一个油茶FAD2基因家族新成员的克隆及分析

FAD2基因是控制油酸向亚油酸转化的关键基因,决定了植物中油酸/亚油酸的含量与比例。本研究对一个油茶FAD2基因家族新成员的特征及其在油茶种子发育过程中的表达模式进行了分析。结果显示,新克隆得到的油茶FAD2基因CoFAD2-2(登录号:JQ739518)与已知的FAD2-1基因(登录号:KJ995981)差异较大,CoFAD2-2全长为1 558 bp,包含5'UTR 162 bp、3'UTR 247 bp和1 152 bp的开放阅读框,编码了383个氨基酸,该基因无内含子。CoFAD2-2基因编码蛋白具有4个跨膜区、含3个位置保守的组氨酸簇、定位于内质网上。系统发生分析表明该基因与多数油料植物FAD2基因亲缘关系较近,尤其与油橄榄的FAD2-2基因亲缘关系最近。CoFAD2-2基因在开花后42~44周高表达,其他阶段一直维持在很低的水平。这与油茶种子中亚油酸含量变化相吻合。本研究结果为油茶的分子育种提供了新的基因资源。     

陆地棉GhLEA3基因的克隆及其响应低温胁迫表达分析

【目的】本研究旨在探索棉花GhLEA3基因的结构特征及其在低温胁迫下的表达模式,研究其抗逆功能。【方法】利用同源序列克隆法在陆地棉中克隆GhLEA3;采用生物信息学方法分析其蛋白质性质,构建系统进化树。采用In-Fusion连接技术构建融合蛋白表达载体35S∷GhLEA3-GFP并进行亚细胞定位;在棉花三叶期进行叶片低温表达分析;采用农杆菌介导的花序浸染法将GhLEA3基因转入拟南芥;对T_3转基因拟南芥种子进行4℃低温萌发试验;低温处理后测转基因拟南芥叶片的电导率。【结果】GhLEA3基因编码序列全长1 218bp,编码405个氨基酸;GhLEA3蛋白含有4个功能结构域PF02987。陆地棉GhLEA3与拟南芥AtLEA3氨基酸序列之间相似性为52.6%。GhLEA3蛋白可能定位在液泡和小泡中。GhLEA3基因在低温处理的棉花叶片中上调表达。T_3转基因拟南芥低温萌发率显著高于野生型,低温处理后转基因拟南芥叶片电导率显著低于野生型。【结论】陆地棉GhLEA3属于典型的LEA3家族成员,与拟南芥AtLEA3亲缘关系最近;该基因响应低温胁迫,可能在抗冷中起重要作用。     

花生干旱胁迫响应基因的数字表达谱分析

以抗旱性强的花生品种丰花5号为材料,利用Solexa高通量测序技术对15% PEG处理后的花生叶片cDNA文库进行差异基因表达谱分析。结果表明,转录组基因表达表现出高度的不均一性和冗余性,低于10个拷贝的标签占总标签种类的73.1%,但其表达量只占总标签表达量的9.0%。根据已知序列信息鉴定出935个差异表达基因,其中64.5%下调表达。基因功能分析表明,差异表达基因广泛涉及糖、蛋白、核酸和脂类等生物大分子代谢、能量代谢以及次生代谢过程。在花生干旱响应基因表达谱分析中,发现9个类黄酮代谢相关基因在干旱胁迫下显著上调表达,其中4个编码类黄酮合成酶类,3个编码甲基转移酶,2个编码MYB转录因子。通过半定量RT-PCR对花生苯丙氨酸解氨酶基因(AhPAL)表达分析表明,15%PEG干旱胁迫6 h诱导该基因显著表达。推测类黄酮代谢在花生干旱胁迫响应中起重要作用。     

谷子LEA＿1基因家族鉴定及其渗透胁迫响应

胚胎发育晚期丰富(late embryogenesis abundant,LEA)蛋白在植物响应多种非生物胁迫过程中具有重要作用。基于表达谱测序数据我们分析了抗旱谷子品种(GG)和干旱敏感品种(JF)在PEG胁迫0.5 h前后LEA基因的表达变化,发现谷子LEA_1家族的Seita.6G114000基因在抗旱性不同的谷子品种中胁迫响应模式不同;利用同源序列比对和保守结构域分析我们系统鉴定得到5个谷子LEA_1家族蛋白(PF03760),该家族基因序列短,启动子区皆含多个ABRE元件,蛋白质N端序列高度保守;通过分析NCBI数据库中谷子转录组测序数据(SRA062640),发现谷子LEA_1家族基因在‘豫谷1号’中PEG胁迫7 h前后转录本丰度变化显著,表明LEA_1家族蛋白在谷子应对干旱胁迫过程中发挥重要作用。上述结果为深入研究LEA_1基因在逆境应答中的功能提供参考。     

大白菜TPS基因家族鉴定及其在高温胁迫下的表达分析

为明确大白菜TPS(BrTPS)家族成员信息及对高温胁迫信号的响应,本研究利用生物信息学方法,在大白菜基因组数据库中鉴定了BrTPS基因家族成员,并对其理化性质、进化特征、蛋白结构及在高温胁迫下的表达模式进行分析。结果表明,大白菜全基因组含有15个TPS基因家族成员,分布于8条染色体上。除BrTPS14和BrTPS15外,其余成员各含有1个TPS和1个TPP结构域,并且所含motif的排列顺序也完全一致。理化性质分析发现,15个成员的氨基酸长度介于129~1459 aa之间,分子量大小在14.73~165.83 kD之间,大部分BrTPS蛋白为酸性蛋白和亲水蛋白,以无规则卷曲作为二级结构主要构成元件。进化分析表明,大白菜TPS基因家族成员可分为2类,其中ClassⅠ包含5个成员,ClassⅡ包含10个成员。本研究对高温胁迫前后不同组织和持续高温胁迫下叶片中的表达分析,发现大部分的BrTPS基因可对高温胁迫产生响应,但在表达规律上存在差异。这些研究结果为后续研究大白菜TPS基因提供一定参考。     

低温胁迫和赤霉素对花生种子萌发和幼苗生理响应的影响

低温是影响我国广大花生产区春花生发芽的主要因素之一。本文以不同生态区的30个花生品种为实验材料,研究了倒春寒天气诱导的低温胁迫对花生出苗的影响,以出苗率为标准筛选出4个耐低温的花生品种(阜花17、阜花12、冀花16、冀花18)和4个不耐低温的品种(鲁花11、白沙1016、正农黑花生1号、白玉)于温室测定了4℃低温和赤霉素(GA_3)处理后种子发芽相关指标和幼苗生理指标。结果表明, 4℃对耐低温花生品种发芽率、发芽指数影响不显著,但种子活力指数和芽长呈现下降趋势;4℃处理后,不耐低温品种幼苗相对膜透性和MDA含量上升幅度更高,耐低温品种幼苗的可溶性糖和游离脯氨酸含量上升幅度更大。GA_3显著促进4℃低温处理后花生种子萌发和种子活力,抑制了花生幼苗在低温处理后相对膜透性和丙二醛的上升,提高了可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸含量。研究表明,赤霉素促进低温胁迫下种子萌发和幼苗生长的最佳浓度是300μmol L~(–1)。发芽率与相对膜透性和丙二醛含量显著负相关,与可溶性糖、脯氨酸含量显著正相关。温度影响发芽率的品种间差异较大,常温下赤霉素对不同耐低温品种的发芽率影响较小。本研究为耐低温花生种质资源创新和新品种培育提供了理论依据,为研究赤霉素对不同花生品种耐低温性影响的生理机制提供了基础。     

低温对蒙古口蘑菌丝体漆酶活性及其基因家族表达的影响

蒙古口蘑是内蒙古草原久负盛名的野生食用菌。为实现其人工栽培,本文以蒙古口蘑次生菌丝体为实验材料,利用实时荧光定量PCR技术,研究了低温对蒙古口蘑漆酶活性及其基因家族转录水平的影响。结果表明：蒙古口蘑次生菌丝体漆酶活性普遍较高;随着培养时间的延长,漆酶活性普遍降低;低温刺激可不同程度地影响蒙古口蘑漆酶基因家族的转录,10℃处理菌丝体10天,可显著提高蒙古口蘑漆酶基因的表达水平,主要贡献是lacc1、lacc4、lacc8、lacc10、lacc11。结果可为日后实现蒙古口蘑人工栽培积累资料。     

冬小麦叶片对低温胁迫的生理响应

以抗寒性不同的冬小麦品种(米808、冬引0801、小黑麦、冬麦9625、冬麦138)为试验材料,测定各材料在不同温度(13,7,4,-18,-21℃)下处理2h后叶片的相对电导率、叶片中丙二醛(MDA)、可溶性蛋白质、脯氨酸、可溶性糖含量和超氧化歧化酶的活性(SOD).结果表明,随着温度降低(4℃→-18℃→-21℃),小麦叶片中MDA、可溶性糖含量逐渐增加.小麦叶片SOD总活力随胁迫温度降低先升高后降低再升高.经低温胁迫后,小麦叶片可溶性蛋白质含量无明显变化.米808、冬引0801在-21℃胁迫下,相对电导率变化率最低.米808、冬引0801在-18℃→-21℃时,MDA含量增幅较大;米808 SOD总活力在-18、-21℃时变化率最低.冬引0801脯氨酸和可溶性糖的变化率均在21℃时最大.     

辣椒MIKC型MADS-box基因家族鉴定及胁迫响应

MADS-box家族在花的诱导和发育中作用广泛,有些基因在明显不相关的发育阶段具有多种功能。本研究通过生物信息学对辣椒MIKC型MADS-box家族系统发育树、保守结构、基因特征、GO和KEGG富集分析、时空表达等进行系统分析。在辣椒中共鉴定到25条MIKC＿MADS基因,均具有MIKC＿MADS的N端SRF-TF和C端K-box保守结构域,氨基酸数为122～278 aa,为两性亲水性蛋白。Motif分析发现,25条CaMADS-box基因均含有Motif1、Motif2、Motif4共3个保守基序。染色体定位发现,25条基因不均匀地分布在12条染色体上,其中染色体Chr02定位基因最多,共计5条基因。共线性分析发现MIKC＿MADS在野生种Chiltepin中存在多个共线性区块。GO富集分析发现,MIKC＿MADS主要参与植物生长初期发育过程,主要是花器官、胚乳发育过程,KEGG富集到甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢(ko00260),乙醛酸盐和二羧酸盐代谢(ko00630),碳代谢(ko01200)。顺式作用元件发现,与光响应元件、水杨酸、胚乳等元件相关。在时空表达过程中,MIKC＿MA...     

以分子标记辅助连续回交快速提高花生品种油酸含量及对其后代农艺性状的评价

高油酸是花生重要的品质性状,高油酸花生及其制品具有较好的品质稳定性和较高的营养和保健价值。我国高油酸花生的育成品种类型较少,遗传背景不够丰富,育种手段比较单一。针对上述问题,本研究开发了AS-PCR-MP高油酸分子标记检测方法,优化了KASP分子标记检测体系,利用分子标记辅助连续回交,结合近红外品质快速检测技术及南繁加代技术,以河南省大面积推广的豫花15、远杂9102、豫花9327、豫花9326四个不同类型品种为轮回亲本, 5年内连续回交4代、自交4代,定向获得了4个轮回亲本遗传背景的BC4F4和BC4F5稳定高油酸改良材料24个。调查分析了BC4F4和BC4F5单株的13个农艺性状与轮回亲本的相似度,并利用轮回亲本与非轮回亲本之间的差异SNP的KASP分子标记进行了BC4F4和BC4F5株系的轮回亲本遗传背景检测。结果表明,轮回亲本的遗传背景在BC4F5的比例为79.49%～92.31%。本研究为快速高效改良花生油酸含量探索了新的方法,获得的新品系拓展了高油酸花生的遗传背景,获得的一系列近等基因系可作为遗传研究材料进一步加以利用。     

CRISPR-Cas9系统敲除亚麻FAD2基因表达载体的构建

CRISPR/Cas9系统是一种新型基因编辑工具,准确编辑目标基因,广泛应用于动植物的基因编辑中。本实验构建了油用亚麻品种‘陇亚10号’FAD2基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体,以CRISPR/Cas9基因编辑技术为切入点,根据Gene Bank中公布的FAD2基因序列(DQ222824.1)在FAD2基因外显子部分运用sg RNA在线设计软件CRISPR-P 2.0对亚麻FAD2基因做脱靶分析,在外显子区域选取2个片段作为靶序列进行敲除。以潮霉素作为筛选标记,采用Golden Gate cloning法构建针对‘陇亚10号’FAD2基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体,命名为p YLCRISPR/Cas9-FAD2。将pYLCRISPR/Cas9-FAD2载体导入农杆菌并检测其稳定性,保存菌种以便后期利用农杆菌介导法转化‘陇亚10号’,为深入研究亚麻FAD2基因的功能提供参考。     

Construction of RNAi Vector of Cotton (Gossypium hirsutum L.) FAD2-1 Gene and Acquisition of New High Oleic Acid Germplasm

[Objective] Here, the aim was to create a new cotton (Gossypium hirsutum L.) germplasm with high oleic acid and low linoleic acid contents without affecting the fiber yield and quality. [Method] The fatty acid desaturation 2-1 (FAD2-1) gene catalyzes the formation of polyunsaturated linoleic acid from monounsaturated fatty acid in cotton. The protein’s properties, structure and functions were analyzed using the information analysis method. A conserved 381-bp fragment of GhFAD2-1 was cloned to construct an RNA interference vector, which was transformed into cotton by Agrobacterium-mediated hypocotyl infection. The fatty acid compositions and contents of T₂―T₄ transgenic plants were determined using gas chromatography-mass spectrometry. The T₄ transgenic lines were used to investigate the copy number, target gene expression, agronomic traits, and fiber quality. [Results] The RNA interference vector of GhFAD2-1 was successfully constructed and transformed into cotton. The target gene’s expression level was significantly lower in transgenic plants than in controls. The transgenic plants had high oleic acid and low linoleic acid contents, which could be stably inherited by the offspring. The oleic acid contents of transgenic cotton seeds increased by 224.1%, and the linoleic acid content decreased by 237.5%, compared with the control seeds. There were no significant differences in the agronomic traits and fiber quality of the transgenic lines compared with the control. [Conclusion] These results verified the function of GhFAD2-1 in cotton and provide a basis for breeding cotton varieties with high oleic acid contents.     

红果醋栗RrFAD2基因的克隆与表达分析

本研究克隆到红果醋栗(Ribes rubrum L.)脂肪酸脱氢酶2(co-3 fatty acid desaturase,FAD2)基因cDNA全长序列,命名为RrFAD2,GenBank登录号为MT795718。RrFAD2全长1470 bp,开放阅读框序列全长1152bp,编码383个氨基酸。生物信息学分析表明,RrFAD2蛋白具有6个跨膜结构域,分子量为43.92 kD,等电点为8.93。利用荧光定量PCR分析RrFAD2基因在红果醋栗不同组织和种子发育中的表达。结果表明该基因在根、茎、叶、花、果实、种子中都表达,在种子中表达量最高,花和根中最低,具有组织特异性。在种子发育过程中,RrFAD2基因的表达先上升后下降,而种子成熟的晚期(花后80 d左右)表达量达到最高。该研究为解析红果醋栗RrFAD2基因功能和研究醋栗不饱和脂肪酸合成提供理论参考。     

六个甘蓝型油菜油酸脱氢酶（FAD2）假基因的克隆和分析

以甘蓝型油菜湘油15为材料,采用PCR方法克隆并分析了56个FAD2基因克隆和47个FAD2基因cDNA克隆,从中发现6个新的FAD2基因拷贝。它们与公布的甘蓝型油菜FAD2基因(AY577313)具有87%以上的同源性,没有内含子,在开放阅读框中存在1~12个终止密码子,其中有2个拷贝具有转录功能。将这6个FAD2基因拷贝在酿酒酵母中进行体内表达实验,通过气相色谱检测脂肪酸组成证明其不具备油酸脱氢酶功能,与对照相比,也没有改变酵母体内脂肪酸组成。由此推测这6个FAD2基因拷贝为假基因。     

三个耐冻性不同的马铃薯野生种中FAD2基因的克隆及表达分析

以3个耐冻性和冷驯化能力不同的马铃薯野生种Solanum commersonii、S.acaule和S.cardiophyllum为材料,利用RT-PCR技术克隆出不饱和脂肪酸合成途径中的关键酶基因ω-6脱氢酶基因(FAD2),分别命名为Cmm-FAD2(GenBank登录号为KF214782)、Aca-FAD2(KF214781)和Cph-FAD2(KF214783)。序列分析表明,该基因在3个马铃薯野生种中核苷酸长度都为1326 bp,编码441个氨基酸残基。3个野生种FAD2基因核苷酸序列和蛋白序列比对结果表明,在18个位点的差异核苷酸中有8个位点的差异导致对应的氨基酸残基变化,其中第11和第44氨基酸残基处,耐冻且有冷驯化能力的S.commersonii和S.acaule有相同的氨基酸,而冷冻敏感S.cardiophyllum的氨基酸却不同。二级结构预测结果表明S.commersonii和S.acaule的FAD2蛋白与S.cardiophyllum FAD2蛋白的α-螺旋、延伸链和随机卷曲存在明显差异。蛋白多序列比对和进化树分析表明,3个马铃薯野生种的FAD2基因与番茄的亲缘关系最近,其次是与马齿笕。qPCR分析表明,12 d冷驯化使FAD2基因在3个马铃薯野生种中都上调表达,S.commersonii和S.acaule的FAD2基因表达水平均高于S.cardiophyllum,且差异显著。     

猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2的克隆表达

为了研究不同时间段细胞MHC分子表达的变化情况,从分子水平上说明E2基因与NHC之间的关系,本研究克隆了中国猪瘟病毒强毒石门毒株E2基因,构建了pcDNA3.0真核表达质粒P-E2基因。限制性内切酶进行双酶切和序列分析鉴定E2基因插入位置、方向和读码框架的正确性。构建成功的真核表达质粒P-E2,用脂质体转染方法瞬时转染进行体外细胞表达,转染后24,48 h后用Western-blot和间接免疫荧光技术检测P-E2基因质粒在PK-15细胞内的表达情况。结果表明：用His抗体进行间接免疫荧光检测发现E2基因得到表达,并定位于细胞浆,同时Western-blot检测后发现重组质粒P-E2转染后也在PK-15细胞中得到了表达。为进一步研究猪瘟病毒与宿主细胞之间的关系,病毒的致病机理提供了基础材料。     

海岛棉5个CBF/DREB基因的克隆与表达分析

低温、干旱和盐渍是影响作物生长、产量和全球地理分布的重要非生物胁迫。CBF/DREB转录因子是参与植物非生物胁迫应答反应的重要调控蛋白。为了更好地了解棉花CBF家族基因,通过生物信息学的方法,从海岛棉中克隆了5个具有完整开放阅读框的CBF基因,命名为Gb CBF1―Gb CBF5。这5个基因编码的蛋白与其他植物冷胁迫相关的CBF蛋白具有高度的保守性,含有1个AP2功能结构域和2个特征基序。系统进化树分析表明,这5个基因与拟南芥的3个参与冷胁迫的CBF基因一起聚类在DREB亚家族中的A-1亚组。通过RT-PCR的方法分析了海岛棉基因Gb CBF1―5在高盐(200 mmol·L-1 Na Cl)、干旱、4℃低温等非生物胁迫处理下的表达模式。结果表明其中2个基因在冷胁迫下上调表达,5个基因在干旱和盐处理下均下调表达。这些为进一步探索CBF基因在棉花逆境胁迫应激反应中的作用提供了有价值的信息。