猪流行性腹泻病毒COE蛋白的原核表达及免疫原性分析

为表达猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)中和抗原表位COE蛋白,分析其免疫原性,为PEDV的检测和亚单位疫苗的开发奠定基础.参考GenBank中PEDV COE基因序列,人工合成并经生物信息学综合分析后,将合成的基因片段插入原核表达载体pET-32a(+),构建...     

猪流行性腹泻病毒S蛋白中和表位区单克隆抗体的制备与鉴定

以纯化的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白中和表位(SID)重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术获得了6株稳定分泌抗SID区特异性的单克隆抗体细胞株,分别命名为2C4、3G3、5F8、3G5、6E6和3C3。6株杂交瘤细胞诱生小鼠产生的腹水抗体效价分别为1∶51200、1∶6400、1∶12800、1∶6400、1∶51200和1∶25600。免疫球蛋白类型均为IgG1型,轻链均为Κ链。Western blot试验结果显示,6株单克隆抗体均能特异性地识别天然PEDV中的S蛋白。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白抗原表位区基因克隆、分析及原核表达

从患流行性腹泻的病猪小肠中分离猪流行性腹泻病毒(PEDV),设计一对引物用于扩增PEDV S蛋白的抗原表位区,将扩增产物克隆到原核表达载体pET-32a,构建了重组表达质粒pET32a-PEDV-S1;在IPTG的诱导下表达,经SDS-PAGE分析,Western blotting鉴定,结果表明该抗原表位区蛋白得到了重组表达.该研究可为PEDV抗原表位区的相关研究提供参考.     

猪流行性腹泻病毒流行毒株S1蛋白的原核表达与鉴定

为了获得具有良好活性的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行毒株重组蛋白,试验采用PCR扩增、克隆、诱导表达、Western-blot检测、间接ELISA等方法对PEDV流行毒株S1蛋白的主要抗原区域进行了原核表达、鉴定与初步应用研究。结果表明:经PCR扩增得到大小为1 095 bp的S1蛋白主要抗原区域基因;将目的片段定向克隆至pET-30a原核表达载体中,经IPTG诱导获得大小为48. 0 ku的重组蛋白; Western-blot检测显示,重组蛋白可与PEDV阳性血清发生特异性反应;用以重组蛋白为包被抗原初步建立的PEDV抗体间接ELISA方法检测PEDV感染猪场,其阳性感染率达98. 52%,无PEDV免疫史和感染史猪场的阳性感染率为0。说明试验获得了具有良好生物学活性的PEDV流行毒株重组蛋白。     

猪流行性腹泻病毒S1蛋白表达及反应原性分析

为了获得反应原性较好的猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1蛋白,利用原核表达系统对S1基因(60~845 bp)进行扩增并构建原核表达质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),以1 mmol/L IPTG诱导表达4 h,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示:成功构建了pET-30A-S1质粒,重组蛋白得到了表达且具有良好的反应原性,能够被兔PEDV多抗血清识别。本研究为进一步建立ELISA检测方法和亚单位疫苗的研制奠定了物质基础。     

猪流行性腹泻病毒S1蛋白在干酪乳杆菌中的分泌表达及免疫原性分析

将猪流行性腹泻病毒(PEDV)纤突蛋白S1基因片段插入干酪乳杆菌分泌型表达载体pPG-2中,构建了重组表达载体pPG-s1,将其电转化干酪乳杆菌L.casei 393,获得了表达PEDV S1蛋白的重组乳酸茵杆菌.重组杆菌诱导后,经western blot、间接ELISA实验表明,目的蛋白获得了分泌表达.将该重组干酪乳杆菌经口服接种途径免疫BALB/c小鼠,免疫后于不同时间分别测定了粪便中特异性的sIgA和血清中IgG;用MTT法检测免疫小鼠细胞脾淋巴细胞增殖情况.结果表明该重组干酪乳杆茵表达系统能刺激动物黏膜免疫应答和系统免疫应答,在肠道可产生分泌型Iga抗体,并可检测到高水平血清IgG;不仅能诱导体液免疫反应,还可诱导细胞免疫应答.表明所构建的重组干酪乳杆茵表达系统作为口服疫苗具有潜在的应用价值,为探索新型猪流行性腹泻口服疫苗的研制奠定了基础.     

猪流行性腹泻病毒CH/ZJ分离株S基因的克隆、原核表达和免疫原性分析

为了获得具有免疫活性的猪流行性病毒S蛋白,试验参照GenBank中所收录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株S基因序列设计1对特异性引物,去除信号肽,以PEDV CH/ZJ株为模板,通过RT-PCR扩增出目的基因,克隆入原核表达栽体pET28a(+),转化到Top10感受态细胞中,测序并分析.结果表明:目的基因含有1个长966 bp、编码322个氨基酸残基组成的多肽;与CV777株相比较,同源性为96.0%,但在398 bp处缺失编码1个异亮氨酸的密码子,将重组质粒命名为pET-P-SP1;将pET-P-SP1转化到大肠杆菌E.coli BL21-DL3(Rosetta)中,在1PTG诱导下表达;通过SDS-PAGE表达出与预期大小相符的约35.6 ku的重组蛋白,重组蛋白以包涵体形式存在;表达产物占菌体蛋白的80%;表达蛋白能与抗猪流行性腹泻病毒高免血清反应,说明该重组蛋白具有免疫活性.     

猪流行性腹泻病毒纤突蛋白S1抗原表位的串联表达及免疫原性分析

为了获得猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)纤突蛋白S1抗原表位的串联重组蛋白并评价其免疫原性,试验将S1蛋白的抗原表位COE和S1D连接起来组成串联表位S1CD,合成相应的基因片段后克隆至转移载体pFastBac1上,然后转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑和PCR扩增筛选重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-S1CD,再转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒,采用间接免疫荧光试验和Western-blot检测方法鉴定重组蛋白S1CD的表达情况。将小鼠随机均分为S1CD蛋白组、PEDV灭活疫苗组和PBS组,分别经背部皮下多点注射重组蛋白S1CD、PEDV HeN170821灭活病毒和PBS与弗氏佐剂等体积混合制成的抗原,检测特异性IgG抗体水平及白细胞介素-4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)含量以评价重组蛋白S1CD的免疫原性。结果表明：重组蛋白S1CD成功在Sf9昆虫细胞中表达,并能与鼠抗His单克隆抗体和PEDV阳性血清发生特异性反应;首次免疫后第28天,S1CD蛋白组的特异性IgG抗体水平极显著高于PBS组(...     

猪流行性腹泻病毒CH/ZJ分离株S基因的克隆、原核表达和免疫原性分析

为了获得具有免疫活性的猪流行性病毒S蛋白,试验参照GenBank中所收录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株S基因序列设计1对特异性引物,去除信号肽,以PEDVCH/ZJ株为模板,通过RT-PCR扩增出目的基因,克隆入原核表达载体pET28a(+),转化到Top10感受态细胞中,测序并分析。结果表明:目的基因含有1个长966bp、编码322个氨基酸残基组成的多肽;与CV777株相比较,同源性为96.0%,但在398bp处缺失编码1个异亮氨酸的密码子,将重组质粒命名为pET-P-SP1;将pET-P-SP1转化到大肠杆菌E.coliBL21-DL3(Rosetta)中,在IPTG诱导下表达;通过SDS-PAGE表达出与预期大小相符的约35.6ku的重组蛋白,重组蛋白以包涵体形式存在;表达产物占菌体蛋白的80%;表达蛋白能与抗猪流行性腹泻病毒高免血清反应,说明该重组蛋白具有免疫活性。     

猪流行性腹泻病毒S基因与SEA基因融合表达及免疫原性评价

试验旨在构建pET-28a-S-SEA融合表达质粒,并评价S-SEA蛋白的免疫原性。根据大肠杆菌密码子偏嗜性,对我国猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株(GenBank:LT906620.1)的S基因与金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因(GenBank:MH053151.1)进行优化,通过柔性连接肽(GGGGS)连接后,克隆至表达载体pET-28a,得到pET-28a-S-SEA重组质粒,转化至宿主菌BL21(DE3)中诱导表达,经SDS-PAGE和Western Blot检测后,对最佳表达条件进行摸索。在此基础上,将亲和层析后的重组蛋白,免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠,对免疫小鼠的血清特异性抗体水平和淋巴细胞增殖指数进行检测。结果成功构建pET-28a-S-SEA质粒,且在大肠杆菌中获得高效表达;小鼠试验结果表明,纯化的S-SEA蛋白能够诱导小鼠产生特异性免疫反应,促进淋巴细胞增殖,具有良好的免疫原性,为进一步研究猪流行性腹泻亚单位疫苗提供帮助。     

变异猪流行性腹泻病毒M和N融合双基因的原核表达及表达产物免疫原性分析

旨在构建变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M和N双基因融合质粒,并分析表达蛋白免疫原性。通过扩增变异PEDV FJFQ2014毒株(GenBank登陆号KJ646580)的M基因和N基因,将M基因克隆至pEASY-Blunt E2(pE2)表达载体,构建出pE2-M质粒。利用同源重组原理,采用无缝拼接试剂盒将N基因克隆至E2-M片段,转化到Trans 1-T1感受态细胞中,构建出pE2-M-N融合双基因质粒并转化Transetta(DE3),表达出相应的融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot验证蛋白的表达情况。将纯化的M-N融合蛋白皮下接种BLAB/c小鼠,通过ELISA方法检测融合蛋白的免疫原性。结果表明:扩增出M和N基因,成功构建了pE2-M质粒,并将E2-M基因与N基因进行有效连接,构建出pE2-M-N融合双基因质粒,表达出了具有免疫原性的M-N融合蛋白,该蛋白能够诱导小鼠产生相应的特异性抗体。变异PEDV的pE2-M-N双基因融合质粒的构建,为进一步开展变异PEDV的诊断技术和免疫学等研究,奠定良好基础。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白多表位抗原免疫原性分析

在猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)经典毒株CV777毒株S基因基础上,选取S抗原优势表位EP(499～638 aa、748～755 aa、764～771 aa和1368～1374 aa)和超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因,优化后通过编码柔性连接肽(G...     

猪流行性腹泻病毒S基因序列分析

根据猪流行性腹泻病毒S基因序列设计引物,应用RT-PCR方法从广东省某猪场采集的初生仔猪腹泻样品检测猪流行性腹泻病毒,并将其克隆测序分析。结果表明,病料样品中有猪流行性腹泻病毒,S基因与KNU-0801、KNU-0901亲缘关系最近,处于同一个分支;与弱毒疫苗株CV777的S基因亲缘关系较远,处于另外一个分支。     

猪流行性腹泻病毒部分S1基因克隆

为研究江西省PEDV流行株可能的变异情况,作者采用RT-PCR成功扩增了PEDV的部分S1基因,并将其克隆至T载体,经测序同源性分析,与PEDV标准毒株同源性在95%以上,说明成功的克隆了PEDV病毒部分S1基因,为将来进一步研究打下基础。     

猪流行性腹泻病毒S1D蛋白的优化表达及其单克隆抗体的制备

为进一步探究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白的抗原表位及其功能,本试验通过优化S1D基因的密码子,构建了S1D基因未优化的重组原核表达质粒pET-S1D和已优化的pET-ΔS1D,并进行了诱导表达和纯化。使用SDS-PAGE和Western blotting方法验证S1D、ΔS1D蛋白在大肠杆菌内得到正确表达,利用Image J软件对S1D、ΔS1D蛋白表达量进行灰度扫描,通过t检验分析两者差异性。将纯化的ΔS1D 蛋白免疫 BALB/c小鼠,通过细胞融合、筛选及亚克隆,获得单克隆细胞株。利用体内诱生法制备抗PEDV S1D蛋白的单克隆抗体腹水,使用ELISA、Western blotting、间接免疫荧光试验3种方法对腹水效价及特异性进行检测和验证。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,表达S1D、ΔS1D蛋白的样品均在34 ku处出现正确的目的条带。t检验结果表明, S1D、ΔS1D两者蛋白表达量差异极显著(P<0.01)。ELISA结果显示, 腹水的抗体效价达到了1∶1 000 000,腹水与PEDV病毒粒子和纯化后的ΔS1D蛋白反应均呈阳性,与PEDV N蛋白、pET-32a(+)空载体蛋白和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV) 5种病毒反应均呈阴性。Western blotting结果显示,腹水与ΔS1D蛋白和PEDV S蛋白分别在34和180 ku处有特异性条带出现,与pET-32a(+)空载体蛋白、正常Vero细胞蛋白均无特异性条带出现。间接免疫荧光试验结果显示,腹水及阳性对照组均能使细胞出现特异性绿色荧光信号,而空白及阴性对照组均未见绿色荧光信号。密码子优化可在原核表达系统中显著提高重组蛋白的表达水平,本研究基于高效表达的ΔS1D蛋白,成功制备了1株能稳定分泌与 PEDV S蛋白特异性结合的单克隆抗体的细胞株,为进一步探究 PEDV S蛋白抗原表位及蛋白功能的研究奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及S1基因序列分析

为了对疑似猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染病例进行确诊,并掌握致病原与其他流行毒株的基因差异性,试验采用病毒分离与细胞病变观察、PCR检测、中和试验、间接免疫荧光试验、S1基因序列分析等方法对该病例进行了研究。结果表明:临床病料接种Vero细胞盲传至18代后可产生典型的细胞病变,临床病料样品及各代次分离株病毒的PCR检测均为阳性,该毒株的TCID_(50)为1×10~(-6.61)/mL,该病毒可被PEDV阳性血清特异性中和,间接免疫荧光试验中可见明显的特异性绿色荧光,该病毒的S1基因核苷酸序列与GenBank中PEDV S1基因序列同源性在65.2%~100%之间,遗传进化关系中该病毒与近几年新分离株属于同一个大分支,与CV777等经典毒株亲缘关系较远。说明分离株病毒为国内近几年流行的新型PEDV。     

猪流行性腹泻病毒M基因及其片段原核表达效果分析

将猪流行性腹泻病毒的M基因及编码M蛋白膜外区M基因片段（M’）分别亚克隆到原核表达载体pJLA605和pGEX-6p-1中，构建了重组质粒pJLA605-M、pGEX-6p-M-GST、pGEX-6p-M和pGEX-6p-M’，转化大肠杆菌后。探索了M蛋白在N端和C端不带有谷胱苷肽巯基转移酶（GST）、N端和C端均带有GST、只在N端带有GST以及只含有M蛋白的膜外区M’蛋白的表达情况。SDS-PAGE分析结果表明，N端和C端带有GST的pGEX-6p-M-GST和只含有膜外区M’基因的重组质粒pGEX-6p-M’获得了高效表达，经Bandscan5．0软件分析，其表达产物分别以融合蛋白GST-M和GST-M’形式存在，表达量分别为20％和45％。在对重组质粒pJLA605-M转化的大肠杆菌诱导表达过程中发现菌体生长的抑制现象，说明M蛋白对宿主菌有一定的毒性，进一步提取包涵体进行SDS-PAGE发现M蛋白以包涵体的形式得以表达。猪流行性腹泻病毒M蛋白的毒性作用可能与M蛋白具有的出芽功能有关，因而表现出对大肠杆菌的细胞壁的破坏作用。     

猪流行性腹泻病毒主要结构蛋白在杆状病毒中的表达及免疫原性分析

为了研制一种有效控制猪流行性腹泻的疫苗,本试验设计了两对引物,分别扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)主要抗原表位S1(S蛋白中一个有效的抗原位点)和M蛋白的基因。将两段基因克隆到杆状病毒双表达载体pFastBacTMDuai中,构建了重组转移质粒pFBD-S1-M,并将其转化至DH10BacTM感受态细胞中制备重组穿梭质粒Bacmid-S1-M,转染Sf9昆虫细胞后,拯救出能够共表达S1和M蛋白的重组杆状病毒rBacmid-S1-M。表达产物经过SDS-PAGE和Western blot检测,共表达的重组S1和M蛋白产物能够与PEDV多克隆抗体发生特异性反应,表明共表达的蛋白具有良好的反应原性。本研究为PEDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达与鉴定

为了制备猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）N蛋白,通过PCR扩增获得PEDV的N基因片段与载体pET-32a（+）相连构建原核表达载体pET-32a（+）-PEDV-N。将构建成功的质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG（1 mmol/mL）37℃诱导表达后,采用SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况,对影响重组蛋白表达的诱导时间进行分析。利用Western blot方法分别检测重组蛋白的免疫原性。结果表明：PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测发现条带位置正确,重组质粒pET-32a（+）-PEDV-N测序正确,含有重组质粒pET-32a（+）-PEDV-N的表达菌株BL21（DE3）在诱导表达后,经SDS-PAGE检测证明有重组蛋白表达,利用Western blot结果表明该重组蛋白与PEDV多克隆抗体发生特异性反应,说明成功制备了PEDV-N重组蛋白。     

猪流行性腹泻病毒S1基因的克隆及在腺病毒中的表达

为了研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1基因在腺病毒中的表达,试验采用RT-PCR方法,获得S1目的基因序列,并将其定向克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,再与BJ5183细菌内的腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组,获得携带猪流行性腹泻病毒S1基因的重组腺病毒质粒pAd-S1;该重组质粒经PacⅠ酶切、转染AD-293细胞,获得具有感染性的重组腺病毒rAd-S1;病毒效价在传至第6代时可达到1×108.3TCID50/mL,同时经PCR检测,目的基因在重组腺病毒rAdS1传代过程中稳定存在;间接免疫荧光检测和Western-blot检测,rAd-S1在AD-293细胞中成功表达出分子质量约为100 ku猪流行性腹泻病毒S1蛋白。说明构建的重组腺病毒rAd-S1能够稳定地表达PEDV S1蛋白。