诺瓦克样病毒及其检测方法

诺瓦克样病毒是一种分布很广泛的,可导致成人和儿童急性胃肠炎的病毒,是除轮状病毒外引起腹泻的最主要的病毒病原,与食物、水源等的污染造成的急性胃肠炎暴发密切相关.文章介绍了诺瓦克样病毒的病原学、流行病学、临床表现和诊断检测等方面的研究进展.     

诺瓦克样病毒及其检测方法

诺瓦克样病毒是一种分布广泛,可导致成人和儿童急性胃肠炎的病毒,是除轮状病毒外最主要的致腹泻病毒病原,与食物、水源等污染造成的急性胃肠炎暴发密切相关。现对诺瓦克样病毒的病原学、流行病学、临床表现和诊断检测等方面的研究进展作一介绍。     

RT-PCR方法检测贝类中诺沃克样病毒的研究

目的:本研究从病毒富集和核酸提取两方面进行探索,旨在建立一个反转录(RT)PCR技术检测贝类中诺沃克样病毒(NLVs)的方法.方法:利用脊髓灰质炎病毒作为参照毒株,优化了甘氨酸缓冲液-聚乙二醇(PEG)病毒浓缩方法;同时比较了异硫氰酸胍法、SDS-蛋白酶K法、Trizol-异丙醇法、试剂盒法四种RNA提取方法;对市售贝类样品进行了检测,并利用基因测序对阳性样品进行验证.结果:本研究采用的pH9.5甘氨酸缓冲液 -16%聚乙二醇病毒浓缩法,病毒的回收率为16.8%,利用Trizol-异丙醇法提取RNA,检出限为8.1×10 2 RT-PCR50/5g贝肉,实际检测贝类样品25件,其中3件样品为阳性,基因测序结果亦证实为阳性.结论:本研究建立了一个灵敏度较高、较为有效的RT-PCR技术检测贝类中诺沃克样病毒的方法.     

贝类中诺如病毒的研究进展

从贝类中诺如病毒的污染现状、检测组织靶点、病毒浓缩方法及效率、检测方法有效性等多个方面评述贝类中诺如病毒的研究现状、进展、急需解决的问题和未来的发展方向,以期为制定诺如病毒检测技术标准及我国贝类进出口贸易提供参考。     

RT-PCR法检测贝类中的甲肝病毒的研究

在世界范围内,甲肝病毒是与食用贝类有关的主要传染性疾病之一。由于贝类中含有PCR抑制剂以及病毒富集过程中病毒的回收率低,阻碍了天然污染的贝类中HAV的PCR检测。研究中建立了一种经苷氨酸缓冲液洗涤,2次PEG沉降富集病毒,然后进行RNA提取和RT-PCR对贝类中的甲肝病毒进行检测的方法。经比较,采用小体系肠道样品检测比采用全贝检测的富集效果更佳,并比较了PEG8000和PEG6000对病毒富集的效果,回收率分别为13.5%和7.6%,此方法可有效地降低PCR抑制剂的影响,最低检测限可达10个TCID50/1.5 g。     

荧光定量PCR与常规PCR法检测GⅡ型扎幌样病毒的比较

目的 比较荧光定量PCR、常规RT－PCR法检测牡蛎中GⅡ型扎幌样病毒的灵敏度与准确性,为该病毒检测提供适用的方法。方法 采用荧光定量PCR、常规RT－PCR这 2种方法,对牡蛎样品中的GⅡ型扎幌样病毒进行检测。结果 荧光定量PCR检测的灵敏度可达102拷贝/祃,检测扎幌样病毒呈阳性的牡蛎有6例,阳性率为4.72%(6/127),常规RT－PCR的灵敏度为103 拷贝/祃,检测扎幌样病毒呈阳性的牡蛎有1例,阳性率为0.79%(1/127)。结论 荧光定量PCR是2种方法中更为敏感准确的方法,更适用于牡蛎中GⅡ型扎幌样病毒的检测。     

荧光定量PCR与常规PCR法检测GⅡ型札幌样病毒的比较

目的比较荧光定量PCR与常规RT-PCR法检测牡蛎中GⅡ型札幌样病毒的灵敏度与准确性,为该病毒检测提供适用的方法。方法采用荧光定量PCR和RT-PCR方法,分别检测牡蛎样品中的GⅡ型札幌样病毒。结果荧光定量PCR检测的灵敏度可达102拷贝/μl,札幌样病毒呈阳性的牡蛎有6例,阳性率为4.72%(6/127);RT-PCR的灵敏度为103拷贝/μl,札幌样病毒呈阳性的牡蛎有1例,阳性率为0.79%(1/127)。结论与RT-PCR方法比较,荧光定量PCR是更为敏感准确的方法,更适用于牡蛎中GⅡ型札幌样病毒的检测。     

应用多重PCR检测食品中SARS病毒靶基因的初步研究

以分子生物学方法——聚合酶链式反应(PCR)技术为基础,初步探讨了食品中SARS病毒靶基因片段的多重PCR检测技术。根据GenBank公开发表的SARS病毒基因组cDNA序列,人工合成克隆特异性靶基因DNA片段,以此片段作为阳性对照,并将其添加到罐装蘑菇、牛肉干、大豆、鱼干等食品的cDNA中作为阳性样品,再根据世界卫生组织推荐的引物序列合成引物,进行单PCR与多重PCR检测分析。结果表明:以单PCR法获得了121bp、182bp及302bp3条靶基因片段;以二重PCR法获得了121bp+182bp、121bp+302bp与182bp+302bp的靶基因片段组合;以三重PCR法获得了121bp+182bp+302bp的靶基因片段组合。检测灵敏度的实验表明:182bp片段的模板DNA量在0.003ng以上时,单PCR都能扩出清晰的条带,而121bp的靶基因片段只有模板DNA量在0.03ng以上时,单PCR才能扩出清晰的条带。它们的二重PCR分析的灵敏度与相应的单PCR分析灵敏度相同。     

Quantitative Detection ofVibrio vulnificus in Shellfish by Competitive Polymerase Chain Reaction

Quantitative detection of V. vulnificus in shellfish via competitive PCR was herein developed. We designed a forward primer, a reverse primer and a hybrid forward primer based on the V. vulnificus specific hemolysin gene (vvh), which was used to amplify target DNA and an internal competitive PCR standard. The specificity of the primers for V. vulnificus was proven by gel electrophoresis. The detection sensitivity for V. vulnificus was 220 CFU per PCR reaction with cells from a pure culture and 270 CFU/g of tissue without enrichment. After 10 hours of enrichment at 37° C the minimum detection level was reduced to 7 CFU/g of tissue.     

Quantitative Detection ofVibrio vulnificus in Shellfish by Competitive Polymerase Chain Reaction

Quantitative detection of V. vulnificus in shellfish via competitive PCR was herein developed. We designed a forward primer, a reverse primer and a hybrid forward primer based on the V. vulnificus specific hemolysin gene (vvh), which was used to amplify target DNA and an internal competitive PCR standard. The specificity of the primers for V. vulnificus was proven by gel electrophoresis. The detection sensitivity for V. vulnificus was 220 CFU per PCR reaction with cells from a pure culture and 270 CFU/g of tissue without enrichment. After 10 hours of enrichment at 37° C the minimum detection level was reduced to 7 CFU/g of tissue.     

实时荧光RT-PCR检测贝类中的札幌病毒

建立检测贝类中GⅠ、GⅡ、GⅣ和GⅤ型札幌病毒的实时荧光RT-PCR新方法。首先使用PEG 8000对贝类中的札幌病毒进行富集,然后采用Tri-reagent提取材料中的总RNA,针对札幌病毒RNA 3'端含Poly A尾的特点,使用带有Poly(dT)25的磁珠对病毒RNA进行纯化,用所获的高纯度RNA进行四种型别札幌病毒的实时荧光RT-PCR检测。该方法高效、灵敏,检测下限为101数量级拷贝,能够用于日常检验。     

实时逆转录聚合酶链式反应检测活的金黄色葡萄球菌

针对基于DNA水平的聚合酶链式反应(DNA-PCR)检测食品中金黄色葡萄球菌时会出现假阳性结果的缺点,建立一种能够区分死、活金黄色葡萄球菌的检测方法。根据金黄色葡萄球菌的femA基因,自设计Taqman探针、引物,采用一步法逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),以femA mRNA为检测对象,发现只有活的金黄色葡萄球菌显阳性,死亡的则呈阴性;纯培养时,重复检测变异系数为0.15,灵敏度为9×102CFU/mL,检出限可达1/3 CFU/3 mL。实验表明,该研究所建立的一步法逆转录聚合酶链式反应检测法,不仅灵敏度高、特异性强,而且能够有效地区分死、活金黄色葡萄球菌。     

绿色魏斯氏菌实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法的建立

以rpoA基因为靶基因,建立绿色魏斯氏菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）快速检测方法。针对rpoA基因设计特异性引物,建立绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR检测体系,通过特异性、灵敏度和重复性实验评价体系的检测效果,同时与常规PCR方法进行比较。结果表明：实时荧光定量PCR方法能够特异性检出绿色魏斯氏菌,对基因组DNA的检测灵敏度达到2.667×10－3 pg/μL,对纯培养物和模拟污染牛肉样品直接检测的灵敏度分别为30 CFU/mL和0.8 CFU/g;与常规PCR相比,实时荧光定量PCR检测的灵敏度是其1 000 倍;不同浓度样品独立重复实验循环阈值的标准差均小于1,变异系数在0.02%～1.28%之间。本研究所建立的绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,能够进行准确的定量检测,是快速检测绿色魏斯氏菌的有效手段。     

低温肉制品中3种食源性致病菌多重聚合酶链式反应快速检测方法的建立

针对低温肉制品中较易污染的沙门氏菌(Salmonella spp.)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等有害微生物,利用多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction,m-PCR)的方法,对3种菌同时快速检测,从而达到节省时间,提高效率的目的。使用沙门氏菌的inv A基因、金黄色葡萄球菌的Prf A基因和单增李斯特菌nuc基因设计3对特异性引物,在确定特异性引物的基础上,将3种菌进行培养增菌后接种于低温肉制品中,过夜富集后收集并进行灵敏度检测,优化多重PCR反应体系并应用于实际样品的检测。结果表明:多重PCR方法在同时检测这3种有害微生物时,m-PCR最佳反应条件如下:25 μL反应体系、10×PCR缓冲液2.5 μL、2.5 mmol/L d NTPs 2.0 μL、2.5 U/μL的DNA聚合酶0.5 μL及上、下游引物各0.5 μL、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的模板1.0 μL、沙门氏菌的模板2.0 μL,加dd H_2O补足至25 μL,最佳退火温度为64℃。多重PCR快速检测方法适用于低温肉制品中沙门氏菌等3种食源性致病菌的检测,具有快速、灵敏、特异、简便等特点。