HIV-1 Gag蛋白酵母表达产物的纯化及免疫原性检测

目的 纯化HIV-1Gag蛋白，并检测其免疫原性。方法 将表达HIV-1Gag蛋白的酵母工程菌GS115／pPICGAG接种到YPD培养基中多次传代后，用PCR检测其目的基因。该酵母工程菌在BMMY培养基中经甲醇诱导表达，上清液初步浓缩后上柱进行凝胶过滤层析，并将纯化蛋白免疫Balb／c小鼠，检测其血清抗体水平。结果 该酵母工程菌经多次传代后外源基因不丢失。Western blot检测结果表明纯化蛋白具有很好的反应原性，其纯度可达85％。纯化蛋白免疫小鼠后可诱导特异性抗体产生。结论 表达HIV-1Gag蛋白的酵母工程菌具有很好的遗传稳定性，其表达产物可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。     

两种HBsAg/GM-CSF融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达、纯化及其免疫原性比较

目的:利用毕赤酵母表达系统表达两种融合形式的乙肝病毒表面抗原(HBsAg-s和s-HBsAg),并对融合蛋白的免疫原性进行研究。方法:用毕赤酵母分泌型表达质粒pPIC9k为载体,通过PCR方法引入(Gly4Ser)3连接肽的编码基因将GM-CSF融合到HBsAg基因的3′端或5′端进行分泌表达,表达产物以SDS-PAGE及Western blot进行分析并通过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱进行蛋白纯化。将纯化的两种融合蛋白与单纯的HBsAg蛋白分别免疫小鼠,ELISA方法检测HBsAg特异的抗体反应水平。结果:两种HBsAg/GM-CSF融合蛋白均可在毕赤酵母菌株GS115中获得了分泌表达,Western blot分析表明表达产物能够与抗GM-CSF抗体及抗HBsAg抗体发生特异性结合。免疫后的血清ELISA结果显示,相比单纯的HBsAg蛋白,两种融合蛋白可以诱导出更高的抗体水平(P<0.05),其中将GM-CSF蛋白融合在HBsAg蛋白的C端效果要好于融合在N端。结论:通过与GM-CSF蛋白的融合可以显著增强HBsAg的免疫原性,这为提高乙肝疫苗的免疫效果提供了新的思路与方法。     

口蹄疫病毒 VP1 蛋白在酵母中的表达及免疫原性分析

目的 :利用毕赤酵母表达系统表达牛O型口蹄疫外壳蛋白(FMDVVP1) ,并对表达的蛋白进行免疫原性鉴定。方法 :将FMDVvp1基因克隆到毕赤酵母Pichiapastoris分泌性表达载体pSuperY中 ,构建重组表达载体pSuperY/vp1,经测序证明vp1基因序列的正确性。将纯化的重组质粒经线性化酶切后 ,用电转化法将pSuperY/vp1导入毕赤酵母菌种SMD116 8H中。对表达产物用SDS PAGE和Westernblot进行分析 ,并用酵母表达的FMDVVP1蛋白免疫小鼠。结果 :以重组质粒pSuperY/vp1转化毕赤酵母菌后 ,能表达相对分子量 (Mr)为 6 6 0 0 0和4 30 0 0的FMDVVP1蛋白。动物免疫结果表明 ,FMDVVP1蛋白能诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答。结论 :在毕赤酵母中成功地表达FMDVVP1蛋白 ,为研制新型FMDVVP1的基因工程疫苗奠定了基础     

毕赤酵母表达肽抗生素hPAB-β的纯化

目的 在成功构建肽抗生素hPAB-β重组毕赤酵母的基础上,深入探讨酵母表达hPAB-β的规模化纯化方法.方法 采用高密度发酵法在3.7L发酵罐中对pPIC9K-hPAB-β/GS115优5重组菌株进行发酵,收集发酵液,依次采用W-UF-II过滤系统超滤、反相层析、阳离子交换、分子筛层析等纯化技术对目标表达产物逐级进行纯化,目的 蛋白用15%的Tricine-SDS-PAGE电泳进行跟踪分析.最终纯化产物的生物学活性用平板琼脂扩散法进行测定.结果 在培养至工程菌菌体湿重约200~250g/L时,以甲醇诱导培养基诱导目的 蛋白表达,48h后菌体湿重达280g/L,目标产物表达量约75mg/L.发酵液经Mr10000膜超滤,达到去除大部分酵母色素和浓缩样品的目的 (体积浓缩约2/3).再经反相层析、离子交换、分子筛层析纯化,最终目的 产物的纯度达98%以上,得率达32.5%.且纯化的目的 蛋白具有良好的杀灭金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的活性.结论 酵母表达肽抗生素hPAB-β经膜超滤、反相层析、离子交换和分子筛层析四步纯化,实现了去除非目的 蛋白、酵母色素及脱盐的目的 ,为规模化制备hPAB-β创造了前提.     

复合干扰素在毕赤酵母中的分泌表达、纯化及活性分析

目的 在毕赤酵母中高效分泌表达复合干扰素。方法 根据毕赤酵母密码子偏性合成了复合干扰素基因，克隆至分泌型酵母表达载体pMKX9K，线性化后转化毕赤酵母GS115，筛选高表达菌株。诱导后的培养上清经过离子交换，疏水层析，凝胶过滤三步层析纯化，用细胞病变抑制法测定其活性，并结合Iowry法蛋白定量计算其比活性。结果 SDS-PAGE分析显示，重组蛋白以可溶性分子的形式存在于上清液中，经纯化后纯度达到96％，其N端氨基酸序列与理论值一致，比活与干复津相当。结论 复合干扰素在毕赤酵母中获得高效分泌表达，为获得大量基因工程产品奠定了基础。     

EGF在毕赤酵母中的表达及活性测定

目的高效表达和纯化有活性的EGF蛋白。方法将含有表皮生长因子(EGF)基因的质粒pAO815通过LiAc法转入毕赤酵母细胞中,筛选在MM平板上生长缓慢的Muts型酵母工程菌,甲醇诱导基因表达产生EGF,柱纯化后利用SDS-PAGE检测到EGF的生成,MTT法及新生小鼠皮下法分别检测活性。结果 SDS-PAGE电泳检测EGF成功表达和纯化,MTT法测定EGF生物活性约为2.8×106IU/mL。结论本研究构建的工程菌株能高效表达EGF,且纯化的EGF具有与天然EGF同样的体外和体内活性。     

重组人白介素18在毕赤酵母中的高效分泌表达

目的:构建人白介素18(hIL-18)真核表达载体, 在毕赤酵母中高效分泌表达hIL-18.方法:通过PCR法扩增得到hIL-18基因, 构建其真核表达载体pPICZaC/hIL-18, 电转化毕氏酵母X-33, PCR、 SDS-PAGE、 Western blot等方法筛选获得高效表达rhIL-18的工程菌株, 疏水层析和阴离子交换层析纯化表达产物, 并初步测定其生物学活性.结果:rhIL-18经甲醇诱导后其表达产量约为202 mg/L.Western blot检测了rhIL-18的特异性结合活性; rhIl-18纯化后纯度达95%左右, 并证明rhIL-18能够协同IL-2诱导PBMC分泌IFN-γ.结论:构建了重组hIL-18的基因工程菌, 并在毕赤酵母中实现了高效分泌表达, 为进一步研究其活性和功能奠定了基础.     

重组人角质细胞生长因子在毕赤酵母中的表达、纯化及活性测定

目的:利用巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)重组表达人角质细胞生长因子(humankeratinocytegrowthfactor,hKGF),为实现规模化生产重组hKGF奠定基础。方法:根据已报道的hKGF成熟肽序列,人工合成由毕赤酵母偏好密码子组成的编码hKGF的DNA片段后连接到分泌型表达质粒pPICZαA中,获得重组表达质粒并转化毕赤酵母X-33中进行表达。优化发酵条件,并利用5L生物反应器进行中试发酵。发酵上清通过超滤及层析方法分离纯化重组蛋白,并利用MMT法检测其对恒河猴肺上皮细胞的促增殖活性。结果:在20℃,甲醇诱导60h后,获得分子量约为28kD的目的蛋白,表达量约占菌体上清总蛋白的14.1%。发酵液经肝素亲和层析和SephardexG-25分子筛分离获得纯度为95.0%以上的重组蛋白,得率为12mg/L。该重组hKGF具有糖基化修饰,能显著促进恒河猴肺上皮细胞增殖,其ED₅₀约为57μg/L。结论:利用毕赤酵母成功表达出糖基化修饰及具促恒河猴肺上皮细胞增殖活性的重组hKGF。     

重组人sCR1在巴斯德毕赤酵母细胞中的表达、纯化及鉴定

目的:酵母细胞SMD1168表达人sCR1,并对重组蛋白进行纯化。方法:从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPIC9K,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9K-sCR1);经测序鉴定正确后,将重组质粒转化入毕赤酵母菌细胞SMD1168中,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析及Western blot鉴定,并通过Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化。结果:经甲醇诱导的含pPIC9K-sCR1的酵母细胞表达出重组人sCR1的融合蛋白,48～72hsCR1融合蛋白表达量最高。此蛋白在凝胶上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论:人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

EB病毒VCA基因片段在毕赤酵母中的表达及临床应用

目的 探讨EB病毒(Epstein-Barr vires,EBV)壳抗原VCA-BALF4(S)和VCA-BFRF3重组蛋白在鼻咽癌血清学诊断中的应用.方法 以EBV DNA为模板,采用PCR法扩增目的 基因片段BALF4(S)和BFRF3,与毕赤酵母表达载体pPICZaA连接,转化酵母菌GS115,甲醇诱导重组蛋白表达.表达产物经SDS-PAGE、免疫印迹法鉴定后,纯化目的 蛋白作为包被抗原,制备ELISA试剂检测鼻咽癌患者和正常人群EBV-IgA抗体.结果 在毕赤酵母菌中成功高效地表达了分泌型的VCA-BALF4(S)和VCA-BFRF3重组蛋白,相对分子质量分别为37×10~3和18×10~3,免疫印迹证实目的 带均有免疫原性,目的 蛋白经纯化后作为包被抗原检测鼻咽癌患者和健康对照的敏感度和特异度分别为71.0%和91.8%(VCA-BFRF3)、88.7%和96.4%[VCA-BALF4(S)].结论 毕赤酵母系统高效分泌表达了VCA-BALF4(S)和VCA-BFRF3重组蛋白,对两种重组抗原在鼻咽癌血清筛选中的诊断价值进行了初步评估,获得了在鼻咽癌筛选中有一定应用价值的pPICZa-BALF4(S)生产酵母工程菌株.     

人TPO N端结构域在毕赤酵母中的分泌表达及产物鉴定

目的在酵母系统中分泌表达人ＴＰＯＮ－端结构域，对其生物学活性进行初步研究，为与其它ＴＰＯ分子进行ＴＰＯ糖基化生物学意义的研究打基础。方法将编码人ＴＰＯ成熟肽Ｎ端１９５个氨基酸的ｃＤＮＡ与酵母整合型载体ｐＰＩＣＺαＡ重组，构建的重组质粒用ＤｒａⅠ消化成线性ＤＮＡ，转染酵母细胞ＧＳ１１５，使ＴＰＯ基因整合到酵母染色体上；用ＴＰＯ抗体筛选获得遗传性分泌稳定表达的重组酵母细胞株；用ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ鉴定ＴＰＯ产物及分子量；用对小鼠骨髓细胞形成巨核细胞集落形成单位（Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ，ＣＦＵ－Ｍｅｇ）的方法测定活性。结果获得了ＴＰＯＮ－端结构域在酵母系统中的分泌表达，表达产物可被ＴＰＯ抗血清识别，分子量约为２２０００；其产物对小鼠骨髓细胞形成ＣＦＵ－Ｍｅｇ具有明显的刺激作用。结论在巴氏毕赤酵母系统中成功地分泌表达了有生物学活性的人ＴＰＯＮ－端结构域     

重组人白细胞介素10在毕赤酵母中的表达及生物学活性测定

目的在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人白细胞介素10(rhIL-10),用于IL-10的生理功能研究和动物试验。方法通过PCR扩增IL-10基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点处,再将融合基因αIL-10重组到表达质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,SalⅠ酶切线性化重组质粒IL-10/pPIC9K,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的基因IL-10,甲醇诱导rhIL-10的表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定目的蛋白,用ELISA定量测定及MC/9细胞分析IL-10生物学活性。结果成功构建了重组表达质粒IL-10/pPIC9K,获得了4个含IL-10基因的高拷贝毕赤酵母转化子,甲醇诱导后,在摇瓶水平的IL-10表达量为(0.627±0.09)mg/L,比活性为1.5×105U/mg。结论毕赤酵母分泌表达的IL-10具有良好的生物学活性。     

人sTNFR II-IgG Fc融合蛋白在毕赤酵母菌中的表达及其产物分析

目的:在毕赤酵母菌中表达sTNFR II-IgG Fc融合蛋白。检测融合蛋白是否形成二聚体,并对其N-糖链进行分析。方法:从人淋巴细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增目的基因sTNFRII与IgG Fc,然后利用重叠延伸PCR得到嵌合体基因sTNFRII-IgG Fc,并将其插入pPIC9载体中。以重组载体转化巴斯德毕赤酵母菌中进行克隆与表达。采用ELISA筛选高表达sTNFR II-IgG Fc融合蛋白的重组毕赤酵母菌株,对融合蛋白通过还原和非还原SDS-PAGE分析其二聚体结构,采用L929细胞检测融合蛋白抗TNF-α的生物学活性,最后利用荧光辅助糖电泳(FACE)分析融合蛋白的N-糖链。结果:成功地建立了可分泌表达sTNFR II-IgG Fc融合蛋白的重组酵母菌株,摇瓶培养后融合蛋白的表达量为2mg/L。SDS-PAGE和Western blot表明,该融合蛋白能自然形成二聚体结构;可抑制TNF-α对L929细胞的杀伤作用,其中和5×104U/LTNF-α的EC50为170μg/L。FACE分析融合蛋白N-糖链的大小为11~13个糖残基。结论:在毕赤酵母菌中成功地表达了sTNFR II-IgG Fc融合蛋白,为在毕赤酵母菌中表达其他的Fc融合蛋白和抗体提供了参考。     

VEGF_(165)cDNA在酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究

目的研究人 ＶＥＧＦ１６５基因在 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母中的表达,获得高效表达、具有生物学活性的重组ｈＶＥＧＦ１６５。方法采用ＰＣＲ扩增ｈＶＥＧＦ１６５基因,经ＤＮＡ序列分析后,插入含ＡＯＸ１启动子和α分泌信号肽序列的Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母表达载体中,构建重组质粒ｐＰＩＣ９Ｋ／ｈＶＥＧＦ１６５。经转化酵母宿主菌ＫＭ７１,筛选多拷贝整合转化子,摇瓶培养,用 １０ ｍＬ／Ｌ甲醇诱导表达。表达产物经Ｈｅｐａｒｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂ亲和层析纯化后,以人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）测定其生物学活性。结果ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示,表达产物以可溶性分子的形式存在于上清中,诱导４ｄ的表达量达上清中总蛋白的６０％以上。 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ表明,表达产物具有良好的抗原性和特异性。经Ｈｅｐ－ａｒｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂ亲和层析纯化, ｒｈＶＥＧＦ１６５的纯度可达到９０％以上。生物学活性检测证实,其具有刺激脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）增殖的活性。结论在 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ表达系统中,实现了ｈＶＥＧＦ１６５的高效分泌性表达。     

中国株HIV-1结构蛋白基因gag与gp120在巴斯德毕赤酵母中的融合表达

目的：将中国流行株B亚型HIV－1结构蛋白基因gag和gp120的巴斯德毕赤酵母中进行融合表达。方法：以酵母分泌型表达质粒pPIC9为载体，构建含HIV－1 gag和gp120嵌合基因的重组酵母表达质粒pPICGP。用Sac I将pPICGP线性化后，电转化巴斯德毕赤酵母GS115，用PCR的方法鉴定阳性酵母转化子。阳性转化子在巴斯德毕赤酵母中用甲醇进行诱导表达，表达产物以SDS－PAGE和Western blot进行分析，并对阳性菌株的遗传稳定性进行研究。结果：12个酵母转化子中共筛选到了8个阳性酵母转化子，其整合率为66．7％。SDS－PAGE和Western blot分析显示，在相对分子质量（Mr）为57000处有1条特异蛋白带，且能与抗p24单抗（mAb)和抗gp120mAb发生反应。酵母转化子在YPD培养基上传代10次后，其外源基因未丢失。结论：在巴斯德毕赤酵母中成功地表达了HIV－1 gag-gp120嵌合基因，且表达蛋白具有特异性，但其Mr较预计计算的值要小，说明嵌合基因中的gp120基因只有部分进行了表达。