甘蔗水分胁迫响应相关醛脱氢酶基因的克隆及其表达特征分析

 【目的】筛选并克隆与水分胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗旱机制,为甘蔗抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】应用消减文库技术结合cDNA芯片技术筛选水分胁迫诱导的基因的EST序列,根据筛选到感兴趣的上调表达基因的EST序列,用RACE技术获得SSADH的全长cDNA序列,并通过实时荧光RT-PCR技术对该基因的表达特征进行分析。【结果】通过消减文库技术结合cDNA芯片技术筛选的EST中含有4个推测为基因SSADH 的EST,其在水分胁迫处理的斑茅中均明显上调表达。通过RACE扩增获得甘蔗SSADH全长cDNA序列为1 914 bp,其中5′端非编码区25 bp,开放阅读框为1 581 bp,3′端非编码区306 bp,在1 749处有终止加A信号AATAA。克隆的甘蔗全长cDNA序列进行NCBI比对分析显示,所克隆的甘蔗SSADH全长cDNA与拟南芥（NM_106592.3）的ALDH5F1同源性为73%,表明克隆的cDNA序列可以归为甘蔗的醛脱氢酶家族基因ALDH5F1。通过荧光实时PCR分析SSADH表达表明,该基因参与干旱胁迫下的全程响应,并证明水分胁迫下该基因表达与Ca2+的存在调控关系。【结论】克隆了甘蔗基因SSADH,该基因为一个水分胁迫响应基因;SSADH的植物在体表达与Ca2+存在调控关系。克隆的基因SSADH可用于植物抗逆性调控研究。     

甘蔗细胞壁转化酶基因(SoCIN1)克隆及其在转基因烟草中的表达特性分析

[目的]克隆甘蔗细胞壁转化酶基因(SoCIN1)并分析其在转基因烟草植株中的表达特性,为研究CIN1基因功能提供参考.[方法]克隆SoCIN1基因,利用基因重组技术构建植物正义表达载体pBI121-SoCIN1,采用叶盘法经农杆菌EHA105介导将其转化烟草品种K346.经抗性筛选和PCR扩增验证后获得转SoCIN1基因烟草植株,采用半定量PCR检测叶片SoCIN1基因的表达量,并测定叶片可溶性糖含量、CIN活性及株高(以野生型烟草为对照).[结果]克隆获得的SoCIN1基因长度为1731 bp,与GenBank已公布的SoCIN1基因(JQ312298)核苷酸序列同源性达100%,并通过构建其植物正义表达载体转化烟草.PCR扩增鉴定结果表明,SoCIN1基因已整合至烟草基因组DNA.对F0和F1代进行转基因烟草连续筛选,获得4个转SoCIN1基因烟草株系(T-1、T-2、T-3和T-4).在4个株系的叶片中均检测到SoCIN1基因的表达,其中以在T-1株系叶片中SoCIN1基因表达量最高,其次是T-3株系,最低的是T-4株系.4个株系叶片的可溶性糖含量、CIN活性及株高均高于野生型烟草,其中CIN活性显著高于野生型烟草(P<0.05,下同),且T-1株系CIN活性高于其他3株系;T-1、T-2和T-3株系叶片可溶性糖含量分别显著高于野生型烟草39.68%、19.95%和31.15%;T-1、T-2、T-3和T-4株系的株高较野生型烟草分别提高了15.57%、2.90%、5.74%和5.22%,但仅T-1株系与野生型烟草存在极显著差异(P<0.01).[结论]转SoCIN1基因烟草叶片过表达SoCIN1基因,能提高烟草的CIN活性和可溶性糖含量,促进植株生长,由此推测该基因在甘蔗生长发育和蔗糖积累过程发挥作用.     

磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因的克隆与原核表达

[目的]检测磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因在大肠杆菌中能否高效表达.[方法]根据GenBank所公布的serC基因序列设计一对特异性引物,以E.coliJM109基因组为模板PCR扩增目的基因片段,将得到的目的基因定向克隆至大肠杆菌/黄色短杆菌穿梭表达载体pEC7中,构建重组表达载体并转化宿主菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析.[结果]通过PCR扩增得到约1 100 bp的DNA片段,经测序后分析该基因与已发表的serC基因具有99.27;的同源性;对重组表达载体进行酶切和PCR方法鉴定正确的命名为pEC7- C;重组表达载体转化宿主菌,SDS-PAGE分析可见约41 kD与理论大小一致的目标蛋白条带.[结论]重组表达载体转化后E.coli BL21中蛋白表达量比原始菌株的蛋白表达量高,证明 serC基因在E.coli BL21(DE3)中成功表达,为进一步构建L-丝氨酸高产基因工程菌奠定了基础.     

甘蔗胁迫诱导表达基因ScCBF1的功能分析

以甘蔗苗为材料研究了甘蔗CBF1转录激活因子ScCBF1在水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(Me JA)以及重金属镉(Cd Cl_2)和铜(Cu Cl_2)胁迫下的表达情况;将ScCBF1的原核表达载体p GEX-6P-1-ScCBF1转化大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3),检测其在NaCl、PEG8000胁迫下的生长情况.结果表明:ScCBF1在Me JA、SA、Cd Cl_2以及Cu Cl_2逆境胁迫下表达下调;在500 mmol·L-1NaCl胁迫下,含有重组质粒的细胞生长速度显著减缓,不同浓度NaCl胁迫下的平板胁迫结果进一步说明了ScCBF1基因不具耐盐性;在15%PEG8000胁迫下,含有重组质粒细胞的生长速度明显高于对照,不同浓度PEG8000胁迫下的平板胁迫结果说明了ScCBF1基因在应答干旱胁迫中具有抗逆性.构建了ScCBF1的植物表达载体p CAMBIA1301-ScCBF1并通过农杆菌侵染在本氏烟叶片中瞬时表达,在4℃低温胁迫下,T0代烟草植株长势显著优于对照.     

黄瓜硝酸还原酶cDNA片段的克隆及其在缺氮胁迫下的表达

以黄瓜叶片总RNA为模板,应用逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR),首次扩增出黄瓜硝酸还原酶(NR)cDNA部分片段。经过测序和同源性分析表明:该基因片段长度为395 bp,与GenBank上所登录的笋瓜NR基因同源性达89%,根据所测序列推导该片段由131个氨基酸残基组成。进一步检测其在缺氮胁迫下的活性和表达变化,结果表明缺氮胁迫下硝酸还原酶的活性和表达都明显下降,推测黄瓜NR在转录水平上调节其活性。     

冬瓜抗氧化基因的克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

【 目 的】 筛 选 能 有 效 促 进 绯 花 玉 提 前 开 花、 提 高 开 花 整 齐 度 的 植 物 生 长 调 节 剂 种 类、 浓 度 和 施 用 方 法, 为 绯 花 玉 的 花 期 调 控 提 供 技 术 参 考。【 方 法】 以 长 势 一 致 的 绯 花 玉 种 球 为 试 验 材 料, 研 究 100、200、400、800 mg/L 的 多 效 唑、 烯 效 唑、 吲 哚 乙 酸 和 赤 霉 素 对 其 开 花 的 影 响。 【结果】喷施 100~800 mg/L 多效唑、烯效唑、吲哚乙酸溶液,绯花玉种球色泽、球径增量、花朵数、开花率均 无显著差异,但在适宜浓度范围内可促进绯花玉提前开花,其中 100 mg/L 多效唑溶液处理效果最佳、比清水对 照提早 9.0 d 开花,从开花到全盛开所需时间仅 11.7 d、比清水对照缩短 20.0 d,且开花整齐度更高;而 100~800 mg/L 赤霉素溶液对绯花玉开花具有抑制作用,但对其营养生长起到促进效果,表现为绯花玉球径增大、刺座含 刺数量增加、刺长增长、刺座质量增加、种球颜色更绿等。【结论】研究结果可为促进绯花玉提前开花、提高 开花整齐度提供技术支撑,同时可针对个性化需求改良绯花玉的观赏性状,提高其观赏价值,对进一步增加其 市场份额具有重要意义。     

5个枳BOR基因的克隆与缺硼胁迫下的表达分析

以柑橘砧木枳[Poncirus trifoliata(L.)Raf.]为材料,克隆BOR基因家族5个成员(PtrBOR1、PtrBOR2、PtrBOR3、PtrBOR4、PtrBOR5),并用qRT-PCR技术检测了基因在缺硼胁迫下的表达。结果表明:5个BOR基因的ORF长度分别为2 145、2 133、2 211、1 998和2 034bp;氨基酸多序列比对发现PtrBOR1、PtrBOR2和PtrBOR3具有细胞极性定位和内吞降解的氨基酸保守位点;系统进化分析可将PtrBORs编码蛋白分为2个亚群,PtrBOR1、PtrBOR2和PtrBOR3编码蛋白属于一个亚群,PtrBOR4和PtrBOR5编码蛋白属于另一个亚群。qRT-PCR的结果表明,PtrBOR4在叶中表达量最高,其余PtrBORs在根中表达量最高;缺硼胁迫下PtrBORs表达量均发生变化,且各成员表达模式各不相同,PtrBOR1、PtrBOR2和PtrBOR3在根中表达量升高,PtrBOR1、PtrBOR2和PtrBOR4在茎中表达量升高,PtrBOR1在叶中表达量升高,PtrBOR1和PtrBOR2都在至少2个组织中表达量升高。     

藜麦CqCHS1基因的克隆及胁迫下表达分析

查尔酮合成酶(chalcone synthase, CHS)是植物类黄酮合成途径中的一个关键限速酶,参与植物中多个合成代谢途径,包括花青素合成。通过PCR反应成功克隆出藜麦CHS基因(CqCHS1)的cDNA全长序列,并进行预测分析,包括CqCHS1基因结构和编码的蛋白质保守结构域。同时,利用qRT-PCR技术检测了在不同胁迫处理下CqCHS1的表达情况。结果表明,CqCHS1基因包含2个外显子和1个内含子,其编码的蛋白质由392个氨基酸残基组成。CqCHS1蛋白是亲水性蛋白质,不存在信号肽,定位于细胞质。进化分析显示,CqCHS1与拟南芥AtCHS1的亲缘关系最近,其基因功能可能存在相似性。此外,还发现在CqCHS1基因启动子区域存在多个与胁迫和激素响应相关的顺式作用元件。表达分析结果表明,藜麦幼苗中CqCHS1的表达不会受到干旱胁迫的影响,而外源脱落酸(ABA)处理会抑制CqCHS1的表达,低温胁迫则会诱导CqCHS1的表达。本研究结果为进一步探究藜麦CqCHS1的基因功能提供了基础。     

红麻谷胱甘肽还原酶基因(HcGR)的克隆及盐胁迫下表达分析

[目的]克隆红麻谷胱甘肽还原酶基因(HcGR)并分析其组织表达特性及不同盐胁迫下的表达模式,为深入研究HcGR基因在响应盐胁迫的分子调控机制提供理论参考.[方法]基于红麻转录组测序结果,克隆HcGR基因,对其序列进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR检测HcGR基因在红麻不同组织及不同盐度胁迫[CK(0 mmol/L NaCl)、T1(50 mmol/L NaCl)、T2(100 mmol/L NaCl)和T3(200 mmol/L NaCl)]下的表达情况.[结果]克隆获得的HcGR基因开放阅读(ORF)长度为1698 bp,其编码蛋白相对分子量为60 kD,由555个氨基酸残基组成,理论等电点(pI)为8.46,为亲水性蛋白,定位于叶绿体;HcGR蛋白二级结构以无规则卷曲为主,以α-螺旋、延伸链和β-转角为辅,所占比例分别为44.14%、27.75%、22.16%和5.95%,其三级结构由无规则卷曲、α-螺旋和延伸链3种结构元件相互盘绕而成;该蛋白与榴莲GR蛋白亲缘关系较近.HcGR基因在红麻根、茎和叶中均有表达,且相对表达量存在显著差异(P<0.05,下同),相对表达量排序为叶>根>茎,表明HcGR基因具有明显的组织表达特异性.在红麻的根和叶中,HcGR基因相对表达量随NaCl胁迫浓度增加整体上呈先升高后降低的变化趋势,且均在T1处理下达峰值,显著高于CK、T2和T3处理.HcGR基因在茎中的相对表达量随NaCl胁迫浓度增加呈波动变化趋势,但T1、T2和T3处理均高于CK,其中T1和T3处理显著高于CK.[结论]HcGR基因在红麻根、茎和叶中的表达具有明显组织特异性,且可被不同浓度NaCl诱导响应盐胁迫信号,并通过上调各组织中的转录水平以提高抗盐胁迫能力,故推测该基因在红麻抗盐胁迫机制中发挥重要调控作用.     

辣椒CaCBF1A基因的克隆及非生物胁迫下表达分析

为揭示Ca CBF1A基因在辣椒抗逆机制中发挥的功能,对辣椒Ca CBF1A基因进行克隆与分析。以豫椒101为材料,根据参考基因组序列设计引物,通过PCR技术从辣椒基因组c DNA中获得CBF基因Ca CBF1A。经生物信息学分析,该基因具有一个完整的ORF(471 bp),编码156个氨基酸。Ca CBF1A编码的蛋白质包含保守的AP2 DNA结合域。对其亚细胞定位、跨膜结构进行分析,预测其定位在叶绿体中,存在跨膜结构。荧光定量PCR检测结果表明,低温、高温和盐胁迫均可诱导Ca CBF1A基因的表达,其表达量在迅速达到峰值后又降低,说明Ca CBF1A是一个逆境胁迫快速响应基因,推测其在辣椒抗逆机制中起着重要的作用。     

木薯海藻糖合成酶基因MeTPS6克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

[目的]克隆木薯海藻糖合成酶基因MeTPS6,并分析其在干旱、低温、遮荫等非生物胁迫应答中的表达情况,为研究TPS基因功能及抗逆分子机理提供参考.[方法]采用RT-PCR从木薯中克隆MeTPS6基因,并进行生物信息学分析及构建系统发育进化树.采用荧光定量PCR(qPCR)分析MeTPS6基因在干旱、低温和遮荫胁迫下不同木薯品种不同组织中的表达特性及模式.[结果]克隆获得的MeTPS6基因具有一个2565 bp的开放阅读框,编码854个氨基酸,含有TPS家族保守结构域(Glyco_transf_20).MeTPS6蛋白与杨树(Potri.010G104500)和杞柳(SapurV1A.0015s0610)同源蛋白氨基酸序列的相似性分别达92.6%和90.0%,表明木薯与杨树和杞柳的亲缘关系较近.MeTPS6基因的启动子序列中存在大量非生物胁迫相关元件(低温相关元件LTR、干旱相关元件MBS等)、激素相关元件(脱落酸相关的元件ABRE和CE3、水杨酸相关元件TCA-element等)及光响应相关元件(ACE、Box I等).MeTPS6基因在木薯储藏根中的表达量最高,须根次之,二者均显著高于茎、叶柄和叶片中的表达量(P<0.05,下同),且在干旱、低温和遮荫胁迫下,不同组织中的表达模式存在明显差异.对于不同木薯品种,干旱、低温和遮荫胁迫处理均显著诱导其MeTPS6基因表达.在高置信度(Confidence=0.8)的情况下,共找到13个共表达基因,其中有10个为TPS同源基因,表明这些同源基因可能相互协调,共同参与植物生物学过程;另外3个基因(CAT、CAT1和F5M15.5)均编码过氧化氢酶,主要参与保护细胞免受过氧化氢的毒性作用.[结论]MeTPS6基因主要在木薯的根(特别是储藏根)中表达,并从转录水平参与干旱、低温和遮荫胁迫响应,可作为候选基因进一步研究其在木薯抗逆中的功能.     

缺Ca/Fe及盐分胁迫下番茄Pb吸收转运与关键基因的表达关系

选取台湾黄圣女番茄为供试材料,通过水培试验研究缺Ca/Fe及盐分胁迫三种处理对Pb在番茄中富集的影响,并测定不同处理下根部CNGC1(环核苷酸门控非选择性阳离子通道)和HMA3(P1B-ATPase酶)基因的相对表达量,进而探究CNGC1和HMA3基因的表达对番茄吸收累积Pb的影响。结果表明:与对照相比,缺钙处理显著增强了根对Pb的吸收能力并抑制了Pb往地上部转运过程,缺Fe处理对根吸收能力无显著影响而增加了往地上部转运量,盐分处理同时增强了根部吸收及往地上部转运能力;不同处理下番茄根部单位质量Pb净吸收量与CNGC1离子通道的活性水平呈现出极显著正相关(P0.01),说明番茄根部CNGC1离子通道在不同处理下Pb的吸收可能起着重要作用;番茄Pb转运系数与HMA3的表达量呈现极显著负相关(P0.01),说明番茄HMA3的高表达抑制了番茄对Pb的地上转运能力。因此,缺Ca/Fe及盐分胁迫处理对Pb在番茄中富集有不同影响,CNGC1离子通道和HMA3的表达量在一定程度上决定了Pb在番茄中的分布。     

黄瓜细胞质型谷氨酰胺合成酶基因(GS1)的克隆及其在低氮条件下的表达

【目的】分离和克隆黄瓜谷氨酰胺合成酶GS1基因,分析其序列特征,了解其在低氮条件下的表达情况。【方法】依据黄瓜基因组数据库中Csa015274基因编码区全序列,应用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物,从黄瓜叶片cDNA中克隆该基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析鉴定,并用实时荧光定量PCR法研究GS1基因在不同氮素浓度下的表达变化。【结果】分离到GS1基因,GenBank登录号为JQ277263。该基因长1 071 bp,编码356个氨基酸,与甜瓜(Cucumis melo L.)GS1基因同源性高达97%。该基因编码的蛋白是1个不稳定的疏水蛋白,无跨膜结构,无信号肽,存在蛋白激酶C磷酸化位点,酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,N-十四酰化位点,酪氨酸激酶磷酸化位点等活性位点。GS1基因表达模式分析显示,在低氮条件下,该基因下调表达,随着氮素浓度的增高GS1基因的表达量增加。在高浓度的氮素水平下,该基因的表达同样受到抑制。【结论】成功从黄瓜叶片中分离克隆到GS1基因,该基因具有已知物种GS1基因的特征,可用于该基因的功能研究。     

甘薯低温胁迫基因IbICE1的克隆及表达分析

克隆甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)低温胁迫基因Ib ICE1,对其进行序列分析及低温胁迫下表达水平分析,探讨Ib ICE1对甘薯耐低温胁迫能力的影响。以辽薯36为试验材料,利用RACE技术克隆甘薯Ib ICE1基因,Ib ICE1基因的c DNA全长2150bp,包含1611bp完整的开放阅读框,该基因编码536个氨基酸残基,分子量58.26 k D,等电点5.72。进化树分析表明,Ib ICE1同玉米和拟南芥ICE1基因亲缘关系较近。Ib ICE1蛋白C端含有一个典型的b HLH结构域,并与其他植物的ICE1蛋白具有较高的同源性。采用RT-PCR研究该基因在低温处理时的表达量及在甘薯不同组织中的表达量,结果表明,该基因的表达受低温胁迫诱导,在甘薯的茎、叶和根均有表达,其中叶中表达量最高,推测Ib ICE1基因在甘薯耐低温胁迫中发挥重要作用。     

红叶芥低温胁迫下苯丙氨酸解氨酶活性及其基因的克隆表达

用8℃低温处理红叶芥四叶期植株,在低温处理的52 h内分别取样6次,取样后分别提取叶片总RNA,再利用RT-PCR克隆得到红叶芥PAL基因开放阅读框内1908 bp片段,核苷酸序列分析显示,红叶芥PAL基因与芜青PAL基因的同源性达到99%.半定量RT-PCR结果显示,在8℃低温胁迫下,红叶芥PAL基因表达量呈现先降低后升高的趋势,在处理18 h后达到最低点,随后迅速升高,这与PAL活性变化一致.

Abstract：

The 4-leaf seedlings of red-leaf mustard(Brassica juncea var.garrhiza Tsen et Lee)were exposed to low temperature(8 ℃)for 52 h,during which period leaf samples were taken 6 times for total RNA extraction.The open reading frame fragment that was generated by RT-PCR using specific primers was 1 908 bp.The cDNA from the leaves of red-leaf mustard was used as the template.Nucleotide sequence analysis showed that red-leaf mustard PAL gene shared 99% identity to that of Brassica napus.In response to the low-temperature stress in this experiment,the expression of PAL first dropped and then increased rapidly,being the lowest 18 h after the start of the treatment,a similar trend to that of PAL activity.     

红叶芥低温胁迫下苯丙氨酸解氨酶活性及其基因的克隆表达

用8℃低温处理红叶芥四叶期植株,在低温处理的52 h内分别取样6次,取样后分别提取叶片总RNA,再利用RT-PCR克隆得到红叶芥PAL基因开放阅读框内1 908 bp片段,核苷酸序列分析显示,红叶芥PAL基因与芜青PAL基因的同源性达到99%.半定量RT-PCR结果显示,在8℃低温胁迫下,红叶芥PAL基因表达量呈现先降低后升高的趋势,在处理18 h后达到最低点,随后迅速升高,这与PAL活性变化一致.     

小麦TaAlaAT基因的克隆及镉胁迫下表达分析

为了研究AlaAT基因在小麦应对镉胁迫中的功能,以镉处理小麦为试验材料,利用mRNA差异显示技术DDRT-PCR、RT-PCR从小麦cDNA中克隆得到AlaAT基因全长,将其命名为TaAlaAT。用生物信息学方法对TaAlaAT的基因序列和蛋白质氨基酸序列进行分析,进一步用MEGA 6.0软件构建进化树;用qRT-PCR研究TaAlaAT基因在小麦不同组织中以及镉胁迫后的相对表达水平。序列分析结果表明,该基因全长为1 628 bp,包含1个长度为1 440 bp的完整开放阅读框(open reading frame, ORF),其编码479个氨基酸,蛋白质分子量约为53.41 ku,等电点为6.97,该蛋白质属于天冬氨转氨酶家族,与水稻(Oryza sativa L.)AlaAT蛋白的相似性较高。qRT-PCR结果表明,TaAlaAT在小麦中具有组织特异性,在根部的表达水平最高,在镉胁迫处理后,TaAlaAT基因表达量呈现先升高后降低的趋势。由研究结果可以看出,TaAlaAT基因能够响应镉胁迫。     

谷子BAS1基因生物信息学分析及其在干旱胁迫下的表达分析

BAS1是一种过氧化物酶,广泛存在于植物中,具有清除生物体内ROS、调节细胞内信号传导和分子伴侣的功能,在盐胁迫、光氧化、干旱及低温胁迫等方面起着重要的作用。通过生物信息学分析了谷子中的8个SiBAS1基因,并与近缘种高粱中SiBAS1基因进行亲缘关系比对。结果发现,高粱和谷子的SiBAS1基因家族同源性极高;对谷子SiBAS1基因进行启动子分析,结果发现,很多与干旱胁迫相关的响应元件包括干旱响应MYB结合位点MBS、低温响应元件LTR、热响应元件HSE、真菌诱导响应元件Box-W1、乙烯响应元件ER E、赤霉素响应元件P-box、水杨酸响应元件TCA-element和脱落酸响应元件ABRE等;通过对勾勾母鸡咀(GG,耐干旱品种)和晋汾16(JF16,干旱敏感品种)的SiBAS1基因转录组表达情况的分析发现,干旱胁迫下不同品种中同一SiBAS1基因的表达水平不同,且差异较大。其结果可为深入研究SiBAS1基因与谷子抗旱性的关系提供依据,且有助于SiBAS1基因对干旱的响应机制及作用机制的后续研究。