三个文蛤家系双列杂交设计在两种环境下的配合力及杂种优势分析

A 3×3 complete diallel cross comprising three families of the clam Meretrix meretrix(P1, P2 and P3) was used to determine the combining ability of parental families and heterosis of F1 under indoor and openair environments for growth traits. Analysis of variance for shell length and whole body weight indicated highly significant cross effects, environment effects and the interaction of cross by environment. General combining ability(GCA) and specific combing ability exhibited great variation among crosses and between two environments. Pooled over environments, P2 was the top combiner among the three parental families for both traits studied. The cross of P1 and P3 had the highest SCA. Additionally, significant reciprocal effects were observed. For individual environment, about half of the crossbred combinations showed favorable Mid-parent heterosis(MPH)(1%) for the shell length and whole body weight. Our data has shown that non-additive genetic and reciprocal effects constituted the major sources of genetic variation for both shell length and whole body weight, which indicates that crossbreeding among selective families could further explore the heterotic effects.     

凡纳滨对虾生长性状的双列杂交分析

以来源于两个不同遗传背景群体的凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei为亲本,设置PP(P♀×P♂)、PH(P♀×H♂)、HP(H♀×P♂)、HH(H♀×H♂) 4个实验组(P代表进口群体,H代表选育群体),进行进口个体(P♂和P♀)与选育个体(H♂和H♀)间的双列杂交实验,分析比较其子一代的生长与存活情况.结果发现,对虾存活由高到低顺序为HH>HP>PH>PP,PH实验组表现出明显的存活杂种优势,其育苗期间的杂种优势平均值为(27.72±11.88)%,下塘90d后成活率的杂种优势为30.50%.在生长前期(30日龄以前)对虾平均体长和体重的顺序是HP>PH>HH>PP,而在生长后期则为PP>HP>PH>HH.HP实验组在整个养成期(10、30、60和90d)均表现出体长和体重上的杂种优势,杂种优势值分别为24.00%、13.71%、2.55%、2.79%和112.46%、54.06%、8.16%、12.48%.结果表明,选育群体为母本、进口群体为父本的对虾杂交后代的生长和存活性状明显提高.     

4个文蛤群体鲜味物质比较分析

以江苏文蛤(Meretrix meretrix)为研究对象,采集红壳色文蛤原种、黄壳色文蛤原种、红壳色文蛤选育F1、红壳色文蛤选育F2 4个群体,检测其主要非挥发性鲜味物质成分单磷酸腺苷(AMP)、单磷酸鸟苷(GMP)、次黄嘌呤核苷酸(IMP)、琥珀酸、游离氨基酸、无机离子(Na~+、K~+、Cl~–、PO_4~(3–))的含量,并通过味道强度值(TAV)评价其呈味作用。鉴于核苷酸与氨基酸在呈味方面的协同效应,采用味精当量(EUC)评价不同文蛤群体的鲜味品质。结果表明,文蛤软体组织中AMP、琥珀酸、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、Na+、K~+、Cl~–的TAV值大于1,是文蛤鲜味的主要贡献者;红壳色文蛤原种的鲜味强度最大(4.92 g/100g),其子代红壳色文蛤F1(4.08 g/100g)、红壳色文蛤F2(4.09 g/100g)稍有降低,但仍显著高于黄壳色文蛤原种(3.34 g/100g)(P0.05),表明江苏红壳色文蛤在鲜味品质方面具有相对稳定的较高品质。     

长牡蛎(Crassostrea gigas)三个选育群体完全双列杂交后代生长性状分析

利用中国(C)、日本(J)和韩国(K)3个长牡蛎(Crassostrea gigas)第四(F4)代选育群体,采用完全双列杂交方式构建建立了3个自交群体、3个正交群体和3个反交群体。结果表明,各交配组合在180日龄、360日龄和450日龄生长优势差异显著(P0.05);在不同生长阶段各组合的生长性能、一般配合力值、特殊配合力值和杂种优势效能值各不相同。杂交组合C♂K♀、J♂C♀和K♂J♀分别在180日龄、360日龄和450日龄表现出较大的生长优势,而自交组合K♂K♀在各个生长阶段均表现出生长劣势。中国F4代选育群体父母本一般配合力效应值均表现为非负值,而韩国F4代选育群体父母本一般配合力效应值均表现为非正值。杂交组合的特殊配合力效应值在不同生长阶段表现不一致,但与生长优势效能值基本相符。实验结果表明,多数杂交子代在生长性状上存在一定程度的杂种优势,可进行规模化商业推广应用;中国F4代选育群体作为杂交候选父母本时,具有高的可稳定遗传给子代的加性效应值。利用群体选育建立配套系,对不同选育群体进行杂交育种是培育长牡蛎优良新品系的有效方法。     

红壳色文蛤选育子代各壳色的形态分化及养殖效果的比较

以红壳色为目标性状,于2009年进行了文蛤(Meretrix meretrix)的群体选育研究,建立了红壳色选系子一代(Fl),对子一代壳色种类、分布频率及其数量性状进行了统计、测量和分析,并对各壳色的形态、生长速度做了研究.结果表明,文蛤壳色具有多态性,红色、黄色、白双、黄双、波纹的分布频率分别为75.58%、8.55%、0.53%、14.83%、0.50%.红壳色亲本的子代中出现红色∶花色=3∶1,符合孟德尔遗传模式.聚类分析与欧氏距离矩阵结果表明,文蛤波纹与黄色遗传距离最近,白双与黄双遗传距离相近,与红壳色的遗传距离最远.主成分分析显示白双文蛤与黄双文蛤在空间分布上相对重叠,波纹文蛤与黄色文蛤具有较高的重叠率,而红壳色文蛤相对分散,从而进一步说明5种壳色文蛤的遗传距离关系.经过1a同池养殖,子代壳长多数已达到10～30 mm,红壳色文蛤的日生长率为0.20%,花壳色文蛤的日生长率为0.18%,且红壳色文蛤的相对比较生长速度比花壳色文蛤快10.41%.红壳色文蛤选育子代的壳长与壳宽、壳高、粒重存在一定的回归关系.红壳色文蛤壳长对壳宽、壳高、粒重的回归方程分别为:y1=0.502 4x1-0.556 0(R2=0.992 0)、y3=0.8103x3+0.620 0(R2=0.995 6)、y5=0.000 3x25.9029(R2=0.991 9),花壳色文蛤壳长对壳宽、壳高、粒重的回归方程分别为:y2=0.495 3x2-0.419 2(R2=0.990 9)、y4=0.798 5x4+0.793 5(R2=0.995 6)、y6=0.000 4x26.845 8(R2=0.993 4).研究结果为文蛤的红壳色定向选育奠定了理论基础.     

两个地理群体香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)杂交子代早期生长发育的杂种优势研究

为探讨不同地理群体香港牡蛎的杂种优势,于2014年5月开展了广东珠海(Z,生长快)和广西茅尾海(M,抗逆性强)群体间的2×2双列杂交,比较了各实验组早期生长、存活优势,并计算了各阶段的杂种优势,实验由2个杂交组MZ(M♀×Z♂)、ZM(Z♀×M♂)和2个自交组MM(M♀×M♂)、ZZ(Z♀×Z♂)组成。结果表明:浮游期间,正交组(MZ)幼虫在9日龄前未表现出生长优势,但表现出一定的存活优势,幼虫大小存在显著的母本效应;12日龄时正交杂种优势5.34。反交组(ZM)幼虫生长和存活都表现出了正杂种优势,但生长优势值逐渐减小,到了12日龄时壳高与自繁组(ZZ)幼虫间差异不显著(P0.05)。室内苗种培育阶段,杂交稚贝表现出明显的生长、存活优势,正交组(MZ)和反交组(ZM)子代的生长优势分别为7.86±3.12、17.47±13.14;存活优势分别为8.33±1.41、2.86±1.08。以上结果说明两个群体香港牡蛎杂交可以产生杂种优势,可为牡蛎杂种优势开发利用提供参考。     

广西文蛤(Meretrix)的fAFLP 及ITS 分析

利用fAFLP标记技术和PCR-RFLP技术,对采集于广西的形态和壳色变异很大的2个文蛤群体(G、W)以及山东文蛤(S)群体进行了遗传结构和亲缘关系研究.fAFLP分析显示:在457个总扩增位点中存在53个W群体的特异性位点(其中9个为100%显性)、21个G群体的特异性位点、14个S群体的特异性位点,这些位点可作为群体鉴别的特征性标记;通过计算群体间相对遗传距离和聚类分析,发现S和G间的遗传距离最小(0.0424),在系统树上首先聚在一起,而W与S、G的相对遗传距离均很大(0.2308和0.2305),单独分出一支.对文蛤核糖体ITS的PCR-RFLP结果显示:W的三个不同壳色类群(WX、WC、WH)的酶切结果完全一致,而与G和S群体差别较大;G和S群体基本一致,但也稍有差别.进一步的ITS序列分析显示:W的ITS序列长度为1266-1269bp.而G和S分别为1614bp和1520bp;W群体内部序列比较保守,而与G和S群体之间在ITSl和ITS2开始和结尾处均存在多处插入/缺失;在依据序列构建的系统树上,WX、WC、WH三个类群聚在一起,S和G聚为另一支,两支相距甚远.本研究结果表明,fAFLP标记分析、PCR-RFLP分析和ITS序列分析结果一致,W群体和G、S群体的差异较大,已超出种内群体间的遗传变异,S和G尽管存在遗传分化,但仍应同属Meretrix meretrix-个物种.     

文蛤属(Meretrix)16S rRNA基因及ITS1序列的系统学分析

利用线粒体16SrRNA基因片段及核糖体DNA转录间隔区ITS1序列分析的方法,以近缘属的青蛤(Cyclinasinensis)为外群,对文蛤属的文蛤(M.meretrix)、丽文蛤(M.lusoria)、帘文蛤(M.lyrata)和斧文蛤(M.lamarckii)4种贝类进行了系统学研究。经ClustalX多重比对及DNAsp软件分析后,用PAUP4.0分析软件,计算出种间序列的碱基转换/颠换频率,利用邻接法NJ构建系统发育树。结果表明,帘文蛤与该属其他三种的分歧时间较早,两类序列与其他种类间的相对遗传距离分别在0.25866—0.28218和0.15644—0.20104之间。文蛤与丽文蛤间的16SrDNA及ITS1序列间的遗传距离仅为0.04805和0.04201,拓扑结构图显示关系很近,并且二者的分布区大面积重叠,其序列间的转换/颠换频率接近种内单元型(haplotype)间的序列变化,鉴于它们的贝壳形态有一定差别,应归为同一个种内的不同地理亚种比较恰当。     

盐度对文蛤孵化及幼体存活和生长的影响

国内外学者就盐度对文蛤幼体生长发育的影响有过一些报道,但仅局限于浮游幼虫期,而对受精卵孵化和稚贝期进行全面系统的试验研究,目前尚未见报道。本文分别以人工获得的文蛤受精卵、人工培育的浮游幼体和变态稚贝为试验材料,探索盐度对文蛤不同发育阶段生存、生长的影响规律,为人工育苗及稚贝中间育成提供参考。１　　材料和方法１．１　材料亲贝取自辽宁省盘锦市盘山县双台子河口中潮区砂岗,为３～４龄蛤。经阴干和流水刺激排放精卵,取适量受精卵为孵化期试验材料,其余受精卵在２５℃水温下经人工孵化、选育后,在４０ｍ~３水泥池…     

我国沿海不同地理原种文蛤(Meretrix meretrix)的SRAP分析

采用序列相关扩增多态SRAP(Sequence-related amplified polymorphism)标记对国家级江苏文蛤良种场(筹)保存的广西北海(GX)、江苏南通(JS)、辽宁大连(LN)三个地理种群原种文蛤进行种质资源分析。结果表明:(1)15对引物在文蛤3种群共扩增223个位点,其中多态位点数为159个,多态性位点百分率为71.30%,显示了较高的多态性;(2)GX、JS、LN3种群的多态性位点百分率分别为69.12%、57.81%、51.85%,平均杂合度分别为0.2532、0.2162、0.1836,香农信息指数分别为0.3649、0.3127、0.2714,均以GX种群最高,表明GX种群遗传多样性更为丰富;(3)3种群扩增位点显性基因频率的分布规律揭示,与LN和JS两种群相比,GX种群中低频基因位点显著增加,而隐性纯合基因位点显著减少,表明GX种群中存在大量稀有等位基因。各地理种群原种文蛤遗传多样性水平相对较高,遗传改良潜力大,GX种群作为选择育种的基础群更为适合。     

不同花纹文蛤(Meretrix meretrix)的外套膜蛋白质的双向电泳研究

采用双向电泳技术,对浙江乐清无花纹和有花纹文蛤外套膜的全蛋白进行了研究,并利用质谱和软件对差异蛋白进行了分析。经PDQuest软件分析,在pH4—7,分子量14.3—200kD之间,无花纹文蛤样品中检测到682±24个蛋白质点,有花纹样品检测到600±35个蛋白质点,平均匹配率为84.5%。研究结果显示,两种文蛤共有256个点存在差异表达,这些差异点可能与贝壳的颜色和花纹形成有关。其中98个点为无花纹文蛤特有,57个点为有花纹文蛤特有,另有101个点在表达量上存在两倍以上差异。在无花纹贝壳中发现分子量为42kD左右,等电点为6.4左右,与库蚊的肌动蛋白(分子量为41.7kD,等电点为5.3)匹配率较高;分子量为29kD,等电点为5.6,与飞鱿的肌动蛋白(分子量为29kD,等电点为5.25)匹配率较高的两个蛋白质。在有花纹文蛤中发现了分子量为27kD左右,等电点为4.8,与丽文蛤属的肌浆钙结合蛋白(分子量为20.8kD,等电点为4.98)匹配率较高。     

不同花纹文蛤(Meretrix meretrix)的ITS2分析

采用分子生物学方法,进行了江苏和广西两个地区不同花纹文蛤群体的核糖体DNA转录间隔区(ITS2)的序列分析研究。结果表明,广西的文蛤群体和江苏的群体相比较,仅发现江苏群体在333—336bp处发生了缺失,江苏群体内不同花纹文蛤个体间的ITS2也发生了变化。聚类分析结果证实了序列分析结果,广西文蛤群体和江苏文蛤群体间发生了遗传变异,江苏文蛤群体内部也发生了遗传分化。     

文蛤（Meretrix meretrix）4个壳色花纹品系的遗传差异分析

应用AFLP技术对文蛤红壳（RS）、黑斑（BS）、细纹（TC）、暗纹（DF）4个壳色花纹品系进行遗传差异分析。利用15对AFLP引物组合对4品系共128个个体进行了PCR扩增和电泳检测,共得到789个位点,总多态位点比例90．75％。Nei’s基因多样性和Shannon’s信息指数显示,4个品系的遗传多样性大小,依次为...     

文蛤(Meretrix meretrix)C-型凝集素基因的分子克隆及表达分析

C-型凝集素是一种重要的模式识别蛋白,本研究以文蛤为材料。利用PCR扩增和RACE技术首次获得了编码文蛤C-型凝集素的基因(Mm-CTL)c DNA序列,全长为1855bp,其开放阅读框为519bp,编码172个氨基酸。Smart软件预测Mm-CTL的糖识别结构域(CRD)从第34个氨基酸到第168个氨基酸。BLASTP序列相似性分析显示,Mm-CTL与大竹蛏氨基酸序列同源性最高,相似性为56.5%,与其它无脊椎动物的相似性为13.5%—23.9%。系统进化树分析与同源分析结果一致,其中Mm-CTL与双壳类C-型凝集素聚在一起,与大竹蛏亲缘性最近。环境胁迫实验显示,溶藻弧菌感染6h时Mm-CTL表达量明显上升,在12h时达到最高值,随后有所下降。盐度胁迫时Mm-CTL在盐度5时表达量相对较低,在盐度10—20中的表达量相对较高。温度胁迫时Mm-CTL在35°C时表达量相对最高,10°C时表达量明显较低。研究结果表明,文蛤应对环境因子影响可通过调节Mm-CTL的表达来应答免疫反应。本研究将为贝类先天性免疫因子研究以及病害的防控奠定基础。     

文蛤(Meretrix meretrix)精子的超微结构及精子入卵过程的电镜观察

利用透射电镜和扫描电镜对文蛤精子的超微结构及精子入卵过程进行了详细观察。结果显示,文蛤精子为典型的原生型,由头部、中段和尾部三部分组成,全长45—50μm。头部呈狭茧形,长约3.0μm,由顶体和细胞核组成,顶体呈倒"V"字形,前端有短柱状的凸起;细胞核为稍弯曲的圆柱形,内含高度浓缩的染色质,无核前窝,有核后窝。中段较短,仅0.6—0.7μm,由线粒体围绕中心粒复合体构成,5个圆球形的线粒体呈单层梅花状排列,内部为双层膜折叠成的片层状结构;中心粒复合体由近端中心粒和远端中心粒组成,而远端中心粒延伸出尾鞭的轴丝。尾部为细丝状鞭毛,长约42—45μm,内部的轴丝呈典型的"9+2"结构,外周有波浪状质膜包被。用扫描电镜观察了文蛤精子的入卵过程,大致将其分为顶体反应期、穿卵期和卵膜修复期。受精后2min,精子发生顶体反应,顶体泡破裂释放溶解酶使卵膜变得疏松,亚顶体腔中伸出的顶体丝先穿透卵膜;受精后4—6min,在精、卵的共同作用下,精子头部和中段逐渐穿过卵膜进入卵内,在卵膜上形成一个直径约1.5μm的孔道,而精子尾部则留于卵外;受精后8—10min,精子尾部脱落,受精形成的孔道被卵膜的微绒毛修复。另外对多种双壳贝类精子超微结构和线粒体入卵等问题进行了探讨。     

文蛤(Meretrix meretrix)铁蛋白的重组表达及其组织表达特征分析

构建了文蛤铁蛋白的重组表达质粒 pGEX-4T-1-MmeFer, 在大肠杆菌 Escherichia coli 中获得了重组蛋白, 经酶解和质谱鉴定该蛋白为重组文蛤铁蛋白(rGST-MmeFer), 切除 GST 标签的重组文蛤铁蛋白(rMmeFer)具有氧化和吸收铁离子的功能。利用 rGST-MmeFer 制备了兔抗文蛤铁蛋白的多克隆抗体, 进而利用 Western blot 的方法对文蛤铁蛋白的组织表达分布进行了研究。结果表明, 铁蛋白在文蛤各组织中均有分布, 其中消化腺中表达量最高, 足中表达量最低。此外, 利用实时定量PCR 分析了文蛤消化腺、外套膜和鳃组织中铁蛋白 mRNA 的表达, 发现铁蛋白 mRNA 在外套膜中表达量最高, 消化腺次之, 鳃中表达量最低, 差异达到显著水平(P<0.05)。上述结果为进一步研究铁蛋白参与贝类贝壳形成的分子机制奠定了基础。     

两种三元杂交菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)壳色品系间的聚合杂交

采用完全双列杂交配组方法,以三元杂交菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)壳色品系两道红白斑马(TrWz)和红白斑马(OWz)为材料,进行了2种壳色蛤仔品系间的聚合杂交研究。结果表明,浮游期间杂交组幼虫表现出微弱的的生长优势及一定程度的存活劣势;中间育成期间稚贝表现出微弱的生长劣势及明显的存活优势。三元杂交自交组两道红白斑马子代均出现了壳色分离现象,而红白斑马子代均为白斑马,且壳面花纹颜色为红色;正反交组子代均表现为两道红白斑马,其壳色表达具有显著的母本效应;但其壳色表现呈现出非伴性遗传。     

文蛤(Meretrix meretrix)幼虫发育过程中细胞凋亡和Caspase 功能分析

以文蛤为研究对象,利用TUNEL技术(Terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP Nick End Labeling)检测了文蛤各发育阶段的幼虫中细胞凋亡的部位,利用Caspase原位标记分析了有活性的Caspase在幼虫中的分布情况,用Caspase抑制剂Z-VAD-FMK处理受精后4天和5天的变态前幼虫,同时以抑制剂的有机溶剂DMSO(Dimethyl sulfoxide)作对照,根据其对幼虫变态的影响,分析Caspase在文蛤幼虫变态中的作用.细胞凋亡检测结果显示,幼虫发育过程中发生细胞凋亡的部位主要在壳顶幼虫的面盘,说明细胞凋亡可能是文蛤幼虫变态过程中面盘退化的主要机制;在担轮幼虫至壳顶幼虫中都检测到有活性的Caspase,说明整个幼虫形态变化过程中都有Caspase的参与;用Caspase特异性抑制剂处理变态前幼虫,发现处理组幼虫变态率均显著低于对照组(P<0.05),说明Caspase在变态早期和晚期都有重要作用,同时发现DMSO对幼虫变态有诱导作用,可以在生产中加以利用.