表皮生长因子受体对支气管哮喘小鼠气道黏液分泌的影响及机制

目的 探讨支气管哮喘(简称哮喘)小鼠气道黏液分泌与表皮生长因子受体(EGFR)、转化生长因子α(TGF-α)的关系以及表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(AG1478)的干预作用.方法 32只小鼠随机分为4组:正常对照组、哮喘模型组、AG1478组和地塞米松干预组.建立哮喘小鼠模型,对肺组织切片行过碘酸雪夫染色显示气道黏膜杯状细胞的增生情况.应用免疫组织化学方法检测TGF-α的蛋白及RT-PCR方法检测EGFR mRNA表达的变化.结果 哮喘组出现气道壁增厚、杯状细胞增多、黏液分泌增加,EGFR、TGF-α水平增高.地塞米松组和AG1478组较哮喘组均有所改善,EGFR、TGF-α表达降低(P<0.05).结论 EGFR、TGF-α参与哮喘小鼠气道黏液分泌过程,AG1478可抑制气道黏液分泌.AG1478可能通过下调EGFR、TGF-α的表达以及抑制依赖于EGFR下游的细胞信号转导级联反应来发挥其效应.     

干预支气管哮喘小鼠气道黏液高分泌的研究

目的 探讨表皮生长因子受体（EGFR）阻滞剂吉非替尼抑制支气管哮喘小鼠气道黏液高分泌的作用.方法 将BALB/c小鼠随机分为正常对照组、哮喘组和吉非替尼治疗组（干预组）.采用苏木精-伊红（HE）染色法、过碘酸-雪夫（PAS）特殊染色法、免疫组化法、原位末端转移酶标记法分别检测各组小鼠气道炎症及杯状细胞的数量和黏液分泌、p-EGFR蛋白表达、细胞凋亡等状况,western blot法检测各组小鼠肺组织中p-EGFR变化.结果 与正常组相比,哮喘组小鼠出现典型的哮喘激发症状,肺组织中出现明显的以淋巴细胞和嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞浸润等病理改变;哮喘组小鼠小气道杯状细胞数显著增加,干预组数量明显减少,差异具有统计学意义（P均＜0.05）;与哮喘组相比,干预组小气道中p-EGFR阳性、Bcl-2阳性杯状细胞数量分别显著减少,细胞凋亡、Bax阳性杯状细胞数量分别显著增加,差异具有统计学意义（P均＜0.05）.结论 吉非替尼可抑制支气管哮喘小鼠气道黏液高分泌,其机制可能足阻滞EGFR通路,抑制黏液分泌的同时,诱导分泌黏液的杯状细胞凋亡.     

转化生长因子α对小鼠气道平滑肌细胞的促增殖作用

目的 探讨转化生长因子α(transforming growth factog alphg,TGF-α)对小鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMC)促增殖作用及其机制.方法 用四唑盐(MTT)比色法和3H-TdR掺人法测定加入TGF-α后小鼠ASMC的增殖情况.本实验采用3H-TdR掺入法和MTT比色法观察选择性表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(AG1478)、EGFR中和抗体225(225mAb)、MEK抑制剂(U0126)、PI-3K抑制剂(Wonmannin)对加入TGF-α后促ASMC增殖的影响.通过Western Blot方法测定加入TGF-α及加用AG1478、225mAb后ASMC磷酸化EGFR蛋白表达.结果 用MTT比色法和3H-TdR掺入法测定ASMC培养液中加入TGF-α后ASMC增殖情况比对照组明显增加.加入AG1478、225mAb、U0126、Wortmannin可抑制TGF-α促ASMC增殖作用(P＜0.01).经Western Blot检测,TGF-α引起ASMC磷酸化EGFR蛋白表达增高.AG1478、225mAb抑制TGF-α所致ASMC磷酸化EGFR蛋白表达的增加(P＜0.01).结论 TGF-α激活EGFR为磷酸化EGFR,从而通过:①ras-raf-MEK-erk/MAPK途径;②PI3K-PKC-IKK途径;促进体外培养的小鼠ASMC的增殖.     

表皮生长因子受体在气道粘蛋白合成中的调节作用

粘蛋白的质与量决定了气道粘液的理化特性，对于维持正常的气道粘液纤毛清除功能发挥着重要作用。多种刺激因素可引起表皮生长因子受体（EGFR）活化，导致气道上皮细胞粘蛋白合成增加和杯状细胞化生。选择性EGFR抑制剂能够抑制气道粘蛋白生成和杯状细胞化生，在气道高分泌性疾病中具有潜在的治疗作用。     

茶黄素和表皮生长因子受体对气道黏液分泌的影响

目的 探讨茶黄素对炎症反应时气道上皮细胞黏液分泌的影响.方法 通过人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)刺激人肺腺癌细胞A549,构建炎症反应时气道黏液高分泌模型,以茶黄素和表皮生长因子受体(EGFR)阻断剂表皮生长因子受体阻断剂(AG1478)进行干预,观察黏蛋白5AC(MUCSAC)、EGFR、磷酸化EGFR(P-EGFR)、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(P-ERK1/2)、兔抗磷酸化p38(P-p38)及磷酸化JNK丝裂原活化蛋白激酶(P-JNK)的表达.用四甲基偶氮唑盐法测定细胞活性,再将A549细胞分为对照组、HNE处理组、茶黄素组、AG1478组和茶黄素+AG1478组.用逆转录PCR方法检测各组MUC5AC mRNA、EGFR mRNA的变化;Western blot法检测EGFR、P-EGFR、P-ERK1/2、P-p38和P-JNK蛋白的表达;酶联免疫吸附测定法观察MUCSAC蛋白表达的变化,并用细胞免疫激光共聚焦显微镜观察作用前后黏蛋白的分布.两样本均数间比较采用t检验,多样本均数间比较采用单因素方差分析.结果 HNE处理组MUC5AC的mRNA和蛋白的积分吸光度值分别为0.99±0.03和(169±6)μg/mg,EGFR mRNA和蛋白表达的积分吸光度值分别为0.98±0.02和(0.89±0.03)μg/mg,均较对照组[0.53±0.02、(105±4)μg/mg和0.61±0.11、0.21±0.05]明显升高;P-EGFR、P-ERK1/2的蛋白表达也较对照组显著增加,而P-p38的表达则有较低幅度的增强,P-JNK无明显变化.给予茶黄素及AG1478预处理后,与HNE刺激组相比,EGFR、P-EGFR、P-ERK1/2、P-p38均明显下调,P-JNK无相应改变;而茶黄素+AG1478组MUCSAC mRNA和MUC5AC的下调较单独用茶黄素或AG1478处理更为明显,其积分吸光度值分别为0.20±0.02和(125±3)μg/mg,差异均有统计学意义(t值分别为3.02和1405.94,均P<0.05).结论 茶黄素可通过下调EGFR水平、减少EGFR的活化、部分阻遏EGFR信号转导途径及细胞外信号调节激酶来实现对下游途径的影响,从而发挥茶黄素抑制炎性气道黏液高分泌形成的作用.     

表皮生长因子受体在气道粘蛋白合成中的调节作用

粘蛋白的质与量决定了气道粘液的理化特性 ,对于维持正常的气道粘液纤毛清除功能发挥着重要作用。多种刺激因素可引起表皮生长因子受体 (EGFR)活化 ,导致气道上皮细胞粘蛋白合成增加和杯状细胞化生。选择性EGFR抑制剂能够抑制气道粘蛋白生成和杯状细胞化生 ,在气道高分泌性疾病中具有潜在的治疗作用     

致敏大鼠气道黏液异常分泌与生长因子受体信号调节

目的探讨致敏大鼠黏液高分泌与转化生长因子α(transfroming growth factor-α,TGF-α)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)通路之间的关系。方法应用析因设计方法,随机将大鼠分为12组,每组4只。采用卵蛋白(OVA)腹腔注射加雾化吸入致敏;HE染色和AB-PAS染色测定杯状细胞化生/增生(GCH/GCM)指数;免疫组织化学检测支气管上皮细胞MUC5AC蛋白和EGFR蛋白表达水平;放射免疫方法检测血清中TGF-α。结果①哮喘气道上皮杯状细胞增生肥大,大量黏液形成,小气道内有黏液栓形成。MUC5AC蛋白表达和GCH指数明显增高,呈动态演变。且与EGFR蛋白表达和血清TGF-α水平呈正相关。②析因分析表明,不同处理因素,MUC5AC蛋白表达、GCH/GCM指数、EGFR蛋白表达和血清TGF-α水平差异有统计学意义(P<0.01),MUC5AC除外。不同的处理时间,MUC5AC蛋白表达、GCH/GCM指数、EGFR蛋白表达和血清TGF-α水平差异有统计学意义(P<0.01)。处理因素和处理时间有交互作用(P>0.05)。结论哮喘组MUC5AC蛋白表达和GCH/GCM指数明显增高,且随着激发时间呈动态演变。Genistein通过抑制EGFR通路活性降低MUC5AC高表达和GCH/GCM指数。     

酪氨酸激酶抑制剂对气道上皮修复的影响

近年来气道上皮损伤及炎症后修复在参与急性肺损伤及支气管哮喘(简称哮喘)气道炎症中的作用已引起重视，我们通过观察特异性酪氨酸激酶抑制剂Tyrphostin AG1478对大鼠气管上皮细胞修复的影响，了解其对表皮生长因子受体(EGFR)的拮抗作用。     

TGF-β1在哮喘小鼠气道组织中的表达及吡非尼酮的干预作用

目的 观察TGF-β1致支气管哮喘（简称哮喘）小鼠气道黏液高分泌的机制及吡非尼酮的干预作用.方法 选择45只BALB/c雌性小鼠,按随机数字法分为5组：正常对照组（A组,9只）、哮喘组（B组,9只）、哮喘/强的松干预组（C组,9只）、哮喘/吡非尼酮干预组（D组,9只）、哮喘/羧甲基纤维素钠组（E组,9只）.除A组用生理盐水致敏和激发外,其余各组均于第0、10天用0.1 mL鸡卵清蛋白（OVA）和氢氧化铝凝胶混合液致敏,第14天开始每天用1％ OVA激发30 min,连续激发7d.每次激发前1h用药物干预,给药途径灌胃给药.测定支气管肺泡灌洗液（BALF）中炎症细胞总数和细胞分类计数,以及IL-4和TNF-α水平;采用AB-PAS对气道杯状细胞进行染色,用免疫组织化学法检测气道Muc5ac和肺组织中的TGF-β1蛋白表达.结果 C组BALF中的炎症细胞总数、嗜酸细胞和淋巴细胞分类组、IL-4、TNF-α水平,气道杯状细胞及气道Muc5 ac蛋白较B组明显减低（P均＜0.01）,但两组肺组织中的TGF-β1水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）.D组BALF中的TNF-α、IL-4水平,气道杯状细胞及Muc5ac和TGF-β1蛋白表达显著低于A组（P均＜0.01）.结论 TGF-β1在哮喘小鼠肺组织中的表达明显增加,其变化与气道Muc5ac蛋白表达密切相关;吡非尼酮能有效抑制肺组织TGF-β1表达而降低气道黏液高分泌;提示TGF-β1在哮喘气道黏液高分泌中可能起重要作用.     

表皮生长因子受体与气道黏液高分泌

黏液高分泌是慢性气道炎症性疾病的重要病理特征之一,也是患者病情加剧恶化的重要因素.表皮生长因子受体(EGFR)是一种受体酪氨酸激酶(RTK),在气道黏液高分泌的信号转导通路中居于中心地位,各种炎性介质、病原微生物及其产物、活性氧等可通过多种信号转导通路活化EGFR,活化相关转录因子引起黏蛋白5AC基因表达上调.明确EGFR上下游信号通路势必对慢性气道炎症性疾病的防治提供指导.     

TIM-1对卵蛋白致敏小鼠肺组织黏蛋白SAC及T—bet表达的影响

目的研究T细胞免疫球蛋白-黏蛋白1（TcellIgandmucin-1,TIM-1）对支气管哮喘（简称哮喘）小鼠肺组织黏蛋白（mucin5AC,MUC5AC）及T—bet表达的影响,探讨TIM-1参与气道黏液高分泌的机制。方法卵蛋白（ovalbumin,0VA）腹腔注射致敏小鼠,随机分为正常对照组、哮喘组和哮喘＋TIM-1抗体处理组（TIM—1组）,每组10只。检测小鼠外周血单个核细胞（PBMCs）TIM-1＋细胞比例,实时RT—PCR检测小鼠肺组织MUC5ACmRNA及T-betmRNA表达变化。结果①哮喘组及TIM-1组小鼠外周血PBMCs中TIM-1＋细胞比例分别为（13．15％和7．42％）,均高于正常对照组（1．12％）（P〈O．01）,且TIM-1组低于哮喘组（P〈0．01）;②与对照组小鼠肺组织表达MUC5ACrnRNA（0．223±0．017）相比,哮喘组（1．121士0．082）及TIM-1组（O．771±0．040）表达明显增多（Pd0．01）,且TIM-1组小鼠肺组织表达MUC5ACmRNA较哮喘组降低（Pd0．01）;③哮喘组及TIM-1组小鼠肺组织表达rr-betrnRNA分别为（O．187±0．011）及（O．689±0．057）,较对照组降低（1．001±0．085）（P〈0．01）,而与哮喘组相比,TIM-1组表达有所增多（Pd0．01）;④TIM—1＋细胞比例与MUC5ACmRNA表达比例呈正相关（r1=0．918,P〈0．01）,而与T—bet1TIRNA表达呈负相关（r2=-0．958,P〈0．01）。结论抑制TIM-1表达可通过增强T-betmRNA表达,减少气道MUC5ACmRNA表达,调控气道黏液分泌。     

地塞米松对哮喘大鼠气道重建、肥大细胞及IL-10的影响

目的观察地塞米松对哮喘大鼠模型气道重建和肺组织肥大细胞、IL-10的影响,探讨地塞米松在气道炎症和气道重塑中的作用机制,为临床治疗提供依据。方法采用卵白蛋白（OVA）腹腔注射致敏和雾化吸入激发建立哮喘大鼠模型,30只SD大鼠随机分为3组,正常对照组（A）、哮喘组（B）、地塞米松干预组（C）,每组10只。对肺组织切片行苏木精-伊红（HE）染色观察气道重塑情况。采用免疫组化和图像分析技术测定各组大鼠肺组织肥大细胞、IL-10的表达。结果哮喘组动物出现管壁增厚、平滑肌增生、黏液分泌增加等气道重塑的特征性改变,免疫组化染色显示气道各层细胞及炎性细胞均有IL-10表达减少。地塞米松干预组与哮喘组比较,炎症反应轻微,平滑肌增生、黏液分泌不明显,免疫组化染色显示各类细胞IL-10表达增高,与对照组比较差异有统计学意义。结论长期吸入变应原可导致气道重塑,肥大细胞、IL-10在气道重塑中发挥重要作用,地塞米松可通过抑制肥大细胞脱颗粒、增加IL-10表达发挥抑制炎症作用,进而缓解哮喘大鼠气道重塑的发生。     

Relationship of epidermal growth factor receptors to goblet cell production in human bronchi

To determine the relationship of epidermal growth factor receptor (EGFR) expression to mucin synthesis in human airways, we examined EGFR and MUC5AC expression at both gene and protein levels using in situ hybridization and immunohistochemical analysis in human bronchi. Bronchial mucosal biopsy specimens were obtained from 12 asthmatic subjects and 11 healthy subjects. In asthmatic airways, EGFR mRNA was expressed in the airway epithelium. EGFR immunoreactivity staining patterns varied among the asthmatic airways: staining was positive mainly in goblet cells, in basal cells, or in both. In contrast, healthy airways showed little expression of EGFR mRNA; EGFR immunoreactivity was observed mainly in goblet cells. In parallel to EGFR expression, MUC5AC mRNA expression was greater in asthmatic airways; mucous glycoconjugates that stained positively with Alcian blue/PAS were also increased in asthmatic airways. Ciliated cells were negative for EGFR and MUC5AC both in asthmatic and in healthy subjects at both mRNA and protein levels. There was a significant positive correlation between EGFR immunoreactivity and the area of MUC5AC-positive staining in both asthmatics and healthy subjects. These findings suggest a sequence of events by which EGFR activation is involved in mucin expression in asthmatic airway epithelium.     

蓝玉簪颗粒抑制慢性支气管哮喘小鼠气道黏液高分泌及Bcl-2表达

目的观察蓝玉簪颗粒对慢性支气管哮喘（简称哮喘）小鼠气道上皮杯状细胞化生及黏液高分泌的抑制作用并探讨其机制。方法32只BABL／C小鼠随机分成正常对照组（A组）、慢性哮喘模型组（B组）、蓝玉簪颗粒组（C组,0．33g生药／kg体质量）和地塞米松干预组（D组,2．0mg／kg体质量）,每组8只。卵白蛋白腹腔注射致敏并长期雾化吸入制备小鼠慢性哮喘模型。阿尔辛蓝-过碘酸-希夫（AB-PAS）染色观察气道上皮杯状细胞增生、黏液分泌情况,免疫组织化学半定量法测定气道壁Bcl-2含量。计算机图象分析软件测定气道壁Bcl-2、AB-PAS染色阳性面积和气道上皮层面积（Aep）与气道基底膜周径（Pbm）比值（如Aep／Pbm,Bcl-2／Pbm）等。结果B组小鼠气道上皮层增生,气道黏液分泌显著增加,气道壁Bcl-2表达增强;B组A昏PAS／Phm,Bcl-2／Pbm等值较C组均显著增高（P〈0．01）;B组和C组Aep／Pbm值比较差异有统计学意义（P〈0．01）,C组与D组比较差异无统计学意义;AB-PAS／Pbm与Bcl-2／Pbm呈显著正相关（r=0．671,P〈0．01）,Aep／Pbm与Bcb2表达也呈显著正相关（r=0．784,P〈0．001）。结论蓝玉簪颗粒可以抑制慢性哮喘小鼠气道上皮杯状细胞增殖和黏液高分泌,其部分机制可能通过抑制Bcl-2的表达实现。     

Tumor necrosis factor alpha-converting enzyme mediates MUC5AC mucin expression in cultured human airway epithelial cells

Ectodomain shedding of epidermal growth factor receptor (EGFR) ligands [e.g., transforming growth factor type alpha (TGF-alpha)] and EGFR phosphorylation are implicated in mucin production in airway epithelial cells. Tumor necrosis factor alpha-converting enzyme (TACE) is reported to cleave precursor of TGF-alpha, with release of soluble mature TGF-alpha in various epithelial tissues. We hypothesized that TACE increases the shedding of TGF-alpha, resulting in EGFR phosphorylation and inducing mucin production in human airway epithelial (NCI-H292) cells. To examine this hypothesis, we stimulated NCI-H292 cells with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, an activator of TACE) and pathophysiologic stimuli [lipopolysaccharide (LPS) and supernatant from the Gram-negative bacterium Pseudomonas aeruginosa (PA sup)]. PMA, PA sup, and LPS increased MUC5AC gene expression and mucin protein production, effects that were prevented by pretreatment with AG1478, a selective inhibitor of EGFR phosphorylation and by preincubation with an EGFR-neutralizing Ab or with a TGF-alpha-neutralizing Ab, implicating ligand (TGF-alpha)-dependent EGFR phosphorylation in mucin production. These stimuli induced release of soluble TGF-alpha, EGFR phosphorylation, and MUC5AC expression, which were blocked by the metalloprotease inhibitors tumor necrosis factor-alpha protease inhibitor-1 and tissue inhibitor of metalloprotease-3. We specifically knocked down the expression of metalloprotease TACE by using small interfering RNA for TACE. Knockdown of TACE inhibited PMA-, PA sup-, and LPS-induced TGF-alpha shedding, EGFR phosphorylation, and mucin production. From these results, we conclude that TACE plays a critical role in mucin production by airway epithelial cells by means of a TACE ligand-EGFR cascade in response to various stimuli.     

雷公藤甲素对支气管哮喘小鼠STAT-1与ICAM-1表达的影响

目的 研究雷公藤甲素对支气管哮喘（简称哮喘）小鼠肺组织中信号转导和转录激活因子-1（STAT-1）与细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达的影响,探讨其治疗哮喘的机制.方法 40只雄性昆明小鼠随机分成4组：正常对照组、哮喘组、地塞米松治疗组及雷公藤甲素治疗组,以卵清蛋白致敏和激发方法建立哮喘小鼠动物模型并给予相应治疗.24 d后处死小鼠,检测BALF中白细胞总数及嗜酸粒细胞（EOS）计数;采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测肺组织中STAT-1、ICAM-1 mRNA表达水平;采用免疫组织化学法检测肺组织中STAT-1、ICAM-1蛋白表达水平.结果 哮喘组STAT-1、ICAM-1 mRNA及蛋白表达明显高于正常对照组（P＜0.01）,雷公藤甲素治疗组及地塞米松组明显低于哮喘组（P＜0.01）.肺组织STAT-1蛋白的表达与BALF中白细胞数、EOS计数及肺组织ICAM-1蛋白表达呈正相关（r分别为0.665,0.735,0.677,P＜0.01）.肺组织ICAM-1蛋白表达与白细胞总数、EOS计数呈正相关（r分别为0.792,0.776,P＜0.01）.结论 雷公藤甲素抑制哮喘气道炎症的机制可能与其抑制STAT-1与ICAM-1的表达活性有关.