导PC12细胞分化时,能下调其κ阿片受体mRNA表达,这种下调能分别被吗啡或纳络酮逆转,但不能被吗啡和纳络酮共存时逆转。     

孕酮对大鼠大脑皮质神经元氨基酸受体亚单位GBR1和NR2B表达的影响

目的:研究孕酮(PROG)对大鼠大脑皮质神经元氨基酸受体亚单位GBR1和NR2B表达的影响。方法:不同剂量(1,10,100μmol.L-1)的孕酮处理原代培养的大鼠大脑皮质神经元,采用免疫细胞化学法测定神经元氨基酸受体亚单位GBR1和NR2B表达的变化。结果:与对照组相比,1,10,100μmol.L-1 PROG使GBR1表达分别增加45.9%、172.0%、211.6%(P<0.01),使NR2B表达分别增加42.1%、51.4%、88.4%(P<0.05或P<0.01)。结论:孕酮可增强氨基酸受体亚单位GBR1和NR2B的表达水平。     

吗啡对μ阿片受体介导的ERK磷酸化的影响

目的：利用表达μ阿片受体的中国仓鼠卵巢细胞,研究吗啡急慢性处理下对细胞外信号调节激酶（ ERK）磷酸化的影响。方法免疫印迹检测磷酸化ERK水平,获取1 h急性处理的ERK磷酸化变化时程和36 h慢性处理以及纳洛酮催促下的ERK磷酸化变化。结果1μmol·L-1吗啡可以快速诱导ERK磷酸化水平短暂升高,5 min时达峰（ P〈0.01）,吗啡诱导的ERK磷酸化水平升高具有显著的浓度依赖性。10μmol·L-1吗啡慢性处理36 h后ERK磷酸化水平与对照组比较,差异无统计学意义,但纳洛酮急性催促5或10 min均导致ERK磷酸化显著下降（与对照比较,P〈0.01）。结论吗啡急慢性刺激下以及纳洛酮催促下ERK磷酸化表现出不同的变化形式,提示μ阿片受体介导下ERK相关的信号通路发生了代偿。     

胍丁胺对吗啡长期处理引起的NMDA受体蛋白表达改变的影响

目的:观察胍丁胺对吗啡长期处理引起的NMDA受体蛋白改变的影响。方法:采用吗啡递增给药制备大鼠慢性依赖模型,并观察依赖状态下大鼠海马和伏隔核NMDA受体NR1和NR2B亚基蛋白表达量的变化,以及胍丁胺对吗啡作用的影响。结果:与对照组相比,吗啡慢性处理大鼠在纳洛酮催促下能出现典型的戒断综合征,提示依赖模型建立成功。用免疫印记(Western blotting)技术发现,海马部位的NR2B亚基明显下调,而NR1亚基未见显著性变化;吗啡慢性处理不引起伏隔核NR2B亚基的明显变化,但NR1亚基却显著上调。胍丁胺与吗啡伴随给药能逆转吗啡对两脑区NMDA受体蛋白表达的调节作用。结论:胍丁胺调节阿片依赖可能与其逆转吗啡对NMDA受体亚基数量和构成的调节有关。     

二烯丙三硫对人前列腺癌PC-3细胞生物学行为的影响及与uPA系统关系的初探

目的:研究二烯丙三硫(DATS)对人前列腺癌PC-3细胞生物学行为的影响及对尿激酶型纤溶酶激活物(uPA)系统的调节作用。方法:细胞增殖活性(MTS)比色法测定20、40、60μmol·L-1DATS处理前列腺癌PC-3细胞24、48、72h后PC-3细胞的增殖能力;细胞体外侵袭试验检测20、40、60μmol·L-1DATS对PC-3细胞侵袭能力的作用;划痕试验观察40μmol·L-1DATS处理PC-3细胞24h后PC-3细胞迁移能力;逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白印迹(Western blot)法分别检测40μmol·L-1DATS作用PC-3细胞后的uPA、uPAR和PAI-1的mRNA及其蛋白表达水平。结果:20、40、60μmol·L-1DATS对PC-3细胞的生长均有较明显的抑制作用,且呈浓度和时间依赖性;DATS呈浓度依赖抑制细胞的浸润能力,其中40μmol·L-1与体内试验更接近;40μmol·L-1DATS明显抑制细胞的迁移能力,并在mRNA和蛋白水平上,显著上调PAI-1的表达,但对uPA和uPAR的表达无显著影响。结论:DATS抑制PC-3细胞的增殖、浸润和迁移,该效应可能与DATS显著上调PAI-1的表达有关系。     

中华眼镜蛇毒神经生长因子对PCI2细胞K阿片受体蛋白质表达的影响

目的探讨中华眼镜蛇毒（NajaNajaAtra）神经生长因子（nNGF）对PCI2细胞K阿片受体蛋白质表达的影响。方法PCI2细胞分为正常对照组和给药组,采用Westernblot方法检测各组PCI2细胞K阿片受体蛋白质的表达。结果①nNGF的25、50、100μg&#183;L-1 3个剂量中,50和100μg&#183;L-1 nNGF下调PCI2细胞K阿片受体蛋白质的表达,50μg&#183;L-1 剂量组下调最明显（P〈0．01）,100μg&#183;L-1 剂量组下调（P〈0．05）。②50μg&#183;L-1 nNGF分别处理PCI2细胞1、3、5、7、10d后,其一（阿片受体蛋白质表达呈降低趋势,其中d5、7下调（P〈0．05）,d10下调明显（P〈0．01）。③10μg&#183;L-1 吗啡可上调PCI2细胞K阿片受体蛋白表达,而10μg&#183;L-1 纳络酮对其无影响,二者分别都能逆转nNGF的下调效应,但是二者共存时不能逆转nNGF的下调效应。结论nNGF诱导PCI2细胞分化中,可引起PCI2细胞K阿片受体蛋白质表达的下调效应,该效应能被吗啡或纳络酮逆转,但二者共存不能被逆转效应。     

脱氢表雄酮对大鼠大脑皮质神经元氨基酸受体亚单位NR2B和GBR1表达的影响

目的研究脱氢表雄酮(DHEA)对大鼠大脑皮质神经元氨基酸受体亚单位NR2B和GBR1表达的影响。方法不同剂量(1、10、100μmol.L-1)的DHEA处理原代培养的大鼠大脑皮质神经元,采用免疫细胞化学法测定神经元氨基酸受体亚单位NR2B和GBR1表达的变化。结果与对照组相比,低、中、高剂量DHEA使NR2B表达分别增加15.6%、19.9%、49.4%(P<0.05或P<0.01);使GBR1表达分别增加4.3%(P>0.05)、14.5%、58.5%(P<0.05或P<0.01)。结论DHEA可增强氨基酸受体亚单位NR2B和GBR1的表达水平。     

半胱氨酰白三烯受体1参与鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的调节

目的观察半胱氨酰白三烯受体1(CysLT1受体)与鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的关系。方法鱼藤酮及CysLT1受体拮抗剂孟鲁司特处理PC12细胞后,以MTT方法检测PC12细胞活性变化;以Western blotting检测鱼藤酮处理前后,PC12细胞CysLT1受体的表达变化;不同浓度鱼藤酮处理24 h及3μmol·L-1鱼藤酮处理不同时间,以免疫细胞化学方法观察CysLT1受体分布变化。结果鱼藤酮(0.3～30μmol·L-1)可诱导PC12细胞损伤,孟鲁司特1和5μmol·L-1可显著减轻鱼藤酮诱导的细胞损伤。鱼藤酮(1～10μmol·L-1)作用PC12细胞24 h及鱼藤酮3μmol·L-1处理3 h和24 h,均可诱导CysLT 1受体蛋白水平表达升高。鱼藤酮能浓度和时间依赖性引起CysLT1受体从细胞核移位到细胞浆。结论 CysLT1受体参与鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤。     

吗啡对体外培养的人乳腺细胞雌激素受体mRNA表达的影响

目的：研究吗啡对雌激素诱导的体外培养人的正常乳腺细胞的雌激素受体（ER）mRNA表达的影响。方法：购买人正常乳腺纤维细胞株进行培养，给予17-β雌二醇（E2），吗啡（Mor）及纳洛酮干预。通过RT—PCR的方法半定量分析吗啡对正常乳腺细胞ER mRNA表达的影响。结果：ER与内参照B—actin分别在249 bp和270 bp处出现特征性条带。雌激素组、吗啡组与对照组比较，差异有显著性（P〈0．05），E2＋Mor组与对照组比较，差异无显著性（P〉0．05）。吗啡作用24h呈剂量依赖性抑制乳腺细胞ERmRNA的表达，3组吗啡的终浓度分别为1×10^-6mol／L、1×10^-5mol／L、1×10^-4 mol／L，差异有显著性（P〈0，05）。结论：从mRNA水平证明了外源性阿片类药物吗啡可直接影响雌激素对乳腺的促增殖作用，同时还可剂量依赖性下调雌激素受体mRNA的表达。     

姜黄素对前列腺癌PC-3M细胞抗侵袭作用的研究

为探讨姜黄素对前列腺癌PC-3M细胞抗侵袭作用,将0～40μmol/L姜黄素分别处理PC-3M细胞24h后,Westernblot法检测MMP-2和TIMP-2蛋白表达,免疫组化SP法检测细胞内NF-κB蛋白的表达水平。结果表明,姜黄素可下调MMP-2和上调TMP-2的表达,抑制NF-κB的表达。结论：姜黄素通过下调MMP-2和上调TIMP-2的蛋白表达发挥抗侵袭作用,抑制NF-κB的表达可能是抗侵袭作用的机制之一。     

代森锰锌对PC-12细胞凋亡的影响

目的探讨代森锰锌对PC-12细胞凋亡的影响及其机制。方法 采用体外细胞培养方法,PC-12细胞加入代森锰锌0,1,10,30,60和120μmol.L-1,培养24h后,应用WST-8法检测PC-12细胞增殖;PC-12细胞中加入代森锰锌0,1,30和120μmol.L-1,培养24h后,流式细胞术FITC-AnnexinⅤ/PI双染检测细胞凋亡率;Hoechst33258染色及倒置荧光显微镜观察细胞形态学改变;Western印迹法检测Bcl-2和Bax的表达以及ERK蛋白磷酸化水平。结果与正常对照组相比,随着代森锰锌浓度增加,代森锰锌组晚期凋亡率升高,呈浓度依赖关系,IC50为49.95μmol.L-1。代森锰锌120μmol.L-1组细胞晚期凋亡率为(90±4)%(P<0.05);Hoechst33258染色可见细胞核膨大、染色质边集浓染等凋亡特征;与正常对照组相比,Bcl-2逐渐降低,Bax和p-ERK1/2表达增高(P<0.05),代森锰锌120μmol.L-1组p-ERK1/2积分吸光度分别为128.0±2.5和178.4±4.0。结论代森锰锌能够诱导PC-12细胞凋亡,ERK信号通路可能在此过程中发挥作用。     

活性氧激活的ERK1/2通路在化学性缺氧损伤PC12细胞中的作用

目的探讨胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)在化学性缺氧损伤PC12细胞中的作用。方法应用化学性低氧模拟剂氯化钴(CoCl2)处理PC12细胞建立化学性缺氧损伤模型。应用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)比色法检测细胞存活率;罗丹明123(Rh123)染色荧光显微镜照像检测线粒体膜电位(MMP);流式细胞术检测凋亡细胞百分比;Western blot法测定caspase-3、ERK1/2和p38MAPK蛋白的表达水平。结果应用600μmol.L-1处理PC12细胞60 min可使磷酸化(p)ERK1/2的表达明显升高;在600μmol.L-1CoCl2处理PC12细胞前,应用500μmol.L-1N-乙酰半胱氨酸(NAC,为活性氧的清除剂)预处理1 h可抑制CoCl2对p-ERK1/2表达的上调作用;在600μmol.L-1CoCl2处理PC12细胞前,应用10μmol.L-1U0126(ERK1/2抑制剂)预处理2 h可保护PC12细胞对抗CoCl2引起的损伤,使细胞存活率升高,凋亡细胞数目和cleaved caspase-3表达及线粒体膜电位(MMP)丢失均减少;10μmol.L-1U0126预处理还能抑制CoCl2对p-p38MAPK表达的上调作用。此外,应用20μmol.L-1SB203580(p38MAPK抑制剂)预处理能抑制CoCl2对p-ERK1/2表达的上调作用。结论活性氧激活的ERK1/2通路介导CoCl2对PC12细胞的损伤作用,并与p38MAPK通路存在相互的的激活作用。     

八肽胆囊收缩素对抗吗啡抑制大鼠脑突触小体钙摄取的作用

用大鼠脑的膜制备观察吗啡和CCK-8对突触小体摄取~(45)Ca~(2+)的影响。吗啡(10 nmol/L～1μmo1/L)抑制突触小体对~(45)Ca的摄取,该作用能被1μmol/L纳洛酮完全阻断。CCK-8(10nmol/L～1μmol/L)本身能抑制突触小体~(45)Ca摄取,但它在10nmol/L和100 nmol/L时能对抗吗啡对~(45)Ca摄取的抑制作用,浓度提高到1μmol则不能对抗吗啡的这一作用。CCK-8抑制突触小体摄取~(45)Ca,以及对抗吗啡的~(45)Ca摄取抑制的作用,皆能被CCK受体拮抗剂丙谷酰胺(2μmol/L)所阻断.捉示CCK-8是通过激动CCK受体而拮抗吗啡抑制~(45)Ca摄取的,CCK-8的这一拮抗作用可能是其抗阿片作用的机理之一.     

吗啡对原代培养大鼠海马神经元CCK受体mRNA表达的影响

目的探讨原代培养大鼠海马神经元上胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)受体CCK-AR及CCK-BR mRNA表达及吗啡对其表达的影响。方法采用新生大鼠海马神经元无血清原代培养技术,用吗啡(100μmol·L-1培养基)孵育3,6,12,18,24,36,48,72h,以及采用不同浓度吗啡(10,100,150μmol·L-1)孵育6、30h后,RT-PCR及测序方法观察CCK-AR及CCK-BR mRNA表达及吗啡对其表达的影响。结果RT-PCR结果显示,CCK-AR和CCK-BR mRNA在原代大鼠海马神经元上均有表达;CCK-AR mRNA RT-PCR扩增产物为218bp,CCK-BR mRNA RT-PCR扩增产物为444bp,经测序证实结果的可靠性;CCK-BR mRNA的表达量明显高于CCK-AR。吗啡作用后可使2种CCK受体mRNA表达上调。吗啡浓度及作用时间的不同对CCK-AR和CCK-BRmRNA表达的影响不同。结论原代大鼠海马神经元上有CCK-AR和CCK-BR,以CCK-BR为主;吗啡可使2种CCK受体mRNA表达上调。     

氯胺酮对HepG2细胞线粒体功能的影响

目的评价氯胺酮的线粒体毒性,从而探讨氯胺酮可能的毒性机制。方法 Hep G2细胞培养基中分别加入齐多夫定10~2000μmol·L-1培养7 d,或加入氯胺酮50~3000μmol·L-1培养24 h,CCK8细胞计数法测定细胞存活率。Hep G2细胞培养基中分别加入齐多夫定100μmol·L-1培养7 d后,或加入氯胺酮100和1200μmol·L-1培养24 h,化学发光法检测胞内ATP合成水平,荧光探针法检测胞内钙离子浓度、活性氧及线粒体膜电位(ΔΨm)的变化,同时设齐多夫定1000μmol·L-1用于实时荧光定量PCR检测线粒体DNA(mt DNA)表达水平的变化。结果与正常对照组相比,齐多夫定10~2000μmol·L-1可以抑制细胞存活,IC50为100μmol·L-1;氯胺酮1000~3000μmol·L-1抑制细胞存活,IC50为1200μmol·L-1。与正常对照组相比,齐多夫定100μmol·L-1组线粒体ATP合成水平显著下降(P<0.05),胞内钙离子浓度明显升高(P<0.05),活性氧水平显著升高(P<0.05),ΔΨm显著下降(P<0.05),而1000μmol·L-1可以明显干扰mt DNA表达水平(P<0.05)。氯胺酮100μmol·L-1组ATP合成水平明显下降(P<0.05),其他指标均无显著性差异;氯胺酮1200μmol·L-1组ATP合成水平显著下降(P<0.01),活性氧水平和胞内钙离子浓度显著升高(P<0.01),ΔΨm显著下降(P<0.05),mt DNA水平无明显改变。结论氯胺酮可以通过干扰线粒体代谢功能而诱导线粒体损伤。     

补骨脂素对H2O2诱导PC-12细胞损伤的保护作用

目的探讨补骨脂素对H_2O_2诱导PC-12细胞氧化损伤的保护作用,并考察其作用机制。方法 PC-12细胞分为对照组、模型组、Tempol组和补骨脂素组。对照组中未加入补骨脂素和H_2O_2;模型组中加入400μmol/L H_2O_2;Tempol组中加入100μmol/L Tempol及400μmol/L H_2O_2;补骨脂素组中加入400μmol/L H_2O_2及1、5、10、20μmol/L补骨脂素。CCK-8法测定PC-12细胞的存活率,考察对PC-12细胞形态的影响,PI/Annexin-V、Hoechst染色检测细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测凋亡蛋白表达。结果 5、10、20μmol/L补骨脂素均可以显著提高PC-12细胞内的吸光度值(P0.01),细胞存活率提高较明显,与模型组比较差异具有统计学意义(P0.05)。补骨脂素1、5、10、20μmol/L组凋亡率明显低于模型组(P0.05),并且随着补骨脂素浓度的增加,PC-12细胞的凋亡率逐渐下降。随着补骨脂素作用时间的增加,各组PC-12细胞凋亡率的增加幅度相近,但明显低于模型组(P0.05)。随着补骨脂素浓度的增加,对磷酸化Bad、Bcl-XL水平的上调作用越明显。结论补骨脂素对H_2O_2诱导PC-12细胞损伤具有保护作用,其作用机制是通过上调磷酸化Bad和Bcl-XL表达来抑制细胞凋亡。     

咪唑啉受体及其对阿片药理作用的调节机制

用稳定转染咪唑啉1型受体(I1R)的细胞(CHO-I1),对I1R信号转导途径进行了初步研究。首次直接证实I1R的信号转导途径与活化PC-PLC继而产生DAG,其后引起丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)酶促级联反应过程有关。采用共同稳定表达μ阿片受体(MOR)和I1R的CHO细胞表达系统(CHO-μ/I1细胞),对I1R在受体后水平抑制吗啡依赖的可能分子机制进行了研究。首次提供了胍丁胺通过作用于I1R而抑制吗啡依赖的直接实验证据,其分子机制可能主要是胍丁胺激活I1R抑制吗啡慢性处理时cAMP通路和Ca2+信号通路代偿性适应而抑制吗啡依赖的形成。