重组人白细胞介素21表达条件的探讨

目的探讨重组人白细胞介素21工程菌诱导表达的最佳条件。方法用摇瓶发酵的方法探索不同诱导条件(诱导温度、诱导时间、接种量I、PTG浓度等)对目的蛋白质表达的影响。结果该工程菌表达目的蛋白质的最佳温度是42℃;高密度接种更有利于目的蛋白质的表达。结论建立了BL21/pET-30a(+)-IL21工程菌最佳诱导表达条件,为重组人白细胞介素21的制备奠定了基础。     

重组复合干扰素摇瓶发酵条件的研究

目的对表达重组复合干扰素(con-IFN)的工程菌E.coli DH5α的摇瓶发酵条件进行研究。方法利用单因素比较实验及正交试验等方法考查工程菌摇瓶发酵条件,探讨发酵条件对工程菌的生长和con-IFN表达的影响。结果优化后条件为培养基含玉米粉6%、牛肉膏5.5%、谷氨酸钠0.5%,发酵液初始pH 7.2,30℃培养7 h后升温至42℃诱导表达6 h,转速220r/min,装样量10%,接种量2%。结论优化后平均蛋白质表达量达到36.39%,和LB培养基相比,目的蛋白质表达量提高了4.8%,为工程菌的大规模发酵提供参考。     

重组人白细胞介素-18工程菌的培养及高密度发酵

目的优化重组人白细胞介素-18的发酵工艺,以获得工程菌的高密度发酵和目的蛋白的高表达.方法在10L发酵罐中,研究重组人白细胞介素-18工程菌在不同的pH值、溶氧和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响.结果根据优化条件,连续三批重复发酵10L工程菌,最终菌体密度均达A600nm=28,菌体获得量均可达湿重50g?L-1以上.目的蛋白表达量均为40%以上.结论优化了重组人白细胞介素-18基因工程菌的发酵和表达条件,为规模化生产奠定了基础.     

重组人白细胞介素-21的原核表达及其复性与纯化

目的构建工程菌BL21/pET30a(+)-IL-21表达体系,表达并纯化出具有生物学活性的目的蛋白质。方法用基因工程方法构建表达质粒pET30a(+)-IL-21;在BL21大肠杆菌中诱导表达基因重组人白细胞介素-21(rhIL-21);提取包涵体并建立复性条件;用Ni-NTA凝胶纯化出rhIL-21;以NK92为效应细胞,观察rhIL-21对NK92的生物学作用,以此检测其活性。结果构建了重组质粒pET30a(+)-IL-21,工程菌BL21/pET30a(+)-IL-21能大量表达目的蛋白质;经复性和纯化得到具有生物学活性的rhIL-21。结论成功建立了人IL-21的原核表达体系,得到了有生物学活性的rhIL-21蛋白质。     

溶氧浓度对rhG-CSF工程菌高密度发酵的影响

目的确定rhG-CSF工程菌高密度发酵的最佳溶氧浓度。方法通过通入纯氧,高密度发酵的溶氧值可以精确控制。考察不同溶氧浓度对工程菌的生长、质粒丢失率、乙酸积累情况以及rhG-CSF表达的影响,来确定溶氧的最佳控制范围。结果工程菌生长阶段溶氧控制在25%,诱导后控制在35%,最有利于菌体生长和外源蛋白表达,最终菌体密度为(79.6±2.1)g/L,表达量为(40.2±1.2)%。结论溶氧对工程菌rhG-CSF高密度发酵有显著影响。     

重组人胰岛素样生长因子-Ⅰ工程菌高密度发酵工艺优化

目的优化表达重组人胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)工程菌的高密度发酵条件。方法考察培养基以及诱导时机、诱导剂量和诱导时间对蛋白表达的影响;用自控发酵罐进行分批补料培养实验,确定优化工艺条件。结果以2×YT+0.5%葡萄糖为发酵培养基,经0.8 mmol/L IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导5 h,通过pH-stat反馈补料方式实现工程菌高密度发酵与目的蛋白高效表达,每1 L发酵液收获干菌体50.1 g,IGF-Ⅰ含量达5.25 g/L。结论建立了IGF-Ⅰ工程菌优化的高密度发酵工艺,为IGF-Ⅰ的下游纯化和工业化生产奠定了基础。     

重组大肠杆菌高密度生产G-CSF发酵工艺优化

目的优化重组人粒细胞集落刺激因子,以获得工程菌的高密度发酵和目的蛋白的高表达。方法借助正交实验,在14L发酵罐中,研究重组人粒细胞集落刺激因子工程菌在添加不同浓度钾盐、钠盐和镁盐后对质粒稳定性和目的蛋白表达的影响。结果在高浓度盐的环境下,菌株的比生长速率和质粒稳定性均显著提高,从而提高目的蛋白的表达量。结论获得一种高效生产人粒细胞集落刺激因子的方法。     

内皮抑素融合蛋白的发酵与纯化

目的对内皮抑素融合蛋白的发酵和纯化工艺进行研究。方法利用 5L发酵罐 ,设定了溶氧、搅拌速度、补液量、补液时机和补液速度等发酵条件 ;用硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤、离子交换色谱等方法纯化目的蛋白质。结果工程菌目的蛋白质表达量占菌体总蛋白质的 2 0 % ;纯化后纯度达 95 %以上。结论研讨了大肠杆菌高效表达内皮抑素融合蛋白发酵及纯化工艺 ,为实际应用奠定了基础。     

表达谷胱甘肽S转移酶-蜂毒素-~(88)精氨酸变体白细胞介素2工程菌的发酵条件研究

目的研究重组蜂毒素-88精氨酸变体白细胞介素2(Melittin-88ArgIL-2)工程菌的发酵条件。方法采用摇瓶发酵,对含pGEX-4T-2-Melittin-88ArgIL-2重组质粒的工程菌进行诱导表达,研究诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度、培养基的pH值等对谷胱甘肽S转移酶-Melittin-88ArgIL-2表达量的影响。同时研究培养温度对产物表达形式的影响。结果根据优化的条件,蛋白质的表达量占菌体总蛋白质的36%左右。结论确立了该重组melittin-88ArgIL-2工程菌的发酵条件。     

表达GST-NK4工程菌的发酵工艺研究

目的建立重组GST NK4融合基因工程菌的发酵工艺。方法采用摇瓶、发酵罐发酵,对影响工程菌生长和表达的条件如pH值、诱导时间及诱导剂浓度等进行优化。结果根据优化的条件,15L发酵罐发酵11h ,菌体收获量可达到湿重(2 4 .6±0 .98)g/L ,目的蛋白质的表达量占菌体总蛋白质的5 0 %左右。结论确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺     

重组人IL-24的表达及其体外抗肿瘤细胞活性的研究

目的 构建重组人白细胞介素24(recombinant human interleukin 24,rhIL-24)表达载体并在大肠杆菌中表达,体外评估rhIL-24的生物学活性.方法 用基因工程方法构建rhIL-24表达载体并在大肠杆菌巾表达rhIL-24.表达的重组蛋白经层析法纯化后,分别用噻唑蓝比色法和蛋白印迹法检测rhIL-24对肿瘤细胞生长的影响和对内源性IL-24的诱导,用实时PCR检测不同肿瘤细胞与rhIL-24共孵育后细胞内的胱天蛋白酶3(caspase 3)mRNA变化.结果 rhIL-24能在大肠杆菌中高效表达,并能明显抑制多种肿瘤细胞生长.rhIL-24能诱导正常MRC.5细胞和多种肿瘤细胞产生内源性IL-24,并能改变肿瘤细胞的胱天蛋白酶3水平.结论 rhIL-24能在大肠杆菌中高效表达,且具有生物学活性.     

人胰岛素原在基因工程菌中的高效表达

目的　构建RRhPI-pQE4. 0E .coliM15表达系统 ,以高效表达 (His) 6 -Arg -Arg -人胰岛素原。方法　正交法优化发酵条件 ,通过湿菌体收率、包涵体收率及发酵液A60. 0 的测定对优化结果进行评估 ,并进一步分析发酵过程中主要因素对高密度发酵和高效表达的影响。结果　发酵条件优化后 ,每升发酵培养基可得湿菌体约 4 3g ,包涵体约 14g(湿重 )。结论　优化发酵条件可使湿菌体及包涵体的收率提高。     

抗阿尔茨海默病神经保护肽[Gly14]-Humanin融合基因工程菌发酵工艺研究

目的优化大肠杆菌表达重组[Gly14]-Humanin(HNG)融合基因工程菌的发酵工艺。方法在15L发酵罐内,研究培养基、培养条件和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,并考察工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果工程菌在pH7.4的2×YT培养基中诱导5h,菌体湿重可达80g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的36%,所构建的重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。结论优化了HNG融合基因工程菌的发酵和表达条件,为药物中试研究和规模化生产奠定了基础。     

rhIL-6大肠杆菌高效表达的影响因素及其产品中试的研究

研究自构建的重组人白细胞介素－ ６（ｒｈＩＬ－６）基因工程菌株高效表达的影响因素及其ｒｈＩＬ－６产品中试工艺。方法：①将ｒｈＬ－６－ＰＢＶ重组质粒转化至ＲＲＩ、ＪＭ１０３和 ＤＨ５ ａ不同宿主菌中,在Ｍ９ＣＡ和 ＬＢ培养基中,４２℃诱导培养不同时间（３～６ ｈ）,观测 ｒｈＩＬ－６不同表达效率。②采用 １０ Ｌ发酵罐诱导培养,经破菌－洗包－溶包初步纯化后,再经三步柱层析纯化,提取ｒｈＩＬ－６。结果：①ｒｈＩＬ－６在ＤＨ５ ａ大肠杆菌中（ＳＤＨ－９４５株）表达效率高;可达 ３９％,用 Ｍ９ＣＡ培基,４２℃诱导培养 ５ｈ可使表达效率提高到４１％,②ＳＤＨ－９４５菌株在５批 １０Ｌ Ｍ９ＣＡ发酵诱导培养 ５ ｈ,ｒｈＩＬ－６表达效率可达 ３５． ８７±２． ６５％。经初步纯化后,ｒｈＩＬ－６的纯度达 ７４． ８７±３． ６８％,再经三步柱层析后,纯度可达 ９５％以上,比活性达 ４ × １０８ Ｕ／ｍｇ,总得率稍低可达 ２３．１％．结论：①ＳＤＨ－９４５工程菌株在 Ｍ９ＣＡ培养基巾,４２℃诱导培养 ５ ｈ,ｒｈＩＬ－６表达效率最佳。②１０ Ｌ发酵和纯化工艺可获高效价、高比活性、高纯度的ｒｈＩＬ－６合格生物制品。     

重组人血管生长素基因工程菌发酵条件的初步研究

目的研究表达重组人血管生长素 (rhANG)工程菌的发酵条件。方法采用摇瓶发酵 ,研究不同宿主菌对表达rhANG的影响 ,同时对培养基、诱导时期、诱导时间和初始pH等发酵条件以及质粒稳定性进行研究。结果选用E .coliCDH为宿主菌 ,在SOB培养基中培养至A6 0 0nm 为 0 .5～ 0 .6时 ,诱导表达 5h ,rhANG表达量最高达 30 %。重组质粒具有良好的分离稳定性和结构稳定性。结论此发酵条件可以较好地提高rhANG的表达量 ,为发酵规模的扩大奠定了基础     

rhIL-6表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

通过PCR技术扩增出约0.5kb的IL-6基因片段,并且采用含有P_RP_L串联启动子及SD区的高效表达载体pBV_220,经DNA重组技术,成功地构建了rhIL-6的基因工程菌E.coli DH_5a/pBV_220IL-6。所表达的IL-6经SDS-PAGE证明约17.5kD,表达量占菌体总蛋白的30%以上。以IL-6依赖细胞株MH_60·BSF_2检测,表达产物粗提物1:100复性后效价可达到5×10~8u/ml,每升发酵菌液可获10~12u IL-6粗品。     

重组人乙型肝炎病毒核糖核酸酶H基因工程菌发酵条件的初步研究

目的研究表达乙型肝炎病毒核糖核酸酶H1及H2 (HBV -RNaseH1及H2 )工程菌的发酵条件。方法采用摇瓶发酵,研究不同宿主菌表达HBV- RNaseH1及H2的效果,同时对培养基、诱导时期、诱导时间、初始pH值等发酵条件以及质粒稳定性进行研究。结果选用EcoliBL2 1为宿主菌,在LB培养基中培养至A60 0nm为0 .6时,诱导表达4 .5h ,HBV- RNaseH1及H2表达量最高达33.6 %和30 .8%。且重组质粒具有良好的分离稳定性和结构稳定性。结论此发酵条件可以较好地提高HBV- RNaseH1及H2的表达量,为发酵规模的扩大奠定基础